壳聚糖树脂固定化酶纯化大豆乳清废水中胰蛋白酶抑制剂的工艺 技术领域 本发明利用制备的壳聚糖树脂固定化胰蛋白酶，从大豆乳清废水中纯化大豆胰蛋白酶抑制剂。该工艺利用提取大豆蛋白后的乳清废水，可得电泳纯胰蛋白酶抑制剂，在大豆乳清废水高值化利用及环境工程等领域具有广泛应用前景。
背景技术 大豆是我国丰富的粮食资源，大豆乳清是工业上采用碱溶酸沉工艺生产大豆分离蛋白的副产物，其中含有大量的胰蛋白酶抑制剂、低聚糖、异黄酮、维生素等功能性成分。但目前我国相关企业一般都没有对大豆乳清液采取相应的治理、回收措施，而将其作为废水处理。据统计，国内大豆分离蛋白生产企业每年排放的大豆乳清废弃液在300万吨以上。这不但浪费了大量有用资源，还造成了环境污染。因此，对大豆乳清废弃液进行资源化处理，回收其中的功能性物质成为近年来我国研究和工程的一个热点问题。目前，从大豆乳清废弃液中提取生物活性物质研究较为成熟的是大豆低聚糖、大豆异黄酮和大豆皂甙的提取，也有相关专利文献。而对于其中的大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化尚未受到充分重视。
胰蛋白酶抑制剂具有多种生理功能，在生物农药及生物医药领域有着广泛的应用前景。而胰蛋白酶抑制剂的分离纯化，仅在实验室水平上采取水浸、酸提、盐析、离子交换层析或凝胶过滤层析等较为繁杂的方法纯化制得，且耗时长、产率和纯度也不高；用制备电泳方法，虽可得到高纯度胰蛋白酶抑制剂，但产率极低，花费更高。壳聚糖在自然界中含量丰富，安全无毒，容易进行化学修饰；制备的壳聚糖微球树脂具有刚性大，内部多孔、呈立体网状结构，比表面积大，亲水性好的特点，可以满足各种吸附与分离工作的需要。因此，采用无毒的环氧氯丙烷作为活化剂，在壳聚糖微球树脂上引入环氧基，进而偶联胰蛋白酶，应用于大豆乳清废水中胰蛋白酶抑制剂的分离纯化，具有十分广阔的工业应用前景。
发明内容 本发明是利用制备的多孔、立体网状结构的壳聚糖微球树脂固定化胰蛋白酶，提供一种从大豆乳清废水中纯化大豆胰蛋白酶抑制剂的工艺过程。
工艺流程如下：将壳聚糖溶于醋酸溶液中，控制温度，分别加入液体石蜡、司班、乙酸乙酯、甲醛、戊二醛，调节pH，反应3～4小时，再加入硼氢化钠溶液，继续反应1～1.5小时后，减压抽滤、洗涤、干燥，即得壳聚糖微球树脂。将壳聚糖树脂置于NaOH溶液中，以环氧氯丙烷为活化剂，一定温度下活化树脂。活化后树脂加入胰蛋白酶进行偶联，减压抽滤、真空干燥，即得壳聚糖树脂固定化胰蛋白酶。将固定化酶树脂装柱，以乳清废弃液过柱，洗脱，收集活性部分冷冻干燥，得到电泳纯大豆胰蛋白酶抑制剂。
具体实施方式 将相对于醋酸溶液3.0～7.0％的壳聚糖粉末溶于2.0～7.0％的醋酸溶液中，于20～50℃不断搅拌下加入司班0.5～5.5ml，加入乙酸乙酯15～55ml，反应20～50min；调节温度50～80℃，加入甲醛15～55ml，反应30～50min；调节温度85～95℃，加入戊二醛10～50ml并调节pH值为7.0～10.0，继续反应3～5小时。逐滴加入0.5～8.5％的硼氢化钠溶液10～100ml，反应1～5小时，减压抽滤，分别以石油醚、无水乙醇洗涤，真空干燥即得壳聚糖微球树脂。取壳聚糖树脂，加入1.0～8.0mol/L NaOH溶液，使加入的环氧氯丙烷浓度达5～40％，40～90℃恒温振荡活化树脂2～10小时，抽虑去除环氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，10～40℃偶联10～24小时，减压抽虑，干燥即得壳聚糖树脂固定化胰蛋白酶。将固定化酶装入层析柱，以大豆乳清废弃液上样过柱，梯度洗脱，收集活性峰，冷冻干燥即得胰蛋白酶抑制剂。
实例1：取壳聚糖粉末10.0g溶于2.0％的醋酸溶液中，30℃不断搅拌下加入司班80溶液1.5ml，加入乙酸乙酯15ml，反应20min；调节温度至70℃，加入甲醛25ml，反应30min；调节温度为95℃，加入戊二醛10ml并调节pH值为9.0，反应3小时。逐滴加入1.5％的硼氢化钠溶液100ml，反应1.5小时，减压抽滤，分别以石油醚、无水乙醇洗涤，真空干燥即得壳聚糖微球树脂。取10.0g壳聚糖树脂，加入2.0ml环氧氯丙烷和6.0mol/L 30ml的NaOH溶液，40℃恒温振荡活化树脂2小时，抽虑去除环氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，30℃偶联24小时，减压抽虑，干燥即得壳聚糖树脂固定化胰蛋白酶。将固定化酶装入16mm×20cm层析柱，以大豆乳清废弃液上样过柱，pH梯度洗脱，收集活性峰，冷冻干燥即得胰蛋白酶抑制剂。
实例2：取壳聚糖粉末8.0溶于1.0％的醋酸溶液中，50℃不断搅拌下加入司班60溶液5.0ml，加入乙酸乙酯55ml，反应20min；调节温度80℃，加入甲醛15ml，反应30min；调节温度85℃，加入戊二醛50ml并调节pH值为8.0，继续反应5小时。逐滴加入8.0％的硼氢化钠溶液80ml，反应5小时，减压抽滤，分别以石油醚、丙酮、水洗涤，干燥即得壳聚糖微球树脂。取8.0g壳聚糖树脂，加入12.0ml环氧氯丙烷和1.0mol/L20ml的NaOH溶液，80℃恒温振荡活化树脂10小时，抽虑去除环氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，40℃偶联24小时，减压抽虑，干燥即得壳聚糖树脂固定化胰蛋白酶。将固定化酶装入45mm×20cm层析柱，以大豆乳清废弃液上样过柱，离子强度梯度洗脱，收集活性峰，冷冻干燥即得胰蛋白酶抑制剂。
实例3：取壳聚糖15.0g溶于7.0％的醋酸溶液中，20℃不断搅拌下加入司班40溶液0.5ml，加入乙酸乙酯45ml，反应50min；调节温度50℃，加入甲醛45ml，反应50min；调节温度90℃，加入戊二醛35ml并调节pH值为7.0，继续反应5小时，逐滴加入4.0％的硼氢化钠溶液80ml，反应2小时，减压抽滤，分别以石油醚、蒸馏水洗涤，干燥即得壳聚糖微球树脂。取15.0g壳聚糖树脂，加入7.0ml环氧氯丙烷和7.0mol/L 60ml的NaOH溶液，55℃恒温振荡活化树脂7小时，抽虑去除环氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，25℃偶联18小时，减压抽虑，干燥即得壳聚糖树脂固定化胰蛋白酶。将固定化酶装入550mm×40cm层析柱，以大豆乳清废弃液上样过柱，pH梯度洗脱，收集活性峰，冷冻干燥即得胰蛋白酶抑制剂。