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1、10申请公布号CN102154307A43申请公布日20110817CN102154307ACN102154307A21申请号201110044022422申请日20110224C12N15/22200601C12N15/70200601C07K14/565200601C07K1/22200601A61K38/21200601A61P31/1220060171申请人南京大学地址210093江苏省南京市鼓楼区汉口路22号72发明人沈萍萍蔡梅红74专利代理机构南京知识律师事务所32207代理人胡锡瑜54发明名称一种重组鸡干扰素的制备方法及其应用57摘要本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种体外。
2、高效制备鸡干扰素的方法及其应用。主要技术方法如下利用PCR的方法从鸡肝基因组中扩增出鸡干扰素基因，将该基因连接到PET28A载体上,构建出重组鸡干扰素成熟蛋白基因重组载体并转入BL21大肠杆菌表达系统。鸡干扰素在大肠杆菌中获得了高效表达，表达的鸡干扰素的包涵体经过高浓度尿素变性后，经NINTA的亲和层析柱纯化，收集洗脱峰并用梯度尿素浓度溶液复性。本发明中的重组鸡干扰素具有很好的抗病毒的生物学活性，且生产成本低，生产效率高，生物活性好，非常适合企业化生产。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列表2页附图1页CN102154308A1/2页21一。
3、种重组鸡干扰素的生产方法，其特征是由以下步骤构成重组载体PET28ACHIFN的构建根据GENBANK上公布的序列，设计一对引物，通过PCR的方法扩增出鸡干扰素成熟蛋白基因；把鸡干扰素成熟蛋白基因的PCR产物酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的PET28A表达载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经ECORI和SALI酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，531BP大小的鸡干扰素成熟蛋白基因核酸条带清晰可见，说明重组PET28ACHIFN载体已经构建成功，重组载体转化BL21菌后，通过IPTG进行诱导表达；大肠杆菌表达的鸡干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性工艺将10。
4、00ML诱导表达菌经8000RPM/MIN10MIN离心后收集的菌体用PH72的PBS洗涤一次，洗涤后离心的菌体用40ML的50MM的TRISHCLPH80,含1MM的EDTA悬起，20作用过夜；次日以450W功率的超声波裂解25MIN3S,3S后，4，2000G/MIN10MIN离心后取上清，再8000RPM离心20MIN后取沉淀，即得重组鸡干扰素包涵体；包涵体用含1TRITONX100的50MM的TRISHCLPH80,含1MM的EDTA溶液洗涤后，再用含2M尿素的50MM的TRISHCLPH80,含1MM的EDTA溶液洗涤，洗涤后的沉淀用含1MMEDTA和10MM的DTT的8M的50MM。
5、的NAH2PO4PH80,03M的NACL，50MM的咪唑溶液4搅拌溶解12H；溶解后的重组鸡干扰素包涵体变性液上清经022UM的滤膜处理后，用含NINTA层析介质的亲和层析柱对其进行亲和纯化；NINTA层析介质装柱后用10个柱体积的亲和层析的平衡液进行平衡，流速控制在每分钟1ML；平衡后在层析介质上轻轻铺上经过洗涤纯化的重组鸡干扰素包涵体变性液，然后加入20个柱体积的亲和层析漂洗液进行漂洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，最后用5个柱体积的洗脱液进行洗脱；收集洗脱峰放入截留分子量为3KD的透析带，以含5M尿素的PBS溶液进行透析，每8H换一次透析液，共透析16H；继而分别以含3M,1M尿素的PBS。
6、溶液进行透析，同样是每8H换一次透析液，不同尿素浓度的透析液各透析16H，最后以PBS溶液透析24H，每8H换一次透析液；透析复性结束后的鸡干扰素溶液用022UM的滤膜后，测定蛋白浓度为026MG/ML,20保存备用，亲和层析的平衡液为含8M尿素的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，50MM的咪唑溶液，漂洗液为含8M尿素的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，100MM的咪唑溶液洗脱液为含8M尿素的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，500MM的咪唑溶液。2权利要求1中所述的重组鸡干扰素的生产方法所构建的重组表达载体PET28ACHIFN。3权利要。
7、求2中所述的重组鸡干扰素的生产方法所构建的重组表达载体PET28ACHIFN的制备方法，其特征是由以下步骤构成鸡干扰素成熟蛋白基因的克隆，含鸡干扰素成熟蛋白基因重组载体的构建与鉴定，含鸡干扰素成熟蛋白基因重组载体在大肠杆菌中的高效表达。4权利要求1中所述的重组鸡干扰素的生产方法生产的鸡干扰素在鸡病毒性疾病药物中的应用。5权利要求1中所述的重组鸡干扰素的生产方法生产的鸡干扰素在制备动物医权利要求书CN102154307ACN102154308A2/2页3学基础研究标准品中的应用。权利要求书CN102154307ACN102154308A1/6页4一种重组鸡干扰素的制备方法及其应用技术领域0001。
8、本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种体外高效制备鸡干扰素的方法及其应用。背景技术0002干扰素是一种重要的I型干扰素，主要是由成纤维细胞和白细胞在病毒核酸、多聚肌苷酸多聚胞苷酸POLYIC等干扰素诱生物质刺激下所分泌的一种糖蛋白。干扰素不仅在抗病毒固有免疫过程中发挥着重要作用，而且具有抗肿瘤、抗增殖和免疫调节等功能。在一些干扰素使用失败的病例（多发性硬化症）或效果欠佳的病例（严重急性呼吸综合症,SARS）中，干扰素能够发挥非常好的效果。0003从干扰素的科研价值和临床应用的价值来推测，鸡干扰素在鸡相关疾病的防制和科研研究中必将会起一定的作用。但是要使鸡干扰素在兽医临床上和基础研究中得到应。
9、用，必须先获得在体外大量生产鸡干扰素的能力。0004目前，在国内，鸡干扰素相关的研究中，鸡干扰素的研究还很少，现有的研究有内蒙古农业大学的关平原教授实验室的银晓博士对鸡干扰素的基因进行了克隆，并采用PGEX2T载体对其进行了融合表达。但是鸡干扰素是一种生物活性物质，融合表达的鸡干扰素其生物活性会受到很大影响。另外，南京农业大学陈伟业博士在CHO细胞中表达了鸡干扰素基因。一般来说，用真核细胞表达的外源蛋白具有生物活性好的优点，但是也存在表达量少的缺点，且研究表明利用真核细胞宿主系统达到鸡干扰素产业化生产，需要企业有严格的细胞培养条件和培养环境，并需要付出昂贵的细胞培养成本，不利于工业化生产。发明。
10、内容0005（一）本发明要解决的技术问题是提供一种可用于工业化生产，生产成本低，生产效率高，可用于动物医学基础研究和临床应用的鸡干扰素的体外制备方法，以弥补目前国内商品化鸡干扰素的空白。0006（二）本发明的技术方案是1鸡干扰素成熟蛋白基因的克隆从国内鸡场购买三黄鸡，取鸡肝的全基因组。以GENBANK上公布的鸡干扰素的基因序列为原始模板，利用分子生物学软件PRIMERPRIMER50设计一对引物，用于扩增出鸡干扰素成熟蛋白基因。00072含有鸡干扰素成熟蛋白基因原核表达载体的构建与鉴定利用PCR的方法扩增的鸡干扰素成熟蛋白基因的前后两端的酶切位点，把鸡干扰素成熟蛋白基因与同样用上述两种限制性内。
11、切酶酶切的PET28A表达载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经酶切后电泳，能获得大小为531BP条带的质粒可以鉴定为已连接上鸡干扰素成熟蛋白基因的重组载体说明书CN102154307ACN102154308A2/6页5PET28ACHIFN。00084含鸡干扰素成熟蛋白基因重组载体是否能在大肠杆菌中表达的鉴定把PET28A载体和PET28ACHIFN重组载体分别转化BL21宿主菌，在IPTG加入后进行诱导，并通过SDSPAGE来鉴定鸡干扰素成熟蛋白基因是否能在大肠杆菌中进行高效表达。00095大肠杆菌表达的鸡干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性工艺的探索对大肠杆菌。
12、表达的鸡干扰素的包涵体用一些去污剂洗涤处理初步纯化后，再用高浓度变性剂的处理，使其溶解在尿素中，然后利用大肠杆菌表达的鸡干扰素末端6个组氨酸的标签，通过NINTA层析柱进行亲和层析纯化，使其浓度进一步提高，达到作为标准品和商品化生产的要求。在此工程中，确定具体的操作条件和溶液6大肠杆菌表达的鸡干扰素生物活性的测定采用国际上通用的微量病变抑制法来测定在大肠杆菌中高效表达后处理之后，是否具有抗病毒的生物学活性。0010本发明中采用的是本实验室从当地三黄鸡中克隆的鸡干扰素成熟蛋白的基因序列如下TGCAACCATCTTCGTCACCAGGATGCCAACTTCTCTTGGAAAAGCCTCCAGCTC。
13、CTTCAGAATACGGCTCCACCTCCACCACAGCCTTGCCCACAACAAGACGTGACTTTTCCATTTCCAGAAACCCTTCTGAAGAGCAAGGACAAGAAGCAAGCAGCCATCACCACCCTCCGCATCCTCCAACACCTCTTCAACATGCTTAGCAGCCCACACACTCCAAAACACTGGATTGACCGCACACGCCACAGCCTCCTCAACCAGATCCAGCATTACATCCATCACCTTGAGCAATGCTTCGTAAACCAAGGCACGCGCTCCCAGAGGCGAGGGCCTCGCAACGCTCACCTCAGCATC。
14、AACAAATACTTCAGATCCATCCACAACTTCCTACAGCACAACAACTACAGTGCTTGTACCTGGGACCATGTCCGCCTCCAGGCTCGTGACTGCTTCCGACACGTGGACACACTCATACAATGGATGAAAAGTCGAGCTCCTCTCACAGCCTCATCCAAACGTCTCAACACCCAGTGA与氨基酸序列如下CYSASNHISLEUARGHISGLNASPALAASNPHESERTRPLYSSERLEUGLNLEULEUGLNASNTHRALAPROPROPROPROGLNPROCYSPROGLNGLNASPVALTHRPHEPROP。
15、HEPROGLUTHRLEULEULYSSERLYSASPLYSLYSGLNALAALAILETHRTHRLEUARGILELEUGLNHISLEUPHEASNMETLEUSERSERPROHISTHRPROLYSHISTRPILEASPARGTHRARGHISSERLEULEUASNGLNILEGLNHISTYRILEHISHISLEUGLUGLNCYSPHEVALASNGLNGLYTHRARGSERGLNARGARGGLYPROARGASNALAHISLEUSERILEASNLYSTYRPHEARGSERILEHISASNPHELEUGLNHISASNASNTYRSERALACYSTHRT。
16、YRASPHISVALARGLEUGLNALAARGASPCYSPHEARGHISVALASPTHRLEUILEGLNTRPMETLYSSERARGALAPROLEUTHRALASERSERLYSARGLEUASNTHRGLN该基因核苷酸序列与GENBANK上登陆的鸡干扰素成熟蛋白基因序列（GENBANK说明书CN102154307ACN102154308A3/6页6AY9740891）的同源性为998，氨基酸同源性为100。该基因与PET28A原核表达载体重组后，在BL21大肠杆菌中获得了高效表达。且本发明中制取的鸡干扰素具有较高的抗VSV病毒增殖的生物活性。0011本发明摸索出一套适用于大。
17、肠杆菌表达的鸡干扰素包涵体的变性、纯化、复性的工艺，通过此工艺流程生产出的鸡干扰素具有抗病毒活性。0012（三）本发明其有益效果是纵观国际鸡干扰素的的市场，目前国外已有商品化的鸡干扰素出售，但是国内市场目前还没有利用中国鸡群的基因生产的商品化的鸡干扰素，这极大限制了相关的基础研究和临床应用步伐。因此总结本发明可以带来如下的有益效果1本发明可以弥补国内商品化鸡干扰素的空白一种生物制品走向商品化必须具备两个基本条件，一个是该生物制品确实有使用价值，第二个是相对于使用对象而言，农户使用该生物制品成本要远低于其出售鸡只带来的纯收益。因此对于鸡用干扰素而言，鉴定其获得生物学效应的前提下，其产量和成本非常。
18、重要。本发明利用廉价的大肠杆菌系统来实现具有生物学活性的鸡干扰素的体外高表达，使该发明具备了其向企业化生产转化的最基本条件。00132本发明可以为鸡病相关的基础医学提供一个标准品作为商品化的标准品除了要求其效用之外，对其纯度也有很高的要求。本发明中利用大肠杆菌生产的鸡干扰素包涵体纯度本身可以达到70以上，加之我们研究出了变性后在NINTA层析柱上直接利用亲和层析的原理进行再纯化的工艺条件，使鸡干扰素的纯度可达90以上。因此本发明中的鸡干扰素能作为动物医学基础研究用的标准品使用。00143本发明可以应用于鸡病的防制目前研究表明干扰素具有抗病毒，调节免疫，抗增殖等生物学活性。我们的研究结果显示本发。
19、明中的鸡干扰素在64倍稀释后能100抑制100TCID50的VSV的增殖，在1024倍稀释后能保护80以上的鸡胚成纤维细胞免受100TCID50的VSV的侵入。这些研究说明该研究生产的鸡干扰素具有很好的抗病毒生物学活性，在鸡病防制上有很大应用前景。00154本发明在生产和使用中无环境污染危险，属于绿色的生物制品，利于环保。0016利用大肠杆菌系统生产鸡干扰素的生产工程中，大肠杆菌是非致病性微生物，不存在散毒的危险。本发明中的鸡干扰素属于基因工程蛋白质，在环境中很容易降解。另外鸡干扰素具有种属特异性，对其他类型的家养动物（猪，牛，羊等等）没有危害。附图说明0017图1鸡干扰素成熟蛋白基因PCR产。
20、物电泳分析M,2000DNA分子量标准，1,鸡干扰素成熟蛋白基因的PCR产物图2PET28ACHIFN阳性克隆载体的酶切鉴定M,2000DNA分子量标准；1，PET28ACHIFN载体经ECORI和SALI酶切图图3转化PET28ACHIFN载体的BL21菌IPTG诱导不同时段的SDSPAGEM,蛋白质分子量标准；1，PET28A转化菌诱导后对照；2，转化PET28ACHIFN载体的BL21菌在诱导1H，2H，3H，4H，5H，6H时的SDSPAGE。说明书CN102154307ACN102154308A4/6页7具体实施方式00181鸡干扰素成熟蛋白基因的克隆鸡肝基因组的提取常规方法处死三黄。
21、鸡，用无菌的剪镊迅速剪取约005G鸡肝组织，用无菌生理盐水洗去附着血液，剪成小块后放在5ML的注射器管中（取下针头部分），推压注射器使肝组织从针头处挤出。把挤出物放于玻璃匀浆器（冰上预冷）中，加800ML组织裂解液置于匀浆器内快速用力匀浆至无明显的组织块，然后用移液枪将匀浆液转至2ML的EPPENDORF管中。将含有鸡肝匀浆液的EPPENDORF管置于65水浴消化2H后加蛋白酶K（20MG/ML）50ML,37,消化过夜后14000G离心30分钟，吸取400ML上清并加入40MLNAAC（25MOL/L）和880ML无水乙醇。另取2个EPPENDORF管再分别小心吸取200ML上清，分别加入2。
22、0MLNAAC（25MOL/L）和440ML无水乙醇，将两管置于20两小时以上，14000G离心30分钟，弃上清，在沉淀各加入250MLTE缓冲液溶解沉淀，并将两管合一管，再加入50MLRNASE（2MG/ML），混匀，37C消化过夜。加550ML氯仿酚（11）剧烈振荡5MIN。取480ML上清，并重复上两步，取400ML上清，加入40MLNAAC和880ML无水乙醇，20C放置两小时以上。14000G离心30MIN，70乙醇洗一次，14000G离心10MIN，弃上清，晾干加50MLTE缓冲液溶解鸡干扰素成熟蛋白基因的克隆根据GENBANK上公布的鸡干扰素的基因序列（GENBANKAY9740。
23、891）,利用PRIMERPRIMER50设计下面一对引物上游引物5ACGTGAATTCATGTGCAACCATCTTCGTCAC，下游引物5CCCGTCTAGATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGGGTGTTGAGACG3，以鸡肝基因组为模板，按下列程序在PCR仪上扩增鸡干扰素成熟蛋白基因DDH2O3475ML10PCRBUFFER5ML25MMOL/LMG23ML鸡肝的基因组1MLRTAQ025ML上游引物1ML下游引物1MLDNTP25MM4ML总体积50ML在PCR仪上设置944MIN，随后941MIN，501MIN，721MIN，共32个循环，结束循环后7210MIN；对。
24、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡干扰素成熟蛋白基因的大小为531BP（图1）；我们克隆的鸡干扰素成熟蛋白基因序列的测序结果（上海生物工程公司测序）与GENBANK上公布的鸡干扰素成熟蛋白基因序列AY9740891比对同源性为998。00192含有鸡干扰素成熟蛋白基因原核表达载体的构建与鉴定利用PCR的方法扩增的鸡干扰素成熟蛋白基因的前后两端分别有ECORI和SALI两个酶切位点，把鸡干扰素成熟蛋白基因从PCR产物上酶切后与同样用上述两种限制性说明书CN102154307ACN102154308A5/6页8内切酶酶切的PET28A表达载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新。
25、提取的质粒经ECORI和SALI酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，531BP大小的鸡干扰素成熟蛋白基因核酸条带清晰可见，说明重组PET28ACHIFN载体已经构建成功（图2）3感受态大肠杆菌BL21的制备用接种环挑形态饱满的大肠杆菌BL21的单个菌落，接种于含3MLLB培养基（1TRIPTONE，05YEASTEXTRACT，1NACL）的试管中，37培养过夜，次日按1100比例吸取过夜培养的BL21菌液转接至一支含新鲜LB培养基的试管中，待其细菌浓度达到OD600值达05时，开始制备感受态细胞，具体过程如下取约10ML转接后培养的细菌于15MLEPPENDORF管中，6000G离心3M。
26、IN收集细菌；用600ML4保存的无菌01MCACL2轻轻吹打开细菌，并置于冰水混合物中水浴，30MIN后取出EPPENDORF管，2000G离心10MIN，收集细菌，并用200ML01MCACL2（预冷）小心吹打开细菌，4保存12H后即可使用4含鸡干扰素成熟蛋白基因重组载体的转化及高效表达吸取1ML经过鉴定的PET28ACHIFN质粒溶液，与200ML新鲜制备的BL21感受态细胞轻轻混匀，置于冰水混合物中30MIN，42热冲击90SEC，再冰浴3MIN。继而加入800MLLB液体培养基中，37缓慢振荡培养45MIN，取200ML均匀涂布于近期制备的氨苄平板上，37温箱中培养16H。00201。
27、6H后，从37培养箱中拿出氨苄平板，并挑取单个饱满阳性菌落接种到3ML氨苄青霉素（100G/ML）的LB液体培养基中，37摇床培养过夜，次日按1比例取过夜培养菌液转接到3ML含氨苄青霉素的液体培养基，37剧烈振摇培养，约3小时，待菌液光密度至0506时，马上加入终浓度为1MM的IPTG进行诱导表达。以含有PET28ANOVAGEN公司载体质粒的BL21菌为阴性对照。诱导5小时后结束。取样品菌液500ML，室温12000RPM离心30SEC。收集阴阳性的菌体沉淀，以40ML无菌超纯水重悬沉淀，加入10MLSDSPAGE的上样缓冲液异丙基D硫代吡喃半乳糖苷，100作用10MIN，进行SDSPAGE。
28、。电泳结果显示转化PET28ACHIFN质粒的BL21经过IPTG诱导5H后，在分子量为26KD标准蛋白的附近有一条分子量大小约为23KD的很浓蛋白质印迹，而转化PET28A质粒的BL21经过IPTG诱导5H后，在上述位置并没有对应的蛋白印迹出现（图3）。这初步说明鸡干扰素在其基因与PET28A重组后在大肠杆菌中获得了很高的表达量。00215大肠杆菌表达的鸡干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性将1000ML诱导菌8000RPM/MIN10MIN离心后收集的菌体用PH72的PBS洗涤一次，洗涤后离心的菌体用40ML的50MM的TRISHCL（PH80,含1MM的EDTA）悬起，20作用过夜，次日。
29、以450W功率的超声波裂解25MIN（3S,3S）后，4，2000G/MIN10MIN离心后取上清，再8000RPM离心20MIN后取沉淀，即得重组鸡干扰素包涵体。包涵体用含1TRITONX100的50MM的TRISHCL（PH80,含1MM的EDTA）溶液洗涤后，再用含2M尿素的50MM的TRISHCL（PH80,含1MM的EDTA）溶液洗涤，洗涤后的沉淀用含1MMEDTA和10MM的DTT的8M的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，50MM的咪唑溶液4搅拌溶解12H。0022溶解后的重组鸡干扰素包涵体变性液上清经022UM的滤膜处理后，用含NINTA层析介质的亲和层析柱对其。
30、进行亲和纯化。NINTA层析介质装柱后用10个柱体积的亲和层析的平衡液进行平衡，流速控制在每分钟1ML，平衡后在层析介质上轻轻铺上经过说明书CN102154307ACN102154308A6/6页9洗涤纯化的重组鸡干扰素包涵体变性液，然后加入20个柱体积的亲和层析漂洗液进行漂洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，最后用5个柱体积的洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰放入截留分子量为3KD的透析带中，以含5M尿素的PBS溶液进行透析，每8H换一次透析液，共透析16H，继而分别以含3M,1M尿素的PBS溶液进行透析，同样是每8H换一次透析液，不同尿素浓度的透析液各透析16H，最后以PBS溶液透析24H，每8H换一次。
31、透析液。透析复性结束后的鸡干扰素溶液用022UM的滤膜后，测定蛋白浓度为026MG/ML,20保存备用。（亲和层析的平衡液为含8M尿素的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，50MM的咪唑溶液，漂洗液为含8M尿素的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，100MM的咪唑溶液洗脱液为含8M尿素的50MM的NAH2PO4PH80,03M的NACL，500MM的咪唑溶液）6大肠杆菌表达的鸡干扰素生物活性的测定（微量病变抑制法）取孵化910D的SPF鸡胚，去头、四肢及内脏，无菌状态下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成单个细胞后上96孔板，生长约12H使细胞全部贴壁生长后，去除生长。
32、液，每孔加入4倍倍比稀释的本发明中的鸡干扰素溶液，用100TCID50的剂量的水泡性口泡炎病毒（VSV）进行攻毒，同时设立阴性对照（只加16倍稀释的本发明中的鸡干扰素，不加病毒）、阳性对照（不加干扰素，只加病毒），空白对照（不加干扰素，不加病毒）。在阳性对照孔出现90以上VSV病变的时候，加入经16倍，64倍稀释后的本发明中的鸡干扰素的鸡胚成纤维细胞未出现病变，细胞状态良好，而加入1024倍稀释后的本发明中的鸡干扰素可以使80以上的鸡胚成纤维细胞免受100TCID50剂量的水泡性口泡炎病毒（VSV）的侵入。而只加16倍稀释的本发明中的鸡干扰素的阴性对照孔细胞生长良好。这说明本发明中的鸡干扰素具。
33、有很好的抗病毒生物学活性，本发明中的变性，纯化及复性的工艺流程是有效，合理的。说明书CN102154307ACN102154308A1/2页10序列表南京大学一种重组鸡干扰素的制备方法及其应用21531DNA大肠杆菌（ESCHERICHIACOLI）1TGCAACCATCTTCGTCACCAGGATGCCAACTTCTCTTGGAAAAGCCTCCAGCTCCTTCAG60AATACGGCTCCACCTCCACCACAGCCTTGCCCACAACAAGACGTGACTTTTCCATTTCCA120GAAACCCTTCTGAAGAGCAAGGACAAGAAGCAAGCAGCCATCACCACCC。
34、TCCGCATCCTC180CAACACCTCTTCAACATGCTTAGCAGCCCACACACTCCAAAACACTGGATTGACCGCACA240CGCCACAGCCTCCTCAACCAGATCCAGCATTACATCCATCACCTTGAGCAATGCTTCGTA300AACCAAGGCACGCGCTCCCAGAGGCGAGGGCCTCGCAACGCTCACCTCAGCATCAACAAA360TACTTCAGATCCATCCACAACTTCCTACAGCACAACAACTACAGTGCTTGTACCTGGGAC420CATGTCCGCCTCCAGGCTCGTGACTGCTTCCGAC。
35、ACGTGGACACACTCATACAATGGATG480AAAAGTCGAGCTCCTCTCACAGCCTCATCCAAACGTCTCAACACCCAGTGA5312176PRT大肠杆菌（ESCHERICHIACOLI）2CYSASNHISLEUARGHISGLNASPALAASNPHESERTRPLYSSERLEU1816GLNLEULEUGLNASNTHRALAPROPROPROPROGLNPROCYSPROGLN2432GLNASPVALTHRPHEPROPHEPROGLUTHRLEULEULYSSERLYSASP4048LYSLYSGLNALAALAILETHRTHRLEUARGIL。
36、ELEUGLNHISLEUPHE5664ASNMETLEUSERSERPROHISTHRPROLYSHISTRPILEASPARGTHR7280ARGHISSERLEULEUASNGLNILEGLNHISTYRILEHISHISLEUGLU8896GLNCYSPHEVALASNGLNGLYTHRARGSERGLNARGARGGLYPROARG序列表CN102154307ACN102154308A2/2页11104112ASNALAHISLEUSERILEASNLYSTYRPHEARGSERILEHISASNPHE120128LEUGLNHISASNASNTYRSERALACYSTHRTYRASPHISVALARGLEU136144GLNALAARGASPCYSPHEARGHISVALASPTHRLEUILEGLNTRPMET152160LYSSERARGALAPROLEUTHRALASERSERLYSARGLEUASNTHRGLN168176序列表CN102154307ACN102154308A1/1页12图1图2图3说明书附图CN102154307A。