一种用壳聚糖树脂分离羟基脯氨酸的方法 一、 技术领域
本发明属于反应高分子技术领域， 具体涉及分离羟基脯氨酸的方法。 二、 技术背景
羟基脯氨酸是胶原蛋白的特征成分， 其吡咯环的游离 4- 羟基能清除超氧自由基 和羟基自由基， 在保健、 化妆品工业用作抗氧化、 抗辐射、 防腐和甜味添加剂， 在制药行业用 抗生素、 抗肿瘤、 降压药及新型胃药等的合成原料， 在临床上用于治疗各种软组织疾病， 如 结缔组织受损、 风湿性关节炎等 ； 在食品行业作果汁、 清凉饮料、 营养饮料等的增味剂、 营养 强化剂和香味料 ； 也用于加快伤口愈合、 减肥等领域。
目前制备羟基脯氨酸的方法， 是以鱼鳞、 猪皮、 骨胶及制革废物等中的胶原蛋白为 原料， 通过酸水解产生游离羟基脯氨酸和脯氨酸， 再利用离子交换树脂分离出其中的羟基 脯氨酸。例如 1998 年 《食品科学》 第 10 期 19 中施强的 “从骨胶中提取 L- 羟基脯氨酸和 L- 脯氨酸” 一文中公开的方法， 是以骨胶为原料， 在常温下用 3 倍于骨胶的 6mol/L 的盐酸水 解骨胶为游离氨基酸， 用 1 倍于骨胶 (w/w) 的亚硝酸钠在 45℃以下亚硝化骨胶水解 3h， 得 亚硝胺溶液， 然后再用盐酸水解亚硝胺为亚氨酸。将亚氨酸溶液用活性炭脱色， 用 D61[H+] 型离子交换树脂柱交换脱色液中的亚氨酸， 再以 0.2mol/L 的氯化铵洗脱， 分别浓缩结晶， 获得 L-HP( 即羟基脯氨酸 ) 和 L-P( 即脯氨酸 ) 粗品 ； 将粗品精制后在酒精中重结晶， 即得 L-HP 成品和 L-P 成品。该方法的主要缺点是 ： 大量使用致癌的亚硝酸钠， 产生的一氧化氮 及废水中的亚硝酸钠既污染环境， 残留于氨基酸中的亚硝酸钠还存在致癌的风险 ； 由于使 用离子交换树脂分离， 其它氨基酸与羟基脯氨酸均带相同电荷， 分离效率低， 需多种树脂柱 串联才能得到合格产品， 生产成本高， 不适宜规模化工业生产。 三、 发明内容
本发明的目的是针对现有制备羟基脯氨酸方法的不足， 提供一种壳聚糖树脂分离 羟基脯氨酸的方法， 具有工艺简单， 节约能源， 无有害物质排放污染环境， 资源综合利用率 高， 回收活性炭及乙醇可再利用， 产品纯度高等特点。
本发明的机理是 ： 戊二醛交联壳聚糖树脂中残存的游离氨基， 在二环己基碳二亚 胺 (DCC) 催化下， 能与游离羟基脯氨酸的羧基反应， 脱水生成肽键， 从而制备出羟基脯氨酸 修饰壳聚糖树脂。该壳聚糖树脂以羟基脯氨酸的吡咯环为吸附分离官能团， 该环为平面结 构， 环上电子云分布均匀化， 形成共平面的 5 原子疏水域， 能与有相同结构的吡咯环化合物 形成最有效的疏水相互作用。蛋白质由 20 种氨基酸组成， 仅脯氨酸和羟基脯氨酸含吡咯 环， 当该氨基酸与羟基脯氨酸修饰壳聚糖树脂的吡咯环′临近′， 即发生基于吡咯环平面 的疏水相互作用。其它氨基酸没有吡咯环或与该结构差异较大， 不能或只能部分与吡咯环 形成疏水相互作用， 作用力较小， 可被随后扩散而至的吡咯氨基酸取代， 因此， 利用羟基脯 氨酸修饰的壳聚糖树脂可实现吡咯氨基酸与其它氨基酸的亲和分离。 本发明按上述原理制 备出羟基脯氨酸修饰的壳聚糖树脂， 并以该树脂吸附蛋白质水解液中的羟基脯氨酸， 再经过洗脱、 浓缩及冻干， 就获得分离纯化的羟基脯氨酸产品。
本发明的目的是这样实现的 ： 一种用壳聚糖树脂制备羟基脯氨酸的方法 ： 以壳聚 糖和明胶为原料， 先制备壳聚糖树脂， 再制备胶原蛋白水解溶液， 然后经吸附、 洗脱及冻干 而得成品。其具体的方法步骤如下 ：
(1) 制备壳聚糖树脂
①备料
按壳聚糖∶戊二醛∶羟基脯氨酸∶碳酸钙的质量百分比为 42 ～ 44 ％∶ 20 ～ 22％∶ 34 ～ 36％∶ 1 ～ 2％的比例备料， 备用。
②制备交联壳聚糖微球
第 (1)- ①步完成后， 先将壳聚糖溶于稀盐酸溶液中， 配制成质量分数为 1 ～ 2％的 壳聚糖溶液。后在搅拌条件下， 将壳聚糖溶液分散在等体积的液体石蜡中， 继续搅拌 20 ～ 30min， 再在搅拌条件下， 升温至 40 ～ 50℃ ； 并加入戊二醛交联剂和致孔剂碳酸钙粉末， 进 行交联反应 60 ～ 80min ； 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系 pH 至 9 ～ 10， 并在温度为 60 ～ 70℃下， 继续搅拌反应 2.5 ～ 3.5h ； 最后抽滤， 分别收集滤渣， 弃滤液。对滤渣用 60 ～ 80℃ 的蒸馏水洗涤除去液体石蜡， 再用稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙， 然后用蒸馏水、 95％乙醇反 复洗涤至中性， 就制备出交联壳聚糖微球。收集洗涤液， 经旋转蒸发仪回收乙醇， 再利用。 ③制备壳聚糖树脂
第 (1)- ②步完成后， 先将 (1)- ①步备好的 34 ～ 36 ％羟基脯氨酸， 溶解于乙醇 浓度为 50％的乙醇溶液中， 再加入第 (1)- ②步制备出的交联壳聚糖微球， 搅拌吸附 50 ～ 70min ； 再加入经乙醇浓度为 70％的乙醇溶液， 溶解二环己基碳二亚胺 (DCC) 的溶液， 配制 成 DCC 的摩尔数为羟基脯氨酸摩尔数的 1 ～ 2 倍的溶液， 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系 的 pH 值为 5 ～ 7 的条件下， 反应 8 ～ 12min。最后对反应液进行抽滤， 收集滤渣， 弃滤液。 对滤渣， 先用 95％乙醇洗涤除去二环己基碳二亚胺分解产物异脲， 再在 60 ～ 80℃下进行干 燥 8 ～ 12h， 就制备出壳聚糖树脂 ( 即为羟基脯氨酸修饰的壳聚糖树脂 )。收集洗涤滤渣的 洗涤液， 经旋转蒸发仪回收乙醇， 再利用。
(2) 制备胶原蛋白水解溶液
第 (1) 步完成后， 以明胶为蛋白质原料， 按明胶 (g) ∶盐酸浓度为 6mol/L 的盐酸 溶液 (L) 的重量 - 体积之比为 1 ∶ 4.5 ～ 5.5 的比例， 先将明胶置于搪瓷反应釜中， 在搅拌 下加入盐酸溶液， 连接好回流装置后， 密闭， 先升温至 110 ～ 120℃回流水解 19 ～ 21h ； 后冷 却至 70 ～ 80℃， 再加入明胶质量 19 ～ 21％的活性炭， 搅拌脱色 25 ～ 35min， 然后进行真 空过滤， 分别收集滤渣和滤液。对于滤渣， 送活性炭再生工厂， 进行再生后， 利用 ； 对于滤液 ( 即为胶原蛋白水解物 )， 用稀氢氧化钠溶液调节其 pH 值为 2 ～ 4， 并用去离子水稀释至滤 液中的羟基脯氨酸的浓度为 2 ～ 6mg/mL 的胶原蛋白水解溶液。本步骤采用的蛋白质原料， 为所述的明胶外， 还用其他蛋白质 ( 如骨胶或皮毛或废弃革制品等 )。
(3) 壳聚糖树脂吸附羟基脯氨酸
第 (2) 步完成后， 将第 (1) 步制备出的壳聚糖树脂放置于玻璃层析柱中， 先用去离 子水反冲洗， 排出壳聚糖树脂柱中的气泡， 然后以流速为 2 ～ 6 倍树脂柱体积 / 小时 (BV/ h)， 泵入第 (2) 步制备出的胶原蛋白水解溶液， 过柱， 进行壳聚糖树脂吸附羟基脯氨酸， 直 至过柱液中羟基脯氨酸的浓度为 0.1mg/mL 时止。然后用 1 倍树脂柱体积的去离子水洗涤
壳聚糖树脂柱， 最后分别收集吸附有羟基脯氨酸的壳聚糖树脂和过柱液。 对过柱液， 用于制 备调味用水解动物蛋白。
(4) 制备羟基脯氨酸冻干粉
第 (3) 步完成后， 对第 (3) 步收集的吸附有羟基脯氨酸的壳聚糖树脂， 泵入 pH 值 为 8 ～ 10、 乙醇浓度为 70 ～ 80％的乙醇溶液， 以 2 ～ 4 倍树脂柱体积 / 小时的流速进行洗 脱， 分别收集第 1 ～ 2 倍树脂柱体积的洗脱液和第 2 ～ 4.5 倍树脂柱体积的洗脱液 ( 前者含 脯氨酸， 后者含羟基脯氨酸 )， 直至流出的洗脱液中无羟基脯氨酸为止。将卸载羟基脯氨酸 的壳聚糖树脂柱， 用去离子水冲洗后， 可再次用于吸附羟基脯氨酸 ； 对于分别含羟基脯氨酸 和脯氨酸的洗脱流出液， 分别泵入真空浓缩装置中， 控制真空度为 -0.6 ～ -0.9MPa， 在 75 ～ 90℃下浓缩， 直至浓缩液波美度达到 15Be 时止， 就获得分别含羟基脯氨酸和脯氨酸的浓缩 液。将含羟基脯氨酸和脯氨酸的浓缩液分别放入冷冻干燥机中， 在温度为 -50 ～ -60℃， 真 空度为 25 ～ 50Pa 条件下， 干燥 24 ～ 30h， 就制备出羟基脯氨酸的冻干粉， 并且得到了副产 品脯氨酸冻干粉。收得率是纯度为 95.3 ～ 98％的羟基脯氨酸冻干粉。
本发明采用上述技术方案后， 主要有以下效果 ：
(1) 本发明依据吡咯环与吡咯环之间的特异疏水相互作用， 直接从胶原蛋白水 解溶液中吸附羟基脯氨酸， 再经过洗脱， 浓缩和干燥的简单工艺， 就获得了纯度为 95.3 ～ 98％的羟基脯氨酸冻干粉。 (2) 本发明省去使用多种离子交换树脂及其再生活化产生的大量废水及工时， 工 艺简单、 有利于环保， 生产成本低。
(3) 本发明在温和的条件下进行， 生产设备简单， 耗能低。可推广至其它蛋白质原 料中含羟基脯氨酸的分离， 从而进一步降低生产成本， 便于推广应用。
(4) 本发明产生过程中的胶原蛋白过柱溶液， 可用于制造调味用水解动物蛋白， 副 产品脯氨酸冻干粉， 可用于食品行业中作增味剂等， 从而实现了原料的充分利用。
(5) 本发明制备的壳聚糖树脂吸附羟基脯氨酸后， 可重复多次使用， 再生效果好。 吸附色素的废活性炭经再生后可再次用于脱色， 用于洗脱壳聚糖树脂的废乙醇可回收再利 用。因此本发明无 “三废” 排放， 环境友好， 是高效率、 低消耗、 低成本的绿色环保分离方法。
采用本发明方法制备出的产品， 可广泛应用于保健、 化妆品行业中作抗氧化、 抗 辐射的添加剂等 ； 食品行业中作增味剂、 营养强化剂和香味料 ； 制药行业中作抗生素、 抗肿 瘤、 降压药等的合成原料等 ； 在加快伤口愈合、 减肥等领域也有着很广泛的用途。
四、 具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步说明本发明。
实施例 1
一种用壳聚糖树脂分离羟基脯氨酸的方法， 其具体的方法步骤如下 ：
(1) 制备壳聚糖树脂
①备料
按 壳 聚 糖 ∶ 戊 二 醛 ∶ 羟 基 脯 氨 酸 ∶ 碳 酸 钙 的 质 量 百 分 比 为 42％∶ 20％∶ 34 ∶ 1％的比例备料， 备用。
②制备交联壳聚糖微球第 (1)- ①步完成后， 先将壳聚糖溶于稀盐酸溶液中， 配制成质量分数为 1％的壳 聚糖溶液。后在搅拌条件下， 将壳聚糖溶液分散在等体积的液体石蜡中， 继续搅拌 20min， 再在搅拌条件下， 升温至 40℃ ； 并加入戊二醛交联剂和致孔剂碳酸钙粉末， 进行交联反应 60min ； 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系 pH 至 9， 并在温度为 60℃下， 继续搅拌反应 2.5h ； 最后抽滤， 分别收集滤渣， 弃滤液。对滤渣用 60 ℃的蒸馏水洗涤除去液体石蜡， 再用稀盐 酸溶解滤渣中的碳酸钙， 然后用蒸馏水、 95％乙醇反复洗涤至中性， 就制备出交联壳聚糖微 球。收集洗涤液， 经旋转蒸发仪回收乙醇， 再利用。
③制备壳聚糖树脂
第 (1)- ②步完成后， 先将 (1)- ①步备好的 34％羟基脯氨酸， 溶解于乙醇浓度为 50％的乙醇溶液中， 再加入第 (1)- ②步制备出的交联壳聚糖微球， 搅拌吸附 50min ； 再加入 经乙醇浓度为 70％的乙醇溶液， 溶解二环己基碳二亚胺 (DCC) 的溶液， 配制成 DCC 的摩尔数 为羟基脯氨酸摩尔数的 1 ～ 2 倍的溶液， 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系的 pH 值为 5 的条 件下， 反应 8min。最后对反应液进行抽滤， 收集滤渣， 弃滤液。对滤渣， 先用 95％乙醇洗涤 除去二环己基碳二亚胺分解产物异脲， 再在 60℃下进行干燥 8h， 就制备出壳聚糖树脂 ( 即 为羟基脯氨酸修饰的壳聚糖树脂 )。收集洗涤滤渣的洗涤液， 经旋转蒸发仪回收乙醇， 再利 用。 (2) 制备胶原蛋白水解溶液
第 (1) 步完成后， 以明胶为蛋白质原料， 按明胶 (g) ∶盐酸浓度为 6mol/L 的盐酸 溶液 (L) 的重量 - 体积之比为 1 ∶ 4.5 的比例， 先将明胶置于搪瓷反应釜中， 在搅拌下加入 盐酸溶液， 连接好回流装置后， 密闭， 先升温至 110℃回流水解 19h ； 后冷却至 70℃， 再加入 明胶质量 19％的活性炭， 搅拌脱色 25min， 然后进行真空过滤， 分别收集滤渣和滤液。对于 滤渣， 送活性炭再生工厂， 进行再生后， 利用 ； 对于滤液 ( 即为胶原蛋白水解物 )， 用稀氢氧 化钠溶液调节其 pH 值为 2， 并用去离子水稀释至滤液中的羟基脯氨酸的浓度为 2mg/mL 的胶 原蛋白水解溶液。本步骤采用的蛋白质原料， 为所述的明胶外， 还用其他蛋白质 ( 如骨胶或 皮毛或废弃革制品等 )。
(3) 壳聚糖树脂吸附羟基脯氨酸
第 (2) 步完成后， 将第 (1) 步制备出的壳聚糖树脂放置于玻璃层析柱中， 先用去离 子水反冲洗， 排出壳聚糖树脂柱中的气泡， 然后以流速为 2 倍树脂柱体积 / 小时 (BV/h)， 泵 入第 (2) 步制备出的胶原蛋白水解溶液， 过柱， 进行壳聚糖树脂吸附羟基脯氨酸， 直至过柱 液中羟基脯氨酸的浓度为 0.1mg/mL 时止。然后用 1 倍树脂柱体积的去离子水洗涤壳聚糖 树脂柱， 最后分别收集吸附有羟基脯氨酸的壳聚糖树脂和过柱液。 对过柱液， 用于制备调味 用水解动物蛋白。
(4) 制备羟基脯氨酸冻干粉
第 (3) 步完成后， 对第 (3) 步收集的吸附有羟基脯氨酸的壳聚糖树脂， 泵入 pH 值 为 8、 乙醇浓度为 70％的乙醇溶液， 以 2 倍树脂柱体积 / 小时的流速进行洗脱， 分别收集第 1 倍树脂柱体积的洗脱液和第 2 倍树脂柱体积的洗脱液 ( 前者含脯氨酸， 后者含羟基脯氨 酸 )， 直至流出的洗脱液中无羟基脯氨酸为止。将卸载羟基脯氨酸的壳聚糖树脂柱， 用去离 子水冲洗后， 可再次用于吸附羟基脯氨酸 ； 对于分别含羟基脯氨酸和脯氨酸的洗脱流出液， 分别泵入真空浓缩装置中， 控制真空度为 -0.6MPa， 在 75℃下浓缩， 直至浓缩液波美度达到
15Be°时止， 就获得分别含羟基脯氨酸和脯氨酸的浓缩液。将含羟基脯氨酸和脯氨酸的浓 缩液分别放入冷冻干燥机中， 在温度为 -50℃， 真空度为 25Pa 条件下， 干燥 24h， 就制备出羟 基脯氨酸的冻干粉， 并且得到了副产品脯氨酸冻干粉。收得率是纯度为 95.3％的羟基脯氨 酸冻干粉。
实施例 2
一种用壳聚糖树脂分离羟基脯氨酸的方法的具体步骤， 同实施例 1， 其中 ：
第 (1)- ① 步中， 按壳 聚糖∶ 戊二醛 ∶羟基 脯 氨酸 ∶碳酸 钙 的质量 百 分比为 43％∶ 21％∶ 35％∶ 1.5％的比例。
第 (1)- ②步中， 配制成质量分数为 1.5％的壳聚糖溶液。继续搅拌 25min， 升温至 45℃； 进行交联反应 70min ； 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系 pH 至 9.5， 并在温度为 65℃下， 继续搅拌反应 3h。对滤渣用 70℃的蒸馏水洗涤除去液体石蜡。
第 (1)- ③步中， 先将 (1)- ①步备好的 35％羟基脯氨酸， 溶解于乙醇浓度为 50％ 的乙醇溶液中。搅拌吸附 60min ； 配制成 DCC 的摩尔数为羟基脯氨酸摩尔数的 1.5 倍的溶 液， 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系的 pH 值为 6 的条件下， 反应 10min。再在 70℃下进行 干燥 10h。
第 (2) 步中， 按明胶 (g) ∶盐酸浓度为 6mol/L 的盐酸溶液 (L) 的重量 - 体积之比 为 1 ∶ 5 的比例， 先升温至 115℃回流水解 20h ； 后冷却至 75℃， 再加入明胶质量 20％的活 性炭， 搅拌脱色 30min。对于滤液， 用稀氢氧化钠溶液调节其 pH 值为 3， 并用去离子水稀释 至滤液中的羟基脯氨酸的浓度为 4mg/mL 的胶原蛋白水解溶液。
第 (3) 步中， 以流速为 4 倍树脂柱体积 / 小时 (BV/h)。
第 (4) 步中， 泵入 pH 值为 9、 乙醇浓度为 75％的乙醇溶液， 以 3 倍树脂柱体积 / 小 时的流速进行洗脱， 分别收集第 1.5 倍树脂柱体积的洗脱液和第 3 倍树脂柱体积的洗脱液。 控制真空度为 -0.7MPa， 在 80℃下浓缩。在温度为 -55℃， 真空度为 35Pa 条件下， 干燥 27h。 收得率是纯度为 96.5％的羟基脯氨酸冻干粉。
实施例 3
一种用壳聚糖树脂分离羟基脯氨酸的方法的具体步骤， 同实施例 1， 其中 ：
第 (1)- ① 步中， 按壳 聚糖∶ 戊二醛 ∶羟基 脯 氨酸 ∶碳酸 钙 的质量 百 分比为 44％∶ 22％∶ 36％∶ 2％的比例。
第 (1)- ②步中， 配制成质量分数为 2 ％的壳聚糖溶液。继续搅拌 30min， 升温至 50℃； 进行交联反应 80min ； 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系 pH 至 10， 并在温度为 70℃下， 继续搅拌反应 3.5h。
第 (1)- ③步中， 先将 (1)- ①步备好的 36％羟基脯氨酸， 溶解于乙醇浓度为 50％ 的乙醇溶液中， 搅拌吸附 70min ； 配制成 DCC 的摩尔数为羟基脯氨酸摩尔数的 2 倍的溶液， 然后用稀氢氧化钠溶液调节体系的 pH 值为 7 的条件下， 反应 12min。再在 80℃下进行干燥 12h。
第 (2) 步中， 按明胶 (g) ∶盐酸浓度为 6mol/L 的盐酸溶液 (L) 的重量 - 体积之比 为 1 ∶ 5.5 的比例， 先升温至 120℃回流水解 21h ； 后冷却至 80℃， 再加入明胶质量 21％的 活性炭， 搅拌脱色 35min。对于滤液， 用稀氢氧化钠溶液调节其 pH 值为 4， 并用去离子水稀 释至滤液中的羟基脯氨酸的浓度为 6mg/mL 的胶原蛋白水解溶液。第 (3) 步中， 以流速为 6 倍树脂柱体积 / 小时 (BV/h)。
第 (4) 步中， 泵入 pH 值为 10、 乙醇浓度为 80％的乙醇溶液， 以 4 倍树脂柱体积 / 小时的流速进行洗脱， 分别收集第 2 倍树脂柱体积的洗脱液和第 4.5 倍树脂柱体积的洗脱 液。控制真空度为 -0.9MPa， 在 90℃下浓缩。在温度为 -60℃， 真空度为 50Pa 条件下， 干燥 30h。收得率是纯度为 98％的羟基脯氨酸冻干粉。10