AN3 蛋白质复合物及其在植物生长促进中的用途 本发明涉及基于 AN3 的蛋白质复合物。本发明还涉及所述复合物在促进植物生长 中的用途， 及通过过表达复合物的至少 2 个成员刺激复合物形成的方法。
对更多植物衍生产品的需求急剧增加。在不远的将来， 农业将面临的挑战是以可 持续发展的方式满足不断增长的对饲料和食物的需求。此外， 植物开始发挥作为能量来源 的重要作用。为了应对这些主要的挑战， 必须在植物产量方面取得重大增长。生物质生产 是一种多因子系统， 其中将过剩的过程 (process) 提供给分生组织活性以得到新的细胞、 组织和器官。尽管目前正在进行大量有关产量表现的研究， 对支持产量的分子网络所知甚 少 (Van Camp， 2005)。在拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中描述了许多基因， 当其被突变 或异位表达时导致较大结构的形成， 例如叶或根。这些所谓的 “内在产量基因” 涉及许多不 同的过程， 这些过程之间的相互关系大部分未知。
在寻找 GRF( 生长调节因子 ) 相互作用因子 (interactor)(Kim 和 Kende， 2004) 的 过程中， 通过窄叶拟南芥突变体分析 (Horiguchi 等人， 2005) 中鉴定出这些 “内在产量基 因” 之一的 AN3( 又称为 GIF1)。AN3 为人 SYT( 滑膜肉瘤易位 ) 蛋白质的同系物， 由拟南芥 基因组中的小基因家族编码。 SYT 为转录辅激活因子， 除了涉及在肿瘤发生中的染色体易位 外， 仍然不清楚其生物学功能 (Clark 等人， 1994 ； de Bruijn 等人， 1996)。 使用酵母 GAL4 系 统， AN3 显示具有反式激活活性 (Kim 和 Kende， 2004)。这与酵母双杂交和体外结合试验一 起证明 AN3 与几种 GRF 的相互作用 (Kim 和 Kende， 2004 ； Horiguchi 等人， 2005)， 提示 AN3 作为 GRF 的转录辅激活因子的作用。GRF( 生长调节因子 ) 基因存在于迄今为止检查的所 有种子植物的基因组中并编码推定的在叶的生长和发育中起调节作用的转录因子 (Kim 等 人， 2003)。证实 GRF 和 AN3 转录激活子和辅激活因子复合物的是， grf 和 an3 突变体展示了 相似的表型， grf 和 an3 突变的组合显示了协同效应 (Kim 和 Kende， 2004)。研究显示 an3 突变的窄叶表型为细胞数减少的结果。 此外， AN3 的异位表达导致具有更多细胞的较大叶转 基因植物， 表明 AN3 同时控制细胞数和器官大小 (Horiguchi 等人， 2005)。尽管不知道 AN3 在植物生长调节中的功能， 这些结果显示 AN3 满足 “内在产量基因” 的要求。
为了破译支持产量提高机制的分子网络， 采用以全基因组蛋白质为中心的方法在 拟南芥细胞悬浮培养物中研究 AN3 的相互作用蛋白。串联亲和纯化 (TAP) 技术和基于质谱 (MS) 的蛋白质鉴定相组合， 分离并鉴定了 25 个可能作用于植物生长调节的 AN3 相互作用 蛋白 ( 表 2)。令人吃惊的， 我们分离到几种属于多蛋白复合物的蛋白质。此外， 许多相互 作用因子完全没有被表征过。对少量 AN3 相互作用因子的报导显示它们涉及几种发育过程 (Wagner & Meyerowitz， 2002 ； Meagher 等人， 2005 ； Sarnowski 等人， 2005 ； Hurtado 等人， 2006 ； Kwon 等人， 2006)， 但迄今为止鉴定的基因中没有一个与刺激植物生长相关。
本 发 明 的 一 个 方 面 为 分 离 的 基 于 AN3 的 蛋 白 质 复 合 物， 其至少包含蛋白质 AN3p 和 一 种 或 多 种 选 自 由 AT4G16143， AT1G09270， AT3G06720， AT5G53480， AT3G60830， AT1G18450 ， AT2G46020 ， AT2G28290 ， AT1G21700 ， AT5G14170 ， AT4G17330 ， AT4G27550 ， AT1G65980， AT5G55210， AT3G15000， AT4G 35550， AT1G20670， AT1G08730， AT5G13030， AT2G18876， AT5G17510， AT1G05370， AT4G21540， AT1G23900 和 AT5G23690( 基 因 列 于 表
II) 编码的蛋白质。优选的， 所述基于 AN3 的蛋白质复合物至少包含蛋白质 AN3p 和一种 或 多 种 选 自 ARP4(AT1G18450)， ARP7(AT3G60830)， SNF2(AT2G46020)， SYD(AT2G28290)， SWI3C(AT1G21700) 和 SWP73B(AT5G14170) 的蛋白质。更优选的， 所述基于 AN3 的蛋白质复 合物至少包含 AN3p， 选自 ARP4 和 ARP7 的肌动蛋白相关蛋白， 选自 SNF2(BRM) 和 SYD 的 ATP 酶和含有 SWIRM 结构域的蛋白质。优选的， 所述含有 SWIRM 结构域的蛋白质为 SWI3C。如 此处使用的基于 AN3 的蛋白质复合物指 AN3p 直接或间接的与复合物的其他蛋白质相互作 用。直接的相互作用指这样的相互作用， 其中 AN3p 的至少一个结构域与相互作用对象的一 个或多个结构域相互作用。间接的相互作用指这样的相互作用， 其中 AN3p 不通过其结构域 之一与相互作用蛋白相互作用， 但所述相互作用蛋白与和 AN3p 直接或间接相互作用的蛋 白质相互作用。
本发明的另一个方面是根据本发明的蛋白质复合物在促进植物生长中的用途。 优选的， 所述用途为蛋白质复合物的过表达， 通过过表达蛋白质复合物的至少 2 个成员进 行。 如此处使用的植物生长的促进， 指与未使用复合物的相同植物相比， 在相同条件生长下 ( 除了使用复合物所需的条件， 如果有的话 )， 使用蛋白质复合物的植物中的植物生物质的 增加。作为非限制性示例， 这些条件可能为加入一种或几种化合物以诱导编码复合物蛋白 质的一种或多种基因的一种或多种启动子。 可选的， 相同的植物为未转化的亲本植物， 与使 用复合物的转化植物在相同的条件下生长。优选的， 植物生长的促进导致提高的产量。此 产量可为植物生物质的总体提高或例如但不限于种子产量、 叶产量或根产量的产量的部分 提高。 本发明的另一个方面是通过同时过表达复合物的至少 2 种蛋白质促进基于 AN3 的 蛋白质复合物形成的方法。除了 AN3p 自身以外的复合物蛋白质列于表 I I。优选的， 所述 过表达为 AN3p 和一种或多种选自 ARP4(AT1G18450)， ARP7(AT3G60830)， SNF2(AT2G46020)， SYD(AT2G28290)， SWI3C(AT1G21700) 和 SWP73B(AT5G14170) 的蛋白质的过表达。 更优选的， 所述过表达为至少 AN3p， 选自 ARP4 和 ARP7 的肌动蛋白相关蛋白质， 选自 SNF2(BRM) 和 SYD 的 ATP 酶和含有 SWIRM 结构域的蛋白质的过表达。优选的， 所述含有 SWIRM 结构域的蛋白 质为 SWI3C。
获得过表达的方法是本领域技术人员已知的， 包含但不限于将待过表达的编码蛋 白质的基因置于强启动子例如花椰菜花叶病毒 35S 启动子之后。如此处使用的同时过表达 指所有待过表达的蛋白质在时间表上有重叠， 由此当与未过表达对照相比时， 所述蛋白质 水平提高。不一定指所有基因应当同时被诱导。取决于信使 RNA 和 / 或蛋白质的周转， 一 种基因可在另一种基因被诱导之前或之后被诱导， 只要两种蛋白质以高于普通 ( 未过表达 的 ) 浓度的浓度在重叠的时间中存在。
附图简述
图 1. 在转基因细胞悬浮培养物中， GS- 标记的 GFP 和 AN3 的表达分析
培养 2 天的野生型与 N- 和 C- 端 GS 标记的 GFP 和 AN3 过表达培养物的总蛋白提 取物 (60μg) 通过 12％ SDS-PAGE 分离并进行免疫印迹。为检测 GS 标记的蛋白质， 印迹与 人血浆孵育， 之后与偶联辣根过氧化物酶的抗人 IgG 孵育。通过化学发光检测显影蛋白质 凝胶印迹。预期的 GS- 标记的 GFP 和 AN3 的重组分子量分别为 52.8kDa 和 43.5kDa( 用黑 点指示 )。
图 2.TAP 蛋白质洗脱液的分析
从转基因植物细胞悬浮培养物中纯化 GS 标记的蛋白质复合物， 用 TCA(25％， v/v) 沉淀， 在 4-12％ NuPAGE 凝胶中分离， 并用胶体考马斯 G-250 染色显像。用点指示诱饵蛋白 质。 实施例 实施例的材料和方法
载体构建
将 N- 和 C- 端 GS 标记的 GFP 和 AN3 置于 35S(CaMV) 启动子的控制下的构建通过 多位点 Gateway LR 反应进行。通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增不含 (-) 或含 (+) 终止密 码子的编码区并克隆至 Gateway pDONR221 载体 (Invitrogen)， 得到 pEntryL1L2-GFP(-)， pEntryL1L2-GFP(+)， pEntryL1L2-AN3(-) 和 pEntryL1L2-AN3(+)。含有 Pro35S ： GFP-GS- 和 Pro35S ： AN3-GS- 的 植 物 转 化 载 体 分 别 通 过 pEntryL4R1-Pro35S， pEntryL1L2-GFP(-) 或 pEntryL1L2-AN3(-)， 和 pEntryR2L3-GS 和 目 的 载 体 pKCTAP 之 间 的 多 位 点 Gateway LR 反 应 得 到 (Van Leene 等 人， 2007)。 为 得 到 Pro35S ： GS-GFP 和 Pro35S ： GS-AN3 载 体， 在 pEntryL4L3-Pro35S 和 pEntryL1L2-GFP(+) 或 pEntryL1L2-AN3(+) 和 pKNGSTAP 间进行多位 点 Gateway LR 重组。
所有输入和目的载体经序列分析检查。 将表达载体通过电穿孔转化至根癌土壤杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌株 C58C1RifR(pMP90)。转化的细菌在含有 100μg/mL 利福平， 40μg/mL 庆大霉素和 100μg/mL 壮观霉素的酵母提取物肉汤平板上进行选择。
细胞悬浮培养
野生型和转基因拟南芥细胞悬浮 PSB-D 培养物在 50mL MSMO 培养基 (4.43g/L MSMO， Sigma-Aldrich)， 30g/L 蔗糖， 0.5mg/L NAA， 0.05mg/L 激动素， pH 5.7( 用 1M KOH 调 节 ) 中于 25℃黑暗中通过温和搅拌维持 (130rpm)。 每 7 天将细胞在新鲜的培养基中以 1/10 稀释进行继代培养。
细胞培养物转化
按前述 (Van Leene 等人， 2007) 通过土壤杆菌共培养转化拟南芥培养物。在 YEB 中指数生长的土壤杆菌培养物 (OD600 在 1.0 和 1.5 之间 ) 通过离心 (5000rpm 10min) 用等 体积 MSMO 培养基洗 3 次并重悬于细胞悬浮生长培养基直到 OD600 为 1.0。继代培养 2 天后， 3mL 悬浮培养物与 200μL 洗过的土壤杆菌和 200μM 乙酰丁香酮 (acetoseringone) 在黑暗 中于 25℃孵育 48h， 并温和搅拌 (130rpm)。共培养 2 天后， 在细胞培养物中加入 7mL 含有 3 种抗生素混合物 (25μg/mL 卡那霉素， 500μg/mL 羧苄青霉素 (carbenicellin)， 和 500μg/ mL 万古霉素 ) 的 MSMO 并在标准条件下 (25℃， 130rpm 和持续黑暗 ) 进一步悬浮培养。在共 培养后 11 和 18 天分别通过 1 ∶ 5 和 1 ∶ 10 比率在含有抗生素混合物的 50mL 新鲜 MSMO 培养基中连续稀释选择稳定的转基因培养物。反选择细菌之后， 在 50mL 包含 25μg/mL 卡 那霉素的 MSMO 中每周一次进一步继代培养转基因植物细胞 2 周。之后细胞在新鲜的培养 基中以 1/10 稀释每周一次继代培养。
细胞悬浮培养物的表达分析
在从继代培养 2 天后收获的指数生长的细胞中得到的总蛋白质提取物中分析转
基因的表达。 等量的总蛋白质在 12％ SDS-PAGE 凝胶中分离并将印迹转移至 Immobilon-P 膜 (Millipore， Bedford， MA)。蛋白质凝胶印迹在溶于 20mM Tris-HCl， pH 7.4， 150mM NaCl， 和 0.1％ Triton X-100 的 3％脱脂奶中封闭。为检测 GS 标记的蛋白质， 将印迹与人血浆孵 育， 之后与偶联辣根过氧化物酶 (HRP ； GE-Healthcare) 的抗人 IgG 孵育。通过化学发光检 测 (Perkin Elmer， Norwalk， CT) 显影蛋白质凝胶印迹。
蛋白提取物的制备
在 液 氮 中 将 细 胞 材 料 (15g) 研 磨 均 匀。 在 等 体 积 (w/v) 提 取 缓 冲 液 (25mM Tris-HCl， pH 7.6， 15mM MgCl2， 5mM EGTA， 150mM NaCl， 15mM 对硝基磷酸苯酯， 60mMβ 甘油磷 酸， 0.1％ (v/v)Nonidet P-40(NP-40)， 0.1mM 钒酸钠， 1mM NaF， 1mM DTT， 1mM PMSF， 10μg/ mL 亮抑酶肽， 10μg/mL 抑肽酶， 5μg/mL 抗蛋白酶， 5μg/mL 胰凝乳蛋白酶抑制剂， 5μg/mL 胃蛋白酶抑制剂， 10μg/mL 大豆胰酶抑制剂， 0.1mM 苄脒， 1μM 反 - 环氧丁二酰基 -L- 亮氨 酰胺基 (4- 胍基 ) 丁烷 (E64)， 5％ (v/v) 乙二醇 ) 中在 4℃使用 Ultfa-Turrax T25 搅拌器 (IKA Works， Wilmington， NC) 制备粗蛋白提取物。 通过 36900g 20min 和 178000g 45min 在 4℃的两步离心得到可溶性蛋白部分。将提取物通过 0.45μm 滤器 (Alltech， Deerfield， IL)， 用蛋白质分析试剂盒 (Bio-Rad， Hercules， CA) 测定蛋白质含量。 串联亲和纯化
如 Bürckstümmer 等人 (2006) 描述的进行纯化， 稍加修饰。简言之， 200mg 总蛋白 提取物与 100μL 用 3mL 提取缓冲液预平衡的 IgG 琼脂糖 6 快流速微珠 (GE-Healthcare， Little Chalfont， UK) 于 4℃在缓慢旋转下孵育 1 小时。将 IgG 琼脂糖凝胶微珠转移至 1mL Mobicol 柱 (MoBiTec， Goettingen， Germany) 并用 10mL IgG 清洗缓冲液 (10mM Tris-HCl， pH 8.0， 150mM NaCl， 0.1％ NP-40， 5％乙二醇 ) 和 5mL 烟草 (Nicotiana tabacum L.) 蚀纹 病毒 (TEV) 缓冲液 (10mM Tris-HCl， pH 8.0， 150mM NaCl， 0.1％ (v/v)NP-40， 0.5mM EDTA， 1mM PMSF， 1μM E64， 5％ (v/v) 乙二醇 ) 清洗。经 AcTEV 消化 (2x 100U， Invitrogen) 洗 脱结合的复合物， 16℃ 1h。洗脱的 IgG 部分与 100μL 用 3mL TEV 缓冲液预平衡的链霉抗 生物素树脂 (Stratagene， La Jolla， CA) 于 4℃在缓慢旋转下孵育 1 小时。将链霉抗生物 素树脂装进 Mobicol 柱， 用 10mL TEV 缓冲液清洗。用 1mL 链霉抗生物素洗脱缓冲液 (10mM Tris-HCl， pH 8.0， 150mM NaCl， 0.1％ (v/v)NP-40， 0.5mM EDTA， 1mM PMSF， 1μM E64， 5％ (v/v) 乙二醇， 20mM 脱硫生物素 ) 洗脱结合的复合物， 用 TCA(25％ v/v) 沉淀。蛋白质沉淀 用冰冷的含 50mM HCl 的丙酮清洗 2 次， 重新溶解于样品缓冲液并在 4-12％梯度 NuPAGE 凝 胶 (Invitrogen) 中分离。用胶体考马斯亮蓝染色显像蛋白质。
蛋白质水解和肽分离
脱色后， 在水中清洗凝胶片 1 小时， 在 25mL 溶于 50mM NH4HCO3 的 6,66mM DTT 中还 原多肽二硫键 40min， 之后在 25mL 55mM 溶于 50mM NH4HCO3 的 IAM 中烷基化硫醇基 30min。 用水清洗凝胶片 3 次后， 将蛋白质凝胶的完整泳道切成薄片， 用微滴定板收集， 并基本上按 稍加修饰的前述方法处理 (Van Leene 等人， 2007)。每个微滴定板的孔中， 脱水的凝胶颗粒 在含有 250ng 胰酶 (MS Gold ； Promega， Madison， WI)， 50mM NH4HCO3 和 10％ CH3CN(v/v) 的 20μL 消化缓冲液中于 4℃再水化 30min。在加入 10μL 含有 50mMNH4HCO3 和 10％ CH3CN(v/ v) 的缓冲液之后， 在 37℃消化蛋白质 3 小时。得到的肽用微柱固相吸头 (PerfectPureTM C18 吸头， 200nL 柱床体积 ； Eppendorf， Hamburg， Germany) 浓缩和脱盐， 用 1.2μL 用 α- 氰
基 -4- 羟 基 肉 桂 酸 饱 和 的 50 ％ CH3CN ： 0.1 ％ CF3COOH 溶 液 将 肽 直 接 洗 脱 至 MALDI 靶 板 TM (Opti-TOF 384 Well Ins ert ； Applied Biosystems， Foster City， CA)， 并用 20fmole/μL Glu1 血纤维蛋白肽 B(Sigma-Aldrich)， 20fmole/μLdes-Pro2-Bradykinin(Sigma-Aldric h)， 和 20fmole/μL 促肾上腺皮质激素片段 18-39 人 (Sigma-Aldrich) 进行加标 (spike)。
质谱检测
使 用 MALDI 串 联 MS 仪 器 (4800Proteomics Analyzer ； AppliedBiosystems) 获 取肽质量指纹和选定肽的 1kV CID 碎片谱。基本上使用如 Van Leene 等人 (2007) 中提出 的设置获得肽质谱和肽序列谱。根据制造商的说明书校准各 MALDI 板。所有肽质量指纹 (PMF) 谱用 m/z 963.516(des-Pro2-Bradykinin)， m/z 1570.677(Glu1- 血纤维蛋白肽 B)， and m/z2465， 198( 促肾上腺皮质激素片段 18-39) 的 3 个内部标准物进行内部校准， 对分析 的 MALDI 靶上的各个分析的肽点得到 5ppm±10ppm 的平均质量精度。使用个体 PMF 谱， 将 信噪比超过 20 的多达 16 种肽通过质量排除滤器后用于碎片分析。
基于 MS 的蛋白质同源性鉴定
使用随附的套装软件 (GPS Explorer 3.6， Applied Biosystems) 使用基本上如 Van Leene 等人 (2007) 描述的参数设置处理各个样品的 PMF 谱和肽序列谱。 生成数据检索 文件并通过本地数据库搜索引擎 (Mascot 2.1， MatrixScience) 进行蛋白质同源性鉴定。 从 9 个公共数据库收集得到称为 SNAPS 拟南芥版本 0.4(SNAPS ＝蛋白质序列的简单非冗余 集合 (SimpleNonredundantAssembly of Protein Sequences)， 77488 序列条目 (entry)， 30468560 残基 ； 在 http://www.ptools.ua.ac.be/snaps 可获得 ) 的内部非冗余拟南芥蛋 白质数据库。保留相对得分超过 95％概率的最高击中 (top hit)( 一级 ) 的蛋白质同源性 鉴定。当得分超过 98％概率阈值时保留额外的阳性鉴定 ( 二级或更高 )。
实施例 1 ： GS 标记的 GFP 和 AN3 过表达细胞系的表达分析。
在进行 TAP 纯化前， 在转基因的蛋白质表达水平筛选稳定转化的细胞悬浮培养 物。来自野生型 (PSB-D) 培养物和 GS-GFP， GFP-GS， GS-AN3 和 AN3-GS 过表达细胞系的等量 总蛋白提取物的蛋白质凝胶印迹显示了 GS 标记蛋白质的明显表达 ( 图 1)。
实施例 2 ： 野生型和 GST 标记的 GFP 过表达培养物的 TAP 纯化。
尽管在 TAP 纯化中进行了 2 次连续的纯化步骤， 仍存在由于非特异性结合共纯化 的背景蛋白质的问题。通过对野生型和过表达 N- 和 C- 端 GS 标记的核定位绿色荧光蛋白 (GFP) 的转基因培养物的纯化测定了由于实验背景造成的污染蛋白质。非特异性共纯化的 蛋白质经沉淀、 在凝胶中分离、 染色 ( 图 2)、 胰酶消化和经 MALDI-TOF/TOF 明确鉴定。大多 数污染物为高丰度蛋白质， 例如分子伴侣、 细胞骨架蛋白、 核糖体蛋白、 代谢酶或蛋白质翻 译因子 ( 表 1)。 发现了与其他植物蛋白质 - 蛋白质相互作用研究中的常见污染物相同或相 似的蛋白质 (Rohila 等人， 2006 ； Van Leene 等人， 2007)。
实施例 3 ： AN3 相互作用蛋白质的 TAP 分离和 MS 鉴定。
为了鉴定 AN3 的体内相互作用对象， 我们对转基因拟南芥悬浮培养物中处于组成 型 35SCaMV 启动子控制下异位表达的 AN3 的 N- 和 C- 端 GS 融合蛋白进行了串联亲和纯化 (TAP)。对在新鲜的培养基中继代培养 2 天后收集的 AN3-GS 和 GS-AN3 细胞系提取物进行 了 2 次独立的 TAP 纯化。亲和纯化的蛋白质在 4-12％ NuPAGE 凝胶中分离并用考马斯亮蓝 染色。过表达 AN3 的转基因培养物的纯化谱显示于图 2。将蛋白质条带切下来， 在凝胶中用胰酶消化并用于 MALDI-TOF/TOF 质谱以鉴定蛋白质。去除通过实施例 2 中描述的对照纯化 和在其他分析 (GUS 和胞浆 GFP， Van Leene 等人， 2007) 中鉴定的背景蛋白质后， 从得到的 击中列表中我们鉴定出 25 个 AN3 相互作用蛋白 ( 表 2)。这些可分为 2 组 ： 14 个蛋白质经 试验确认， 11 个蛋白质仅在 4 次 TAP 试验中的 1 次中被鉴定。
实施例 4 ： 植物中的 AN3 相互作用 SWI/SNF 染色质重塑复合物的分离和亚基鉴定。
在试验确认的 AN3 相互作用因子中， 6 个蛋白质充当重塑染色质结构的大分子机 器的亚基。数据库调查 (ChromDB， Gendler 等人， 2008) 显示它们均属于 SWI/SNF ATP 酶家 族。 SWI/SNF 染色质重塑 ATP 酶在动植物界中为保守的， 并相应内源和外源信号调节转录程 序。这提示 AN3 的转录活性通过染色质重塑调节。与之一致的， 人 AN3 同系物 SYT 也显示 了与 SWI/SNF 复合物成分 BRM 和 Brg1 有相互作用 (Thaete 等人， 1999 ； Perani 等人， 2003 ； Ishida 等人， 2004)。
尽管在拟南芥中已经研究了几种推定的 SWI/SNF 复合物成分的功能性作用， 迄今 为止没有分离和表征过完整的植物染色质重塑复合物。与 AN3 的共纯化首次证明了体内的 植物 SWI/SNF 复合物的物理组成， 其以前仅基于同源性分析和遗传学解释及体外的相互作 用。 文献概述显示在拟南芥中 SWI/SNF ATP 酶亚基控制多个发育途径。 2 个分离的 ATP 酶 SYD(At2g28290) 和 BRM(SNF2)(At2g46020) 的无效突变体展示了多向性 (pleiotropic) 发育缺陷。2 种突变体均生长缓慢且矮小， 在子叶分离中具有缺陷， 并展示减少的顶端优势 (Wagner & Meyerowitz， 2002 ； Farrona 等人， 2004 ； Hurtado 等人， 2006 ； Kwon 等人， 2006 ； Su 等人， 2006)。 BRM(SNF2) 的无效突变体还具有独特的根生长缺陷并为雄性不育的 (Wagner & Meyerowitz， 2002 ； Hurtado 等人， 2006 ； Kwon 等人， 2006)。核心复合物 Swi3c(At1g21700) 突变体与 brm 突变体极其相似 (Sarnowski 等人， 2005)。附属成分 ARP4 和 ARP7 的突变体 展示了多向性缺陷， 与 syd， brm 和 swi3c 表型的相似较少 (Meagher 等人， 2005)。ARP4 的下 调导致包括植物器官的组织改变、 提前开花、 延迟的花枯萎和部分不育的表型 (Kandasamy 等人， 2005a)。ARP7 击倒 (knockdown) 导致具有小莲座叶、 根生长高度迟缓、 花发育改变和 降低的生育力的矮小植物 (Kandasamy 等人， 2005b)。最后， RNAi 介导的附属 SWI/SNF 复合 物成分 SWP73B(At5g14170) 的沉默导致具有较短根的矮小植物 (Crane & Gelvin， 2007)。
实施例 5 ： AN3 相互作用因子的分离和鉴定
除了 SWI/SNF 染色质重塑复合物亚基以外， 其他所有 19 个鉴定的 AN3 相互作用因 子没有或很少被表征。表 3 给出了它们的 GO 生物学过程和分子功能的概述。
其中 4 个相互作用因子 (At4g16143， At1g09270， At3g06720 和 At5g53480) 涉及核 质运输， 这鉴定了 AN3 为植物核转运蛋白的靶之一。事实上准确的细胞定位对蛋白质功能 是非常重要的， 核定位对转录因子的功能是关键的。 在植物中， 核质运输在不同生物学过程 中起关键作用 (Meier， 2007 ； Xu & Meier， 2008)， 已显示核转运蛋白涉及调节植物发育中的 不同信号转导途径 (Bollman 等人， 2003) 和在植物中对生物 (Palma 等人， 2005) 和非生物 压力 (Verslues 等人， 2006) 的应答。
另一个尚未表征的 AN3 相互作用因子是海藻糖磷酸酶 / 合成酶 4(TPS4)。在植物 中的一些研究暗示海藻糖生物合成在植物生长、 发育和压力耐受中的重要作用 (Grennan， 2007)。在拟南芥 TPS1 的情况中， 敲除突变体展示了胚胎致死表型， 提示此基因在植物发育
中的作用 (Eastmond 等人， 2002)。此外， TPS1 的过表达显示其作为葡萄糖、 脱落酸和压力 信号传导的调节子作用 (Avonce 等人， 2004)。后一个研究和最近的对大米 TPS 在过表达时 触发非生物压力应答基因诱导的分析 (Ge 等人， 2008) 提示 TPS 基因在调节转录信号传导途 径中的可能作用。
其他鉴定的相互作用因子提示 AN3 功能与多个过程的联系。一些研究证明了鞘 氨醇激酶涉及植物细胞信号转导 (Coursol 等人， 2003 ； Coursol 等人， 2005 ； Worral 等人， 2008)， 然而对肌球蛋白同系物 (homologue) 的研究暗示运输蛋白和细胞器在植物发育中 的作用。以后研究这些基因、 其他鉴定的相互作用因子和 AN3 之间的联系将是非常有趣的。
表 1. 在未转化细胞培养物和异位表达核定位 GFP 的培养物的 TAP 试验中共纯化 的蛋白质列表
表 2.MS 鉴定的 AN3 共纯化蛋白列表。最后一列显示了在 4 次独立实验中相互作 用因子被鉴定出的次数。
表 3.
参考文献
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