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作为蛋白激酶抑制剂的嘧啶衍生物.pdf

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文档编号：1169873

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本发明涉及式VIII化合物，或其可药用盐或酯，其中：X为NR7；Y为O或N-(CH2)nR19；n为1、2或3；m为1或2；R1和R2各自独立地为H、烷基或环烷基；R4和R4各自独立地为H或烷基；或R4和R4一起形成螺环烷基；R19为H、烷基、芳基或环烷基；R6为OR8或卤素；且R7和R8各自独立地为H或烷基。其它方面涉及包含所述化合物的药物组合物，及由此在治疗增生性疾病等中的用途。。

摘要
申请专利号：	CN200880118290.2	申请日：	2008.09.29
公开号：	CN101878216A	公开日：	2010.11.03
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07D 487/04申请日:20080929\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D487/04; C07D519/00; A61P35/00; A61K31/551	主分类号：	C07D487/04
申请人：	西克拉塞尔有限公司
发明人：	乔纳森·J·霍利克; 斯图尔特·D·琼斯; 克莱尔·J·弗林; 迈克尔·G·托马斯
地址：	英国伦敦
优先权：	2007.09.28 GB 0719038.2; 2008.04.15 GB 0806844.7
专利代理机构：	北京市柳沈律师事务所 11105	代理人：	邹宗亮
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内容摘要

本发明涉及式VIII化合物，或其可药用盐或酯，其中：X为NR7；Y为O或N-(CH2)nR19；n为1、2或3；m为1或2；R1和R2各自独立地为H、烷基或环烷基；R4和R4′各自独立地为H或烷基；或R4和R4′一起形成螺环烷基；R19为H、烷基、芳基或环烷基；R6为OR8或卤素；且R7和R8各自独立地为H或烷基。其它方面涉及包含所述化合物的药物组合物，及由此在治疗增生性疾病等中的用途。

权利要求书

1.式VIII化合物，或其可药用盐或酯，其中：X为NR⁷；Y为O或N-(CH₂)_nR¹⁹；n为1、2或3；m为1或2；R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；R¹⁹为H、烷基、芳基或环烷基；R⁶为OR⁸或卤素；且R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。2.权利要求1的化合物，其为式VIIIa，或其可药用盐或酯，其中：X为NR⁷；R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；R¹⁹为H、烷基、芳基或环烷基；R⁶为OR⁸或卤素；且R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。3.权利要求1或权利要求2的化合物，其中R¹为H或烷基，更优选为甲基。4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R²为环烷基，更优选为环戊基或环己基。5.前述权利要求中任一项的化合物，其中R⁷为H或烷基，更优选为H。6.前述权利要求中任一项的化合物，其中R⁴和R^4′各自独立地为烷基，更优选为甲基。7.权利要求1-5中任一项的化合物，其中R⁴和R^4′一起形成螺环烷基，更优选为螺C₃环烷基。8.前述权利要求中任一项的化合物，其中R⁶为OR⁸，更优选为OMe。9.前述权利要求中任一项的化合物，其中R¹⁹为环丙基。10.权利要求1的化合物，其选自：及其可药用盐和酯。11.式VI化合物，或其可药用盐或酯，其中：X为NR⁷；R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；R¹⁸为H或烷基，其中所述烷基任选被R⁶取代；每个R⁶独立地为OR⁸或卤素；且R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。12.式VII化合物，或其可药用盐或酯，其中：X为NR⁷；R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；R⁶为OR⁸或卤素；且R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。13.权利要求11或权利要求12的化合物，其中R¹、R²、R⁴、R^4′、R⁶、R⁷和R⁸如权利要求3-8中任一项所定义。14.权利要求11的化合物，其选自：及其可药用盐和酯。15.权利要求12的化合物，其选自：及其可药用盐和酯。16.化合物，其选自：

化合物
名称

及其可药用盐和酯。

17.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的化合物，混合有可药用稀释剂、赋形剂或载体。

18.权利要求1-16中任一项的化合物在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。

19.权利要求18的用途，其中所述增生性疾病为癌症或白血病。

20.权利要求18的用途，其中所述增生性疾病为肾小球肾炎、类风湿性关节炎、牛皮癣或慢性阻塞性肺病。

21.一种治疗增生性疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的权利要求1-16中任一项定义的化合物。

22.一种治疗PLK-依赖性疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的权利要求1-16中任一项定义的化合物。

23.一种制备权利要求1-16中任一项定义的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)将式(II)化合物转化为式(IV)化合物，直接进行或经过分离式(III)化合物；和

(ii)将所述式(IV)化合物转化为权利要求1-16中任一项的化合物

24.权利要求23的方法，其中步骤(i)包括在EtOH/H₂O中加热所述式(II)化合物以及NH₄Cl和Fe。

25.权利要求1-16中任一项的化合物，其用于医药。

26.权利要求1-16中任一项的化合物，其用于治疗增生性疾病。

说明书

作为蛋白激酶抑制剂的嘧啶衍生物

本发明涉及取代的嘧啶衍生物及其在治疗中的用途。更具体地，但不是排他地，本发明涉及能够抑制一种或多种蛋白激酶(尤其是polo-样激酶)的化合物。

发明背景

Polo-样激酶家族由在控制进入有丝分裂和控制有丝分裂过程进程的具有整合作用的关键细胞周期调节酶组成。许多肿瘤细胞表达高水平的PLK1，且对靶向该蛋白的反义寡核苷酸有响应。

有丝分裂的起始需要激活促M-期因子(MPF)，即CDK1和B-型细胞周期蛋白之间的复合物[Nurse，P.(1990)Nature，344，503-508]。后者在细胞周期的S和G2期聚集，并通过WEE1、MIK1和MYT1激酶促进MPF复合物的抑制磷酸化。在G2期的最后，通过双重-特异性磷酸酶CDC25C的相应的去磷酸化引发MPF的激活[Nigg，E.A.(2001)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2，21-32]。在分裂期间，细胞周期蛋白B集中在细胞质，且在前期期间进行磷酸化，然后核转运。认为在前期期间活化的MPF的核聚集对于引发M-期事件是重要的[Takizawa，C.G.和Morgan，D.O.(2000)Curr.Opin.Cell Biol.，12，658-665]。然而，核MPF由WEE1保持无活性，除非由CDC25C解除。磷酸酶CDC25C本身(在分裂期间集中在细胞质)，在前期聚集在核中。细胞周期蛋白B和CDC25C通过由PLK1磷酸化进入核[Roshak，A.K.，Capper，E.A.，Imburgia，C.，Fornwald，J.，Scott，G.和Marshall，L.A.(2000)Cell.Signalling，12，405-411]。因此，该激酶M-期起始的重要调节剂。

在人中，存在三种密切相关的polo-样激酶(PLK)[Glover，D.M.，Hagan，I.M.和Tavares，A.A.(1998)Genes Dev.，12，3777-3787]。它们包含高度同源的N-末端催化激酶域，且它们的C-末端包含2或3个保守域(polo盒)。polo盒的功能尚不完全清楚，但是对于适合的中期/后期转变和胞质分裂需要polo盒-依赖性PLK1活性[Seong，Y.-S.，Kamijo，K.，Lee，J.-S.，Fernandez，E.，Kuriyama，R.，Miki，T.和Lee，K.S.(2002)J.Biol.Chem.，277，32282-32293]。三种PLK中，PLK1的表征是最充分的；其调节许多细胞分裂周期效果，包括有丝分裂的开始、DNA-破坏检查点活化(damage checkpointactivation)、后期促进复合物的调节、蛋白酶体的磷酸化，和中心体复制和成熟。哺乳动物PLK2(也称为SNK)和PLK3(也称为PRK和FNK)最初表现为立即早期基因产物。PLK3激酶活性在S期后期和G2期达到最高。其在DNA-破坏检查点活化期间也被激活，并产生氧化应激。PLK3在细胞中调节微管动态和中心体功能中起重要作用，且解除管制的(deregulated)PLK3的表达导致细胞周期停止和凋亡[Wang，Q.，Xie，S.，Chen，J.，Fukusawa，K.，Naik，U.，Traganos，F.，Darzynkiewicz，Z.，Jhanwar-Uniyal，M.和Dai，W.(2002)Mol.Cell.Biol.，22，3450-3459]。PLK2是三种PLK中了解最少的同族体。PLK2和PLK3均可具有其它重要的后有丝分裂功能[Kauselmann，G.，Weiler，M.，Wulff，P.，Jessberger，S.，Konietzko，U.，Scafidi，J.，Staubli，U.，Bereiter-Hahn，J.，Strebhardt，K.和Kuhl，D.(1999)EMBO J.，18，5528-5539]。

人PLK调节有丝分裂的一些重要方面的事实通过抗-PLK1抗体微注射人肿瘤细胞表现出来[Lane，H.A.和Nigg，E.A.(1996)J.Coll.Biol.，135，1701-1713]。该处理对于DNA复制没有作用，但损害细胞分裂。细胞有丝分裂中停止，且表现出凝聚染色质和单星微管(从复制但未分离的中心体成核)的异常分布。相反，非-无限增殖的人细胞在G2期作为单个的单核细胞停止。而且，当PLK1功能通过腺病毒-介导的显性负相基因的递送被阻断时，观察到在许多肿瘤细胞系中的肿瘤选择性凋亡，相反正常上皮细胞(虽然在有丝分裂中停止)再次逃离在肿瘤细胞中观察到的有丝分裂破坏[Cogswell，J.P.，Brown，C.E.，Bisi，J.E.和Neill，S.D.(2000)Cell Growth Differ.，11，615-623]。因此，对于在G2期晚期/前早期中心体的功能成熟以及随后两极纺锤体的建立，需要PLK1活性。而且，这些结果表明对PLK1损伤敏感的中心体-成熟检查点存在于正常细胞中。通过小干扰RNA(siRNA)技术消耗细胞PLK1也证明对于多重有丝分裂进化成和胞质分裂的完成需要该蛋白[Liu，X.和Erikson，R.L.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，5789-5794]。还通过与PLK1-特异性反义核苷酸的作用表明了对于PLK抑制的可能的治疗原理，其表现出诱导体内和体外癌细胞的生长抑制[Spankuch-Schmitt，B.，Wolf，G.，Solbach，C.，Loibl，S.，Knecht，R.，Stegmuller，M.，vonMinckwitz，G.，Kaufmann，M.和Strebhardt，K.(2002)Oncogene，21，3162-3171]。PLK1在哺乳动物细胞中的组成型表达表现出导致恶性转化[Smith，M.R.，Wilson，M.L.，Hamanaka，R.，Chase，D.，Kung，H.，Longo，D.L.和Ferris，D.K.(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.，234，397-405]。而且，经常在人肿瘤中观察到PLK1的过表达，且PLK1表达对于患有不同类型的肿瘤的患者具有预后价值[Takahashi，T.，Sano，B.，Nagata，T.，Kato，H.，Sugiyama，Y.，Kunieda，K.，Kimura，M.，Okano，Y.和Saji，S.(2003)Cancer Science，94，148-152；Tokumitsu，Y.，Mori，M.，Tanaka，S.，Akazawa，K.，Nakano，S.和Niho，Y.(1999)Int.J.Oncol.，15，687-692；Wolf，G.，Elez，R.，Doermer，A.，Holtrich，U.，Ackermann，H.，Stutte，H.J.，Altmannsberger，H.-M.，Rübsamen-Waigmann，H.和Strebhardt，K.(1997)Oncogene，14，543-549]。

虽然已经理解了药理学PLK抑制的治疗可能[Kraker，A.J.和Booher，R.N.(1999)In Annual Reports in Medicinal Chemistry(Vol.34)(Doherty，A.M.，ed.)，pp.247-256，Academic Press]，但是至今几乎没有报导过涉及可用作药物的小分子PLK抑制剂。至今非常少的表征的生化PLK1抑制剂中的一个是scytonemin，一种对称吲哚海洋天然产物[Stevenson，C.S.，Capper，E.A.，Roshak，A.K.，Marquez，B.，Eichman，C.，Jackson，J.R.，Mattern，M.，Gerwick，W.H.，Jacobs，R.S.和Marshall，L.A.(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.，303，858-866；Stevenson，C.S.，Capper，E.A.，Roshak，A.K.，Marquez，B.，Grace，K.，Gerwick，W.H.，Jacobs，R.S.和Marshall，L.A.(2002)Inflammation Research，51，112-114]。Scytonemin通过重组PLK1抑制CDC25C的磷酸化，其IC₅₀值为约2μM(10μM的ATP浓度)。抑制是明显可逆的，且机理关于混合-竞争型ATP。对于其它蛋白丝氨酸/苏氨酸-和双重特异性细胞周期激酶(包括MYT1、CHK1、CDK1/细胞周期蛋白B和PKC)观察到类似的效力。Scytonemin表现出对体外多种人细胞系的显著的抗增殖作用。其它小分子PLK抑制剂及其在治疗增生性疾病中的用途描述于Cyclacel Limited的国际专利申请WO2004/067000中。

本发明为了寻求开发新的小分子PLK抑制剂。更具体的，本发明为了提供在治疗一系列的增生性疾病中具有治疗作用的为了提供小分子PLK抑制剂。

发明内容

本发明第一方面涉及式VIII化合物，或其可药用盐或酯，

其中：

X为NR⁷；

Y为O或N-(CH₂)_nR¹⁹；

n为1、2或3；

m为1或2；

R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；

R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或

R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；

R¹⁹为H、烷基、芳基或环烷基；

R⁶为OR⁸或卤素；且

R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。

本发明第二方面涉及式VI化合物，或其可药用盐或酯，

其中：

X为NR⁷；

R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；

R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或

R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；

R¹⁸为H或烷基，其中所述烷基任选被R⁶取代；

每个R⁶独立地为OR⁸或卤素；且

R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。

本发明第三方面涉及式VII化合物，或其可药用盐或酯，

其中：

X为NR⁷；

R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；

R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或

R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；

R⁶为OR⁸或卤素；且

R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。

本发明第四方面涉及化合物，其选自：

本发明第五方面涉及药物组合物，其包含上述化合物，混合有可药用稀释剂、赋形剂或载体。

本发明第六方面涉及上述化合物在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。

本发明第七方面涉及一种治疗增生性疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的上述化合物。

本发明第八方面涉及一种治疗PLK-依赖性疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的上述化合物。

本发明第九方面涉及制备上述化合物的方法。

发明详述

本文所用的术语“烷基”包括饱和的直链和支链烷基，其可被(单-或多-)取代或未被取代。优选地，烷基为C_1-20烷基，更优选为C_1-15烷基，更优选为C_1-12烷基，更优选为C_1-6烷基，更优选为C_1-3烷基。尤其优选的烷基包括，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。适合取代基包括，例如，一个或多个R⁶基团。优选地，烷基未被取代。

本文所用的术语“环烷基”是指环状烷基，其可被(单-或多-)取代或未被取代。优选地，环烷基为C_3-12环烷基，更优选为C_3-6环烷基。适合的取代基包括，例如，一个或多个R⁶基团。

本文所用的术语“芳基”是指C_6-12芳香基团，其可被(单-或多-)取代或未被取代。典型的实例包括苯基和萘基等。适合取代基包括，例如，一个或多个R⁶基团。

式VIII化合物

如上所述，本发明一方面涉及式VIII化合物，或其可药用盐或酯。

在一个尤其优选的实施方案中，本发明涉及式VIIIa化合物，或其可药用盐或酯，

其中：

X为NR⁷；

R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；

R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或

R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；

R¹⁹为H、烷基、芳基或环烷基；

R⁶为OR⁸或卤素；且

R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。

在一个优选的实施方案中，R¹⁹为H、烷基或环烷基。

优选地，R¹为H或烷基，更优选为烷基。甚至更优选，R¹为甲基或乙基，更优选为Me。

优选地，R²为环烷基，更优选为C_3-6环烷基。甚至更优选，R²为环戊基或环己基，更优选为环戊基。

优选地，R⁷为H或烷基，更优选为H或甲基，甚至更优选为H。

在一个优选的实施方案中，R⁴和R^4′之一为烷基，且另一个为H或烷基。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′各自独立地为烷基。更优选，R⁴和R^4′均为甲基。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′均为H。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′一起形成螺环烷基，更优选为螺C_3-6环烷基。甚至更优选，R⁴和R^4′一起形成螺C₃或C₄环烷基，更优选为C₃环烷基。

在一个优选的实施方案中，R⁶为OR⁸，甚至更优选为OMe。

优选地，R¹⁹为环丙基。

在另一个尤其优选实施方案中，本发明涉及式VIIIb化合物，或其可药用盐或酯，

其中R¹、R²、R⁶、R⁴、R^4′和X如上定义。

在另一个尤其优选实施方案中，本发明涉及式VIIIc化合物，或其可药用盐或酯，

其中X、R¹、R²、R⁶、R⁴、R^4′和R¹⁹如上定义。

在一个尤其优选的实施方案中，所述式VIII化合物选自：

及其可药用盐和酯。

更优选，式VIII化合物选自：

或其可药用盐或酯。

甚至更优选，本发明的化合物为化合物[371]。

式VII化合物

本发明的一个方面涉及式VII化合物，或其可药用盐或酯，

其中：

X为NR⁷；

R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；

R⁴和R^4′各自独立地为H或烷基；或

R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；且

R⁶为OR⁸或卤素；且

R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。

优选地，R¹为烷基，更优选为甲基。

优选地，R²为环烷基，更优选为C_3-6环烷基。甚至更优选，R²为环戊基或环己基，更优选为环戊基。

优选地，R⁷为H或烷基，更优选为H或甲基，甚至更优选为H。

在一个优选的实施方案中，R⁴和R^4′之一为烷基，且另一个为H或烷基。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′各自独立地为烷基。更优选，R⁴和R^4′均为甲基。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′均为H。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′一起形成螺环烷基，更优选为螺C_3-6环烷基。更优选，R⁴和R^4′一起形成螺C₃或C₄环烷基，甚至更优选为C₃环烷基。

优选地，R⁶为OR⁸，甚至更优选为OMe。

在一个优选的实施方案中，式VII化合物选自：

及其可药用盐和酯。

式VI化合物

本发明的一方面涉及式VI化合物，或其可药用盐或酯，

其中：

X为NR⁷；

R¹和R²各自独立地为H、烷基或环烷基；

R⁴和R^4′之一为烷基，且另一个为H或烷基；或

R⁴和R^4′一起形成螺环烷基；

R¹⁸为H或烷基，其中所述烷基任选被R⁶取代；

每个R⁶独立地为OR⁸或卤素；且

R⁷和R⁸各自独立地为H或烷基。

优选地，R¹为烷基，更优选为甲基。

优选地，R²为环烷基，更优选为C_3-6环烷基。甚至更优选，R²为环戊基或环己基，更优选为环戊基。

优选地，R⁷为H或烷基，更优选为H或甲基，甚至更优选为H。

在一个优选的实施方案中，R⁴和R^4′之一为烷基，且另一个为H或烷基。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′各自独立地为烷基。更优选，R⁴和R^4′均为甲基。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′均为H。

在另一个优选实施方案中，R⁴和R^4′一起形成螺环烷基，更优选为螺C_3-6环烷基。甚至更优选，R⁴和R^4′一起形成螺C₃或C₄环烷基，甚至更优选为C₃环烷基。

优选地，R⁶为OMe或F。

优选地，R¹⁸为甲基或CH₂CH₂OH。

在一个优选的实施方案中，式VI化合物选自：

及其可药用盐和酯。

在一个尤其优选实施方案中，所述化合物为[254]，或其可药用盐或酯。

在一个高度优选实施方案中，所述化合物为化合物[254]的HCl盐，即4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺.HCl。

本发明的另一方面涉及化合物，其选自：

及其可药用盐和酯。

优选地，所述化合物选自：

及其可药用盐和酯。

有利地，本发明的一些化合物与本领域以前已知的结构相关的化合物相比对一种或多种激酶表现出改善的选择性。

在一个优选的实施方案中，本发明化合物对一种或多种激酶相比于一种或多种其它激酶表现出选择性。

例如，在一个优选的实施方案中，本发明化合物相比于一种或多种其它蛋白激酶能够优先抑制PLK家族激酶；因此，所述化合物相比于一种或多种其它蛋白激酶能够“选择性”抑制PLK家族激酶。本文所用的术语，“选择性”是指相比于一种或多种其它蛋白激酶对PLK具有选择性的化合物。优选地，对PLK家族激酶与一种或多种其它蛋白激酶的选择性比为大于约2∶1，更优选大于约5∶1或约10∶1，甚至更优选大于约20∶1，或50∶1或100∶1。选择性比可由本领域技术人员确定。

在一个尤其优选的实施方案中，本发明化合物表现出对于PLK1的选择性。因此，在一个优选的实施方案中，本发明化合物相比于一种或多种其它蛋白激酶能够优先抑制PLK1。优选地，对于PLK1与一种或多种其它蛋白激酶的选择性比为大于约2∶1，更优选大于约5∶1或约10∶1，甚至更优选大于约20∶1，或50∶1或100∶1。

在甚至更优选的实施方案中，本发明化合物相比于PLK2和/或PLK3表现出对于PLK1的选择性。因此，在一个优选的实施方案中，本发明化合物相比于PLK2和/或PLK3能够优选抑制PLK1。优选地，对于PLK1与PLK2和/或PLK3的选择性比为大于约2∶1，更优选大于约5∶1或约10∶1，甚至更优选大于约20∶1，或50∶1或100∶1。

示例性地列举，化合物[218]与所选的现有技术化合物相比，相比于PLK2和PLK3表现出对于PLK1的选择性。例如，本发明化合物[218]与WO 07/095188的化合物[I-64]相比对PLK1比PLK2的选择性是2倍，与WO 07/095188的化合物[I-76]相比选择性是约6倍，与化合物[I-4]相比选择性是约7倍。相似地，化合物[218]与WO 07/095188的化合物[I-64]相比对PLK1比PLK3的选择性是的5倍，与WO 07/095188的化合物[I-76]相比选择性是约12倍，且与化合物[I-4]相比选择性是约5倍。根据下述实施例可发现进一步的说明。

在另一个优选实施方案中，当与本领域已经已知的结构相关的化合物相比时，本发明化合物表现出优异的溶解度和/或药代动力学性质。

例如，化合物[254]相比于WO 07/095188的实施例[I-76]和[I-253]表现出优异的溶解度和/或药代动力学性质，从而使得这些化合物更适于治疗疾病。再次，这些比较研究的进一步说明可见于下述实施例中。

相似地，化合物[371]与本领域已知的结构相关的化合物相比，由于其全身暴露和口服生物利用度表现出有利的药代动力学性质。

本发明的一个优选实施方案涉及一小组的化合物，其特征为通过ATP-结合盒(ATP-bingding cassette，ABC)运载体(药物-反流泵P-糖蛋白(P-gp))的细胞反流低。已知P-gp反流物质通常表现出较差的口服吸收，因为P-gp能够将被吸收的药物运回消化道[Ambudkar S.V.，等人.(2003)Oncogene，22，7468-7485]。P-gp也能通过促进排泄到胆汁和尿中来降低物质的全身暴露。除了作为药物反流泵，ABC运载体能够通过升高的表达使肿瘤细胞产生耐药性。P-gp的表达是广泛已知的，其机理为癌细胞能够获得多药物耐受(MDR)[Gottesman M.M.，等人.(2002)Nat.Rev.Cancer，2，48-58]。一些来自正常表达P-gp的细胞的肿瘤能够表现出固有的耐药性[Ambudkar S.V.，等人.(2005)Trends Pharmacol.Sci.，26，385-387]。快速运输出细胞的药物在运载体表达的细胞中累积水平不高，由于药物-靶点相互作用降低，限制了治疗的成功。

因此，表现出低细胞反流的化合物强效用于口服治疗癌症、治疗上皮细胞源的肿瘤和药物耐受的恶性肿瘤，而且对于通过增加反流泵表达诱导耐药性具有更低的可能。本发明尤其优选的化合物表现出低细胞反流，包括化合物[371]、[372]和[377]-[391]。细胞存活测试和细胞反流研究的进一步说明见于实施例9和附图3中。

此外，在细胞存活测试中表现低MDR/亲代细胞不对称的本发明化合物与现有技术的化合物相比，在MDR肿瘤细胞中抑制PLK1更加有效。因此，这些化合物作为治疗PLK抑制剂更加有力。在A2780-A2780/ADR细胞系配对中检测PLK1抑制的实验说明在下述实施例中阐述。

治疗用途

已经发现本发明化合物具有抗增殖活性，并因此相信可用于治疗增生性疾病例如癌症、白血病和其他与细胞增殖失控有关的疾病，例如牛皮癣和再狭窄。

因此，本发明的一方面涉及本发明化合物或其可药用盐在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。

这里使用的术语“药物制备”除了其用于筛选其他抗增殖剂的方法外，包括一个或多个如上定义的化合物直接用作药物或在制备这样的药物的任何阶段中的用途。

如在此所定义的，在本发明的范围内的抗增殖效果可以由在体外全细胞测试中抑制细胞增殖的能力得到证明，例如使用AGS、H1299或SJSA-1中的任何一种细胞系来证明。利用这些测试，可以确定化合物在本发明的意义上是否具有抗增殖性的特性。

一个优选的实施方案涉及一个或多个本发明化合物在治疗增生性疾病中的用途。优选地，所述增生性疾病为癌症或白血病。在此时用的术语增生性疾病在广义上包括任何需要控制细胞周期的疾病，例如心血管疾病，例如再狭窄和心脏病；自体免疫性疾病，例如肾小球肾炎和类风湿性关节炎；皮肤病，例如牛皮癣；抗炎、抗真菌、抗寄生虫性疾病，例如疟疾、肺气肿和脱发症。在这些疾病中，本发明化合物可以根据需要在所需细胞内诱导细胞凋亡或者维持停滞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述增生性疾病为癌症或白血病，更优选癌症。

在一个优选的实施方案中，所述增生性疾病为实体瘤。

在另一个优选实施方案中，所述增生性疾病为血癌。优选地，所述血癌为白血病，更优选，晚期白血病或骨髓增生异常综合征(MDS)。其它实例包括急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

在另一个优选实施方案中，所述增生性疾病为肾小球肾炎。

在另一个优选实施方案中，所述增生性疾病为类风湿性关节炎。

在另一个优选实施方案中，所述增生性疾病为牛皮癣。

在另一个优选实施方案中，所述增生性疾病为慢性阻塞性肺病。

本发明化合物可以抑制细胞周期中的任一步骤或阶段，例如，核被膜的形成、从细胞周期的静止期(G0)退出、G1进展、染色体解聚、核被膜破裂、START、DNA复制的引发、DNA复制的进展、DNA复制的终止、中心体复制、G2进展、有丝分裂或减数分裂功能的激活、染色体聚集、中心体分离、微管成核、纺锤体生成与功能、与微管动力蛋白的相互作用、染色单体分离(separation)与隔开(segregation)、有丝分裂功能的失活、收缩环的生成和胞质分裂活动。具体地，本发明化合物可以影响某些基因功能，例如染色质结合、复制复合体的生成、复制许可、磷酸化或其它次级修饰活性、蛋白水解性降解、微管结合、肌动蛋白结合、septin结合、微管组织中心成核活性和与细胞周期信号通路成分的结合。

在本发明的一个实施方案中，本发明化合物以足以抑制至少一种PLK酶的量给药。

本发明的另一方面涉及一种治疗PLK-依赖性疾病的方法，所述方法包括向有此治疗需要的患者以足以抑制PLK的量给药本发明化合物或其可药用盐。

Polo-样激酶(PLK)由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族组成。在polo位点的有丝分裂果蝇melanogaster突变显示出纺锤体异常[Sunkel等人，J.Cell Sci.，1988，89，25]，并且发现polo编码有丝分裂激酶[Llamazares等人，GenesDev.，1991，5，2153]。在人体中，存在三种高度相关的PLK[Glover等人，Genes Dev.，1998，12，3777]。它们包含高度同源的氨基-端催化性激酶结构域并且其羧基端包含两个或三个保守区域，polo盒。目前不完全了解polo盒的功能，但是其参与将PLK靶向亚细胞区[Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，9301；Leung等人，Nat.Struct.Biol.，2002，9，719]、调节与其它蛋白的相互作用[Kauselmann等人，EMBO J.，1999，18，5528]或可构成自调节结构域部分[Nigg，Curr.Opin.Cell Biol.，1998，10，776]。此外，polo盒-依赖性PLK1活性对正确的中期/后期转换以及胞质分裂是必须的[Yuan等人，Cancer Res.，2002，62，4186；Seong等人，J.Biol.Chem.，2002，277，32282]。

研究表明人PLK调节有丝分裂的一些基本方面[Lane等人，J.Cell.Biol.，1996，135，1701；Cogswell等人，Cell Growth Differ.，2000，11，615]。具体地，认为PLK1活性对G2期后期/前期早期中的中心体的功能性成熟以及随后的双极纺锤体的形成是必需的。通过小干扰RNA(siRNA)技术消耗细胞PLK1也证明对于多重有丝分裂进化成和胞质分裂的完成需要该蛋白[Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，8672]。

在本发明更优选的实施方案中，本发明化合物以足以抑制PLK1的量给药。

在三种人PLK中，PLK1得到最好的表征；其调节多种细胞裂分周期活性(cell division cycle effect)，包括有丝分裂的起始[Toyoshima-Morimoto等人，Nature，2001，410，215；Roshak等人，Cell.Signalling，2000，12，405]、DNA-损害关卡激活[Smits等人，Nat.Cell Biol.，2000，2，672；van Vugt等人，J.Biol.Chem.，2001，276，41656]、后期促进复合物的调节[Sumara等人，Mol.Cell，2002，9，515；Golan等人，J.Biol.Chem.，2002，277，15552；Kotani等人，Mol.Cell，1998，1，371]、蛋白酶体的磷酸化[Feng等人，Cell Growth Differ.，2001，12，29]以及中心体的复制以及成熟[Dai等人，Oncogene，2002，21，6195]。

在一个特别优选的实施方案中，本发明化合物为PLK1的ATP-拮抗抑制剂。

在本发明中，ATP拮抗性指通过削弱或破坏ATP结合的方式可逆地或不可逆地在酶活性位点结合，抑制剂化合物减少或防止PLK催化活性，即从ATP磷酸转移至大分子PLK底物的能力。

在另一个优选的实施方案中，本发明化合物以足以抑制PLK2和/或PLK3的量给药。

本发明的另一方面涉及一种在细胞中抑制PLK的方法，包括使所述细胞与一定量的式I化合物，或可药用盐接触，使得在所述细胞中PLK被抑制。

本发明的另一方面涉及一种治疗增生性疾病的方法，包括通过向有此需要的受试者给药治疗有效量的式I化合物，或可药用盐来抑制PLK，从而治愈所述增生性疾病。

在另一个优选实施方案中，本发明化合物以足以抑制至少一种aurora激酶的量给药。优选地，所述aurora激酶为aurora激酶A、aurora激酶B或aurora激酶C。

本发明的另一方面涉及一种治疗aurora激酶-依赖性疾病的方法，所述方法包括向有此治疗需要的患者以足以抑制aurora激酶的量给药如上定义的本发明化合物或其可药用盐。

另一方面涉及本发明化合物在用于抑制蛋白激酶中的用途。

本发明的另一方面涉及一种抑制蛋白激酶的方法，所述方法包括将所述蛋白激酶与本发明化合物接触。

优选地，所述蛋白激酶选自aurora激酶和PLK。更优选，所述蛋白激酶为PLK，更优选为PLK1。

药物组合物

本发明的其它方面涉及药物组合物，其包括本发明化合物与一种或多种可药用稀释剂、赋形剂或载体。尽管本发明化合物(包括其可药用盐、酯以及可药用溶剂合物)可单独给药，通常它们与可药用载体、赋形剂或稀释剂一起给药，尤其是用于对人治疗的时候。药物组合物可用于人和兽医中人或动物使用。

本发明所述的各种不同形式的药物组合物的合适赋形剂的实例可见于“Handbook of Pharmaceutical Excipients，2nd Edition，(1994)，由A Wade和PJ Weller编著。

治疗用途的可接受的载体或稀释剂是制药领域中公知的，例如描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。

适宜的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。适宜的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。

药用载体、赋形剂或稀释剂可根据将要使用的给药途径以及标准的制药规范进行选择。药物组合物可包含作为或除了载体、赋形剂或稀释剂以外的任何适宜的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、助溶剂。

适宜的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖类如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜料、天然和合成的树胶，如阿拉伯树胶、黄蓍树胶或藻酸钠、羧基甲基纤维素和聚乙二醇。

适宜的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。

防腐剂、稳定剂、色素以及甚至调味剂可提供在本发明的药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸以及对羟基苯甲酸的酯类。也可使用抗氧化剂和助悬剂。

盐/酯

本发明的化合物可以以盐或酯的形式，尤其是可药用的盐或酯的形式提供。

本发明化合物的可药用盐包括它们适宜的酸加成盐或碱加成盐。适宜的可药用盐的评论可参见Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)。例如，盐为与以下酸形成的盐：强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未被取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未被取代或取代(如被卤代)的(C₁-C₄)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。优选地，所述盐为HCl盐。

取决于被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，如未被取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未被取代或取代(如被卤代)的(C₁-C₄)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。适宜的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未被取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷醇。

对映异构体/互变异构体

在上述讨论的本发明的所有方面中，本发明包括本发明化合物的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。

立体异构体和几何异构体

一些本发明的化合物可以以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如其可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可以以两种或多种立体异构和/或几何形式存在。本发明包括那些抑制剂试剂的所有单个立体异构体和几何异构体及其混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。

本发明还包括试剂或其可药用盐的所有适宜的同位素变体。本发明药物或其可药用盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子所取代的物质。可被掺入到药物和其可药用盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。本发明的药物和其可药用盐的一些同位素变体，例如结合放射性同位素如³H或¹⁴C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。含氚的即³H和碳-14即¹⁴C同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素如氘即²H的取代可因较大的代谢稳定性而提供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一些情况下是优选的。通常可使用合适试剂的适当同位素变体，通过常规步骤制备本发明药物和其可药用盐的同位素变体。

溶剂合物

本发明还包括本发明化合物的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。

多晶型物

本发明还涉及本发明试剂的各种结晶形式、多晶型形式和无水(水合)形式。众所周知，在制药工业中可通过稍微改变纯化和或分离方法，从在合成制备此类化合物的溶剂中，分离得到任一此类形式的化合物。

前药

本发明进一步包括前药形式的本发明化合物。这些前药通常为本发明化合物，其中一个或多个适合的基团被修饰使得当向人或哺乳动物受试者给药后该修饰可以被逆转。该逆转通常通过这些受试者中天然存在的酶进行，但也可以与该前药同时给药第二种试剂以在体内进行逆转。这些修饰的实例包括酯(例如，上述描述的那些中任一种)，其中该逆转可以以酯酶等进行。其它这些系统对于本领域技术人员是已知的。

给药

可调节本发明的药物组合物，使其适于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻、口腔或舌下给药途径。

对于口服给药，特别利用压缩片剂、药丸、片剂、凝胶剂(gellules)、滴剂和胶囊剂。优选地，这些组合物每剂包含1-250mg的有效成分，更优选包含10-100mg的有效成分。

其它给药形式包括溶液剂或乳剂，它们可经静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内给药，并由无菌或可灭菌溶液制备。本发明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏、乳膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液剂或扑粉(dusting powder)的形式。

经皮给药的替代方式是利用透皮贴片(skin patch)。例如，可将有效成分掺入到由聚乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10wt％的浓度将有效成分掺入到由白蜡或白色软石蜡基质与所需要的稳定剂和防腐剂共同组成的软膏内。

可注射形式每剂可包含10-1000mg的有效成分，优选10-250mg的有效成分。

组合物可被配制成单位剂型，即包含单位剂量或单位剂量的多重单位或亚单位的形式的离散部分。

剂量

本领域的普通技术人员无需过度试验就可容易地确定对患者给药的本发明组合物的适宜剂量。通常，医师会确定对个体患者最适宜的实际剂量，并且根据多种因素包括使用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性以及作用时间的长短、病人的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药的方式以及时间、排泄速率、药物组合以及具体疾病的严重程度以及接受治疗的个体进行调整。本文公开的剂量为一般情况的示例。当然也可有有益的较高或较低剂量范围个别情况，这都在本发明的范围内。

根据需要，可以以0.1-30mg/kg体重，如0.1-10mg/kg体重，更优选2-20mg/kg体重的剂量给药所述药物。

在示例性的实施方案中，向患者给药一个或多个剂量的10-150mg/天用于治疗恶性肿瘤。

组合

在特别优选的实施方案中，一或多种本发明化合物与一或多种其它的活性剂(例如，市场上提供的现有抗癌药物)组合给药。在这种情况下，本发明化合物可连续地，同时地或依次地与一或多种活性剂组合给药。

抗癌症药通常在组合使用的时候更有效。尤其地，为避免主要毒性作用、作用机制以及耐药机制的重叠，组合疗法是理想的。此外，也可以以最大耐受剂量并在这些剂量之间以最小的时间间隔给药大多数药物也是理想的。化学治疗药物组合的主要优势在于可能通过生化相互作用促进加和的或可能的协同作用，并且也可能降低在早期肿瘤细胞中的耐药性的出现，后者响应于用单药进行的初始化疗。生化相互作用在选择药物组合时的用途的实例通过下述事实得到证实：施用亚叶酸增加5-氟尿嘧啶的活性细胞内代谢物对其靶标胸苷酸合酶的结合，从而增加其细胞毒性活性。

许多组合药物目前已经用于癌症和白血病的治疗中。医学实践的更广泛的综述可见“Oncologic Therapies”，由E.E.Vokes和H.M.Golomb编著，由Springer出版。

通过研究受试化合物与已知的或认为在最初治疗具体的癌症中或衍生自癌症的细胞系中有价值的化合物的抑制活性，从而可建议有利的组合。这种方法也可用于测定施用药物的顺序，即，之前、同时或之后。所述的给药方案可为这里鉴别的所有细胞周期作用药物的特征。

方法

另一方面涉及一种制备本发明化合物的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)将式(II)化合物转化为式(IV)化合物，直接或经过分离式(III)化合物；和

(ii)将所述式(IV)化合物转化为式(I)化合物

优选地，步骤(i)包括在EtOH/H₂O中加热所述式(II)化合物与NH₄Cl和Fe。

本发明进一步通过下述非限制性实施例进行说明，且参考下述附图，其中：

图1显示的是对于所检测的每种化合物，化合物A-H的血浆浓度对时间的曲线下面积(AUC)。这些实验中给予的溶媒保持恒定(静脉内＝柠檬酸盐缓冲液pH3，1mL/kg；口服＝DMA/PEG400/10mM酒石酸盐缓冲液，pH4(1∶3∶6)，5ml/kg)；

图2显示的是与图1相同的数据，除了是以每种化合物的口服生物利用度(％F)的形式。

图3显示的是在亲代和MDR肿瘤细胞中所选化合物与现有技术化合物A′-J′的比较(表8中所定义)。不对称比例(Asymmetry ratios)以相对于化合物[378]表示。

实施例

通用实验

化学品和溶剂购自商业来源，且除非另有说明以得到状态使用。除非另有说明，使用无水MgSO₄作为有机溶液的标准干燥剂。NMR谱使用Varian INOVA-500仪器记录。化学位移以相对于四甲基硅烷内标的百万分之一报导。偶合常数(J)精确到0.1Hz。使用下述缩写：s，单峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；qu，五重峰；m，多重峰；和br，宽峰。质谱使用Waters ZQ2000单四级杆质谱仪(带有电喷雾离子化(ESI))而获得。分析和制备RP-HPLC使用Vydac 218TP54(250x4.6mm)和Vydac 218TP1022(250x22mm)柱进行，使用线性梯度的水/乙腈系统洗脱液(含0.1％三氟乙酸)，流速1mL/分钟(分析)和9mL/分钟(制备)。所用的分析梯度如下：

或者Xbridge(100x4.6mm)和Xbridge(100x19mm)柱使用线性梯度的水/乙腈系统(含0.1％氢氧化铵)，流速为1mL/分钟(分析)和20mL/分钟(制备)。

所用的分析梯度如下：

对于快速色谱法，使用硅胶(EM Kieselgel 60，0.040-0.063mm，Merck)或ISOLUTE预填充柱(Biotage)。

缩写：

DIPEA 二异丙基乙基胺

DCM 二氯甲烷

DMF 二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

EtOAc 乙酸乙酯

EtOH 乙醇

HCl 盐酸

K₂CO₃ 碳酸钾

MeI 碘甲烷

MeOH 甲醇

MgSO₄ 硫酸镁

NaH 氢化钠

NaCl 氯化钠

NH₄Cl 氯化铵

RM 反应混合物

rt 室温

TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐

TFA 三氟乙酸

TFE 2，2，2-三氟乙醇

THF 四氢呋喃

实施例1

化合物[2]：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

1.亚硫酰氯(2.1当量)，MeOH，于0℃添加，回流2小时；2.环戊酮(0.77当量)，乙酸钠(0.77当量)，三乙酰氧基硼氢化钠(1.11当量)，DCM，室温16小时；3.2，4-二氯-5-硝基嘧啶(1.1当量)，K₂CO₃(1当量)，丙酮，0℃-室温16小时；4.NH₄Cl(8.5当量)，Fe(8当量)，EtOH/H₂O(4∶1)，回流2.5小时；-未分离5.MeI(1.18当量)，NaH(1.07当量)，DMF，-10℃-室温，3小时；6.4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.5当量)，浓HCl，H₂O/EtOH(4∶1)，回流48小时；7.DIPEA(2当量)，TBTU(1.1当量)，4-氨基甲基哌啶(1.2当量)，DCM，室温16小时。

步骤1：3-氨基丙酸甲基酯

将β-丙氨酸(9.37g，0.105mol)添加到MeOH(50ml)中，且使用冰浴将混合物冷却至0℃，然后滴加亚硫酰氯[小心：添加放热]。添加完成后，将反应温热至室温，然后回流2小时。然后减压下蒸发溶剂，且所得油状物用叔丁基甲基醚处理，滤出所得结晶，并进一步在真空中干燥，得到白色晶体固体(11g，定量)；¹H(DMSO-d₆)：δ2.73(dd，J＝7Hz，2H，CH₂)，2.98(dd，J＝7Hz，2H，CH₂)，3.61(s，3H，CH₃)，8.28(bs，2H，NH₂)；MS+ve：104.1。

步骤2：3-(环戊基氨基)丙酸甲基酯

将3-氨基丙酸甲基酯(9.37g，0.09mol)溶解于DCM(200ml)中，并加入环戊酮(6.43ml，0.07mol)，乙酸钠(5.96g，0.07mol)和三乙酰氧基硼氢化钠(22g，0.10mol)。反应在室温搅拌16小时。然后添加20％碳酸氢钠(100ml)和2M氢氧化钠(50ml)，且产物使用DCM/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，使用MgSO₄干燥，过滤，并将滤液在减压下蒸发，并在真空中进一步干燥，得到产物，为淡黄色油状物(8.90g，55％)；MS+ve：172.4。

步骤3：3-[环戊基(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]丙酸甲基酯

将3-(环戊基氨基)丙酸甲基酯(838mg，0.005mol)和K₂CO₃(676mg，0.005mol)添加到丙酮(5ml)中，且使用冰浴将所得混合物冷却至0℃，然后添加2，4-二氯-5-硝基嘧啶(1.044g，1.1当量)。然后将反应混合物(RM)温热至室温，并再继续搅拌16小时，然后再添加0.12当量的嘧啶。然后再继续搅拌3小时。然后减压下蒸发反应混合物，且产物使用EtOAc/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，使用MgSO₄干燥，过滤，并将滤液在减压下蒸发，并进一步在真空中干燥，得到产物，为褐色油状残余物(1.04g，65％)；R_t＝16分钟(Vydac 1)；ME+ve：329.1。

步骤4：2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-6H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

将3-[环戊基(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]丙酸甲基酯(1.00g，0.003mol)和NH₄Cl(1.38g，0.025mol，8.5当量)添加到EtOH/H₂O(4∶1ml，10ml)中，并将混合物加热至回流，然后分批添加铁粉(1.36g，0.024mol，8当量)。然后将反应混合物再回流2小时。反应过程通过HPLC监测，且当没有存留的SM时，通过硅藻土趁热过滤反应混合物。硅藻土用EtOAc(10ml)和EtOH(10ml)[都是热的]洗涤，并将滤液在减压下蒸发，并进一步在真空中干燥，得到产物，为褐色固体(350mg，43％)；R_t＝12分钟(Vydac 1)；MS+ve：267.2。

步骤5：2-氯-9-环戊基-5-甲基-5，7，8，9-四氢-6H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

将2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-6H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮(318mg，0.0012mol)和MeI(88μl，0.0014mol，1.18当量)添加到DMF(5ml)中，并使用丙酮/干冰将溶液冷却至-10℃，然后添加NaH(30mg，0.0013mol，1.07当量)。然后反应混合物于0℃搅拌30分钟，并于室温搅拌30分钟。浓缩反应混合物，且产物使用EtOAc/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，使用MgSO₄干燥，过滤，并将滤液在减压下蒸发，并进一步在真空中干燥，得到产物，为紫色油状残余物(252mg，75％)；R_t＝13分钟(Vydac1)；MS+ve：281.2。

步骤6：(化合物[1])4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-苯甲酸

偶联方法A

将2-氯-9-环戊基-5-甲基-5，7，8，9-四氢-6H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮(248mg，0.0009mol)和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(221mg，0.0013mol，1.5当量)，浓HCl(152μl)和H₂O/EtOH(8∶2ml)添加到RBF中，并将所得反应混合物加热至回流，持续4小时。反应进程通过HPLC监测，且当没有剩余起始原料时(4小时的反应时间)，在减压下浓缩反应混合物，且产物使用DCM/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，使用MgSO₄干燥，过滤，并将滤液在减压下蒸发，并进一步在真空中干燥，得到褐色油状残余物。将几滴MeOH添加到残余物中，且通过抽滤收集形成的固体ppt，用MeOH洗涤，并进一步在真空中干燥，得到产物，为紫色固体(51mg，14％)；R_t＝11.2分钟(0_60_20分钟，纯度100％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.61(bs，4H，环戊-H)，1.72(bs，2H，环戊-H)，1.94(bs，2H，环戊-H)，2.59(dd，J＝4.5Hz，2H，CH₂)，3.18(s，3H，CH₃)，3.63(dd，J＝4.5Hz，2H，CH₂)，3.95(s，3H，CH₃)，7.51(s，1H)，7.56(d，J＝8Hz，1H，苯-H)，7.82(s，1H，8.10(s，1H，8.47(d，J＝8.5Hz，1H，苯-H)，12.64(bs，1H，NH)；MS+ve：412.2。

步骤7：(化合物[2])：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

将4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-苯甲酸(35mg，0.085mmol)，DIPEA(28μl，0.17mmol，2当量)和TBTU(30mg，0.093mmol，1.1当量)添加到3ml DCM中，并将所得溶液于室温搅拌30分钟，然后添加4-氨基甲基哌啶(13μl，0.10mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌16小时。浓缩反应混合物，且产物使用DCM/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，使用MgSO₄干燥，过滤，并将滤液在减压下蒸发，并进一步在真空中干燥，得到黄色油状残余物(21mg，49％)；R_t＝9.86分钟(0_60_20分钟，纯度100％)；¹H NMR(CD₃OD)：δ1.69-1.75(m，6H)，1.82(bs，2H)，1.96-1.99(m，2H)，2.03-2.05(bs，2H)，2.18-2.23(m，2H)，2.34(s，3H，CH₃)，2.68(dd，J＝4.5Hz，2H，CH₂)，2.95-2.97(m，2H)，3.28(s，3H，CH₃)，3.73(dd，J＝4.5Hz，2H，CH₂)，3.89-3.94(m，1H，CH)，4.01(s，3H，CH₃)，4.91-4.96(m，1H，CH)，7.49-7.51(m，2H)，8.02(bs，1H)，8.50(d，J＝8.5Hz，1H，苯-H)；MS+ve：508.2。

氨基酯中间体

下述中间体使用实施例1，步骤2中所述的方法制备：

3-环戊基氨基-丁酸甲基酯

MS+ve：186.3。

3-环己基氨基-丁酸甲基酯

MS+ve：200.3。

3-环戊基氨基-2-甲基-丙酸甲基酯

¹H NMR(CDCl₃)：1.18(3H，d，J 7Hz，CH3)，1.33(2H，m，CH2)，1.53(2H，m，CH2)，1.67(2H，m，CH2)，1.82(2H，m，CH2)，2.63(2H，m，CH2)，2.87(1H，m，CH)，3.06(1H，m，CH)，3.69(3H，s，OCH3)。

3-环己基氨基-丙酸甲基酯

MS+ve：186.4。

3-环戊基氨基-4-甲基-戊酸甲基酯

¹H NMR(CDCl₃)：1.18(3H，d，J 7Hz，CH3)，1.33(2H，m，CH2)，1.53(2H，m，CH2)，1.67(2H，m，CH2)，1.82(2H，m，CH2)，2.63(2H，m，CH2)，2.87(1H，m，CH)，3.06(1H，m，CH)，3.69(3H，s，OCH3)。

3-(1-乙基-丙基氨基)-丙酸甲基酯

¹H NMR(CDCl₃)：0.89(6H，t，J 8Hz，CH3)，1.44(4H，m，CH2CH3)，1.77(1H，bs，NH)，2.39(1H，m，CH)，2.53(2H，m，CH2)，2.89(2H，m，CH2)，3.69(3H，s，OCH3)。

3-(四氢-吡喃-4-基氨基)-丙酸甲基酯

¹H NMR(CDCl₃)：1.41(2H，m，CH2)，1.86(2H，m，CH2)，2.54(2H，m，CH2)，2.71(1H，m，CH)，2.95(2H，m，CH2)，3.44(2H，t，J 11.5Hz，CH2)，3.71(3H，s，OCH3)，3.99(2H，d，J 11Hz，CH2)。

1-环戊基氨基甲基-环丙烷羧酸甲基酯

¹H NMR(CDCl₃)：0.84(3H，t，J 7Hz，CH3)，1.25(4H，m，CH2)，1.37(2H，m，CH)，1.54(2H，m，CH)，1.70(2H，m，CH)，1.83(2H，m，CH)，2.71(2H，s，CH2)，3.10(1H，m，CH)，4.16(2H，q，J 7Hz，CH2CH3)。

3-环戊基氨基-2，2-二甲基-丙酸乙基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.19(6H，s，CH3)，1.25(3H，t，J 7Hz，CH3)，1.28(2H，m，CH)，1.49(2H，m，CH)，1.65(2H，m，CH)，2.64(1H，s，CH2)，3.01(1H，m，CH)，4.10(2H，q，J 7.5Hz，CH2)。

可替代性方法步骤2a：3-氨基丙酸甲基酯

于-60℃(干冰，丙酮)，将丙烯酸甲基酯(4.50ml，4.302g，49.97mmole，0.99当量)滴加到环戊基胺(5.00ml，4.315g，50.68mmole)在甲醇(120ml)中的溶液中。将反应混合物温热至室温，并搅拌过夜。移除溶剂(减压，真空)得到产物，为油状物(8.236g，96％粗产率)。质子NMR表明产物含有～25％的二烷基化的副产物。

下述化合物通过相似方法制备。

3-苯基氨基-丙酸乙基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.29(3H，t，J 7.5Hz，CH3)，2.64(2H，t，J 6.5Hz，CH2)，3.48(2H，t，J 6.5Hz，CH2)，4.18(2H，q，J 7Hz，CH2)，6.65-6.74(5H，m，Ar-H)。

硝基嘧啶中间体

下述中间体也通过实施例1步骤3中描述的方法制备：

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-丁酸甲基酯

R_t＝18.0分钟(0_60_20分钟)；MS+ve：343.20。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环己基-氨基]-丁酸甲基酯

MS+ve：357.2。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2-甲基-丙酸甲基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.22(3H，d，J 12Hz，CH3)，1.57(2H，m，CH2)，1.76(2H，m，CH2)，1.93(2H，m，CH2)，1.98(2H，m，CH2)，3.18(1H，s，CH)，3.61(3H，m，CH+CH2)，3.68(3H，s，OCH3)，8.74(1H，s，Pyr-H)。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环己基-氨基]-丙酸甲基酯

Rt＝17.6分钟(Vydac 1)；MS+ve：343.1。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-4-甲基-戊酸甲基酯

¹H NMR(CDCl3)：0.94(6H，t，J 7Hz)，1.45-1.82(7H，m，3x CH2+CH)，2.17(1H，m，CH)，2.69(2H，m，2x CH)，3.35(2H，m，CH2)，2.58(1H，m，CH)，3.73(3H，s，OCH3)，8.64(1H，s，Pyr-H)。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-(1-乙基-丙基)-氨基]-丙酸甲基酯

MS(+ve)331.1，333.1。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-(四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸甲基酯

MS(+ve)345.1，347.0；tR＝12.62分钟(Vydac 1)。

3-[苄基-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-氨基]-丙酸乙基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.26(3H，t，J 7Hz，CH3)，2.73(2H，t，J 7Hz，CH2)，3.85(2H，m，CH2)，4.16(2H，q，J 7Hz，CH2)，4.71(2H，s，CH2)，7.20(2H，m，Ar-H)，7.37(3H，m，Ar-H)，8.69(1H，s，Pyr-H)。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-苯基-氨基]-丙酸乙基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.22(3H，t，J 7.5Hz，CH3)，2.73(2H，t，J 7Hz，CH2)，4.09(2H，q，J 7Hz，CH2)，4.43(2H，t，J 7Hz，CH2)，7.14-7.48(5H，m，Ar-H)，8.57(1H，s，Pyr-H)。

1-{[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-甲基}环丙烷羧酸乙基酯

MS(+ve)381.1，383.3；tR＝4.80分钟(XBridge 1)。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2，2-二甲基-丙酸乙基酯

MS(+ve)371.1，373.1；tR＝4.67分钟(XBridge 1)。

氨基嘧啶-酯得到氯嘧啶-二氮杂

下述化合物如实施例1，步骤4中所示由还原反应中分离，为未环化的中间体。

3-[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-苄基-氨基]-丙酸乙基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.26(3H，t，J 7.5Hz，CH3)，2.73(2H，t，J 7Hz，CH2)，3.86(2H，t，J 7Hz，CH2)，4.14(2H，q，J 7Hz，CH2)，4.86(2H，s，CH2)，7.26-7.39(5H，m，Ar-H)，7.94(1H，s，Pyr-H)。

3-[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-苯基-氨基]-丙酸乙基酯

MS(+ve)321.2，323.2；tR＝3.54分钟(XBridge 1)。

1-{[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-甲基}-环丙烷羧酸乙基酯

MS(+ve)339.2，341.2；tR＝4.15分钟(XBridge 1)。

3-[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2，2-二甲基-丙酸乙基酯

MS(+ve)341.2，343.2；tR＝4.25分钟(XBridge 1)。

然后上述化合物使用下述方法环化。

将相关化合物(5mmol)在DMF(10ml)中加热至140℃，保持2小时。在真空中蒸发溶剂，加入乙酸乙酯(10ml)，且过滤所得固体，并在真空下干燥，得到下列化合物。

注：该反应也可用DMSO/NaH进行。

9-苄基-2-氯-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

¹H NMR(DMSO)：2.72(2H，m，CH2)，3.67(2H，m，CH2)，4.86(2H，s，CH2)，7.26-7.37(5H，m，Ar-H)，7.88(1H，s，Pyr-H)，9.77(1H，s，NH)。2-氯-9-苯基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)275.2，277.2；tR＝2.80分钟(XBridge 1)。

2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-7，1′-环丙烷]-6-酮

MS(+ve)293.2，295.2；tR＝3.48分钟(XBridge 1)。

2-氯-9-环戊基-7，7-二甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)295.1，297.2；tR＝3.58分钟(XBridge 1)。

烷基化的二氮杂酮

下述中间体也通过实施例1，步骤5中所述的方法制备：

2-氯-9-环戊基-5，8-二甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

R_t＝14.6分钟(Vydac 1)；MS+ve：295.2。

2-氯-9-环戊基-5，7-二甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)295.1，297.2；tR＝9.11分钟(XBridge 2)。

2-氯-9-环戊基-8-异丙基-5-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)323.1，325.1；tR＝10.17分钟(XBridge 2)。

2-氯-9-环戊基-5-乙基-7-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

¹H NMR(CDCl3)：1.08(6H，m，2x CH3)，1.38(1H，m，CH)，1.55-1.70(5H，m，CH+CH2)，1.70(1H，m，CH)，2.10(1H，m，CH)，2.73(1H，m，CH)，3.48(2H，m，CH2)，4.03(1H，m，CH)，4.72(1H，m，CH)，7.98(1H，s，Pyr-H)。

2-氯-9-(1-乙基-丙基)-5-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)283.2，285.1；tR＝8.44分钟(XBridge 2)。

2-氯-9-(1-乙基-丙基)-5-乙基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)297.12，299.14；tR＝3.67分钟(XBridge 2)。

2-氯-5-甲基-9-(四氢-吡喃-4-基)-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)297.1，299.2；tR＝5.74分钟(XBridge 2)。

9-苄基-2-氯-5-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)303.1，305.2；tR＝13.57分钟(Vydac 1)。

2-氯-5-甲基-9-苯基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)289.1，291.1；tR＝2.93分钟(XBridge 2)。

2-氯-9-环戊基-5-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-7，1′-环丙烷]-6-酮

MS(+ve)307.1，309.2；tR＝3.67分钟(XBridge 2)。

2-氯-9-环戊基-5，7，7-三甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)309.1，311.2；tR＝3.90分钟(XBridge 2)。

偶联的嘧啶二氮杂酮

下述通过实施例1，步骤6，偶联方法A中所述的方法制备：

化合物[3]：4-(9-环戊基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸

紫色固体(29％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.33(d，J＝Hz，3H，CH₃)，1.52-1.58(m，3H，环戊-H)，1.70-1.78(m，3H，环戊-H)，1.87-1.93(m，2H，环戊-H)，2.97-3.00(m，2H，CH₂)，3.94(s，3H，CH₃)，4.15-4.17(m，1H，CH)，4.93-4.97(m，1H，CH)，7.59-7.60(m，2H)，7.82(1，1H)，8.01(d，J＝9Hz，1H，苯-H)，9.55(bs，1H，OH)，9.96(s，1H)；MS+ve：426.2。R_t＝11.08分钟(纯度100％，(Vydac 1))。

化合物[4]：4-(9-环戊基-5，8-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸

紫色固体(67％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.26(d，J＝Hz，3H，CH3)，1.43-1.93(m，8H，环戊-H)，2.52(s，3H，CH3)，2.99-3.02(m，2H，CH2)，3.96(s，3H，CH3)，4.13-4.16(m，1H，CH)，4.65-4.69(m，1H，CH)，7.60-7.61(m，2H)，8.06(d，J＝9Hz，1H，苯-H)，8.17(s，1H)，9.35(bs，1H)；MS+ve：426.2。R_t＝11.59分钟(纯度96％，(Vydac 1))。

化合物[5]：4-(9-环己基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸

褐色固体(12％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.27(d，J＝6.5Hz，3H，CH₃)，1.58-1.87(m，10H，环己烷-H)，2.85-2.88(m，2H，CH₂)，3.94(s，3H，CH₃)，4.21-4.23(m，1H，CH)，4.77(bs，1H，CH)，7.03(s，1H)，7.13(s，1H)，7.23(s，1H)，7.57-7.58(m，2H)，7.086(s，1H)，8.07-8.08(m，1H)，9.89(bs，1H，NH)；ME+ve：426.2。R_t＝11.58分钟(纯度90％，(Vydac 1))。

化合物[6]：4-(9-环戊基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸

紫色固体(13％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.55-1.86(m，8H，环戊-H)，2.70-2.73(m，2H，CH₂)，3.70-3.72(m，2H，CH₂)，5.02-5.09(m，1H，CH)，7.57-7.59(m，2H)，7.77(s，1H，嘧啶-H)，8.06(d，J＝8.5Hz，1H，苯-H)，9.54(bs，1H，OH)，9.75(s，1H，NH)；MS+ve：398.2。R_t＝10.55分钟(纯度96％，(Vydac 1))。

化合物[7]：4-(9-环戊基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-苯甲酸

灰白色固体(10％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.27(d，J＝6.5Hz，3H，CH₃)，1.46-1.90(m，8H，环戊-H)，2.83-2.86(m，2H，CH₂)，4.07-4.09(m，1H，CH)，5.04-5.09(m，1H，CH)，7.20(dd，J＝3.5和8.5Hz，2H，苯-H)，7.79(d，J＝2.0Hz，1H，嘧啶-H)，7.86(d，J＝8.5Hz，2H，苯-H)，9.78(bs，1H，NH)；MS+ve：382.2。R_t＝10.46分钟(纯度90％，(Vydac 1))。

化合物[8]：4-(9-环戊基-5，8-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-苯甲酸

灰白色固体(25％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.19(d，J＝6.0Hz，3H，CH₃)，1.32-2.10(m，8H，环戊-H)，2.73-2.76(m，2H，CH₂)，3.22(s，3H，CH₃)，4.04(m，1H，CH，4.70-4.75(m，1H，CH，7.78-7.85(m，4H，苯-H)，8.12(s，1H，嘧啶-H)，9.68(bs，1H，NH)；MS+ve：394.0。R_t＝11.05分钟(纯度96％，(Vydac1))。

化合物[9]：4-(9-环己基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸

褐色固体(15％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.15-1.86(m，10H，环己烷-H)，2.72(dd，J＝4.5Hz，2H，CH₂)，3.75(dd，J＝4.5Hz，2H，CH₂)，3.96(s，3H，CH₃)，4.58-4.63(m，1H，CH)，7.58-7.60(m，2H)，7.79(s，1H，嘧啶-H)，8.16(d，J＝8.5Hz，1H，苯-H)，9.74(bs，1H，NH)；MS+ve：412.2。R_t＝11.19分钟(纯度100％，(Vydac 1))。

化合物[10]：9-环己基-2-(4-羟基-苯基氨基)-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

紫色固体(7％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.17-1.87(m，10H，环己烷-H)，2.72(bs，2H，CH₂)，3.72(bs，2H，CH₂)，4.62-4.66(m，1H，CH)，6.82(d，J＝8.5Hz，2H，苯-H)，7.13(s，1H)，7.23(s，1H)，7.34-7.37(m，3H，2x苯-H和NH)；MS+ve：354.2。R_t＝10.63分钟(纯度100％，(Vydac 1))。

化合物[11]：9-环戊基-2-(4-羟基-苯基氨基)-7-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

¹H NMR(CD3OD)：1.18(3H，d，J 7Hz，CH3)，1.52(1H，m，CH)，1.61-1.84(6H，m，CH)，1.99(1H，m，CH)，2.85(1H，m，CH)，3.53(2H，m，CH)，5.14(1H，m，CH)，6.74(2H，m，Ar-H)，7.34(2H，m，Ar-H)，7.64(1H，s，Pyr-H)；MS(+ve)：354.2；tR＝10.85分钟(Vydac 1)。

化合物[12]：9-环戊基-2-(4-羟基-苯基氨基)-8-异丙基-5-甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

¹H NMR(DMSO)：0.72(3H，d，J 7Hz，CHCH3)，0.85(2H，d，J7Hz，CHCH3)，1.29(1H，m，CH)，1.51(4H，m，CH)，1.60(2H，m，CH)，1.93(1H，m，CH)，2.08(1H，m，CH)，2.29(2H，m，2x CH)，3.13(3H，s，N-CH3)，3.82(1H，m，CH)，4.15(1H，m，CH)，6.65(2H，d，J 6Hz，Ar-H)，7.47(2H，d，J 6Hz，Ar-H)，8.14(1H，s，Pyr-H)，8.99(1H，s，NH)；MS(+ve)：396.1；tR＝12.54分钟(Vydac 1)。

化合物[13]：9-环戊基-2-(4-羟基-苯基氨基)-5，8-二甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

白色固体(27％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.22(d，J＝6.5Hz，3H，CH₃)，1.38-1.85(m，8H，环戊-H)，2.49-2.53(m，2H，CH₂)，3.18(s，3H，CH₃)，4.05-4.10(m，1H，CH)，4.51-4.60(m，1H，CH)，6.80(d，J＝9.0Hz，2H，苯-H)，7.22(d，J＝9.0Hz，2H，苯-H)，7.98(s，1H，嘧啶-H)，9.53(bs，1H，OH)，10.05(bs，1H，NH)；MS+ve：368.3。R_t＝10.81分钟(纯度93％，(Vydac 1))。

化合物[14]：4-(9-苄基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸

¹H NMR(DMSO)：2.72(2H，m，CH2)，3.68(2H，m，CH2)，3.90(3H，s，OCH3)，4.88(2H，s，CH2)，7.22-7.44(6H，m，Ar-H)，7.44(1H，s，Ar-H)，7.77(1H，s，Pyr-H)，8.10(1H，d，J 7Hz)，8.18(1H，s，NH)；MS(+ve)：434.2；tR＝10.97分钟(Vydac 1)。

化合物[15]：4-(5-甲基-6-氧代-9-苯基-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-苯甲酸

¹H NMR(DMSO)：2.84(2H，m，CH2)，3.28(3H，s，CH3)，4.08(2H，m，CH2)，7.24(2H，d，J 8.5Hz，Ar-H)，7.35-7.37(3H，m，Ar-H)，7.47-7.52(4H，m，Ar-H)，8.29(1H，s，Pyr-H)，9.77(1H，s，NH)；MS(+ve)：390.2；tR＝1.93分钟(XBridge 2)。

化合物[16]：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-苯甲酸

¹H NMR(DMSO)：1.09(6H，s，CH3)，1.60(4H，m，CH)，1.74(2H，m，CH)，1.88(2H，m，CH)，3.19(3H，s，N-CH3)，3.37(2H，s，CH2)，5.23(1H，s，CH)，7.82(4H，m，Ar-H)，7.99(1H，s，Pyr-H)，9.57(1H，s，NH)；MS(+ve)：410.25；tR＝2.25分钟(XBridge 2)。

氨基-苯甲酰胺的制备和反应

4-氨基-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

向在二氯甲烷(50ml)中的4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.064g mg，6.37mmol)中加入DIPEA(2.22ul，12.74mmol)和TBTU(2.25g，7.0mmol)，并搅拌混合物10分钟。加入4-氨基-1-甲基哌啶(0.872g，7.65mmol)，并继续搅拌16小时。过滤所得固体，并在真空下干燥(1.04g，3.95mmol，62％)。

¹H NMR(DMSO)：1.54(2H，m，CH)，1.68(2H，m，CH)，1.90(2H，m，CH)，2.15(3H，s，N-CH3)，2.76(2H，d，J 11.5Hz，CH)，3.66(1H，m，CH)，3.77(3H，s，OCH3)，6.56(1H，m，Ar-H)，7.26(1H，m，Ar-H)，7.75(1H，d，J 7.5Hz)；MS(+ve)264.4；tR＝7.45分钟(Vydac 2)。

下述氨基-苯甲酰胺通过相似方法制备：

4-氨基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺，经由[4-(1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-苯基]-氨基甲酸叔丁基酯

[4-(1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-苯基]-氨基甲酸叔丁基酯¹H NMR(DMSO)：1.44(9H，s，C(CH3)3)，1.52(2H，m，CH)，1.71(2H，m，CH)，1.92(2H，m，CH)，1.92(3H，s，N-CH3)，2.74(2H，m，CH)，3.68(1H，m，N-CH)，7.47(2H，d，J 8.5Hz，Ar-H)，7.72(2H，d，J 8.5Hz，Ar-H)，8.00(1H，d，J 7.5Hz，NH)，9.54(1H，s，NH)。

当使用偶联方法B(下述)时，使用该化合物而没有预先脱保护。

偶联方法B

化合物[17]：4-(9-环戊基-5，7-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

将苯胺(149mg，0.57mmol)，嘧啶(53mg，0.19mmol)和TFA(109μl，0.95mmol)在2，2，2-三氟乙醇(5ml)中加热至回流，保持18小时。蒸发溶剂，加入乙酸乙酯(10ml)，并用饱和NaHCO₃，用盐水洗涤，蒸发溶剂。加入乙酸乙酯(10ml)，并过滤所得固体，并在真空下干燥(30mg，0.06mmol，30％)。

¹H NMR(DMSO)：1.06(3H，d，J 7Hz，CHCH3)，1.52-1.78(10H，m，烷基CH+CH2)，2.01(2H，m，CH)，2.36(3H，s，N-CH3)，2.73(1H，m，CH)，2.85(2H，m，CH)，3.45(1H，m，CH)，3.71(1H，m，CH)，3.94(3H，s，OCH3)，5.06(1H，m，CH)，7.46(2H，m，Ar_h)，7.61(1H，s，Ar-H)，7.77(1H，s，NH)，8.10(1H，d，J8Hz，Ar-H)，8.36(1H，d，J 8Hz)，Ar-H)，9.44(1H，s，NH)；MS(+ve)：508.2；tR＝7.30分钟(XBridge 2)。

下述化合物以与上述实施例相似的方法制备：

化合物[18]：4-(9-环戊基-7-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：1.08(3H，d，J 7Hz，CHCH3)，1.53-1.80(10H，m，烷基CH+CH2)，2.01(2H，m，CH)，2.12(2H，m，CH)，2.29(3H，s，N-CH3)，2.75(1H，m，CH)，2.90(2H，m，CH)，3.48(1H，m，CH)，3.77(1H，m，CH)，5.11(1H，m，CH)，7.78(4H，m，Ar-H)，8.04(1H，d，J 7.5Hz，NH)，9.35(1H，s，CONH)，9.43(1H，s，CONH)；MS(+ve)：478.2；tR＝6.74分钟(XBridge 2)。

化合物[19]：4-(9-环戊基-8-异丙基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(CD3OD)：0.92(3H，d，J 6.5Hz，CHCH3)，1.04(3H，d，J 6Hz，CHCH3)，1.65-1.97(14H，m，烷基CH+CH2)，2.25(2H，dd，J 11.5Hz，11.5Hz，CH)，2.36(3H，s，N-CH3)，2.67(1H，m，CH)，3.03(3H，m，CH+CH2)，3.51(1H，m，CH)，3.95(1H，m，CH)，4.02(3H，s，OCH3)，5.09(1H，m，CH)，7.59(2H，m，Ar-H)，7.87(1H，s，pyr-H-H)，8.46(1H，d，J 7Hz，Ar-H)；MS(+ve)：536.3；tR＝7.68分钟(XBridge 2)。

化合物[20]：4-(9-环戊基-5，7-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：1.02(3H，d，J 6.5Hz，CHCH3)，1.54-1.80(12H，m，烷基CH+CH2)，2.10(3H，m，(CH+CH2)，2.27(3H，s，N-CH3)，2.84(3H，m，CH3)，3.15(3H，s，CH3)，3.46(1H，m，CH)，3.80(1H，m，N-CH)，3.95(3H，s，OCH3)，4.76(1H，m，CH)，7.50(2H，m，Ar-H)，7.75(1H，s，Ar-H)，8.10(1H，s，NH)，8.14(1H，d，J 7.5Hz，Ar-H)，8.40(1H，d，J 8Hz，Ar-H)；MS(+ve)：522.3；tR＝7.76分钟(XBridge 2)。

化合物[21]：4-[9-(1-乙基-丙基)-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基]-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：0.85(6H，d，J 7Hz，CH2CH3)，1.59(4H，m，CH2CH3)，1.66(2H，m，CH)，1.83(2H，m，CH)，2.37(3H，s，N-CH3)，2.65(2H，m，CH2)，2.98(2H，m，CH)，3.50(2H，m，CH2)，3.83(1H，m，N-CH)，3.94(3H，s，OCH3)，4.93(1H，s，CH)，4.；49(2H，m，Ar-H+NH)，7.57(1H，s，NH)，7.79(1H，s，Ar-H)，8.15(1H，d，J 6.5Hz，Ar-H)，8.37(1H，d，J 8.5Hz，Ar-H)，9.41(1H，s，NH)；MS(+ve)：496.2；tR＝6.73分钟(XBridge 2)。

化合物[22]：4-[9-(1-乙基-丙基)-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基]-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：0.86(6H，d，J 7Hz，CH2CH3)，1.56(4H，m，CH2CH3)，1.62(2H，m，CH)，1.76(2H，m，CH)，2.52(3H，s，N-CH3)，2.63(2H，m，CH2)，3.22(2H，m，CH)，3.49(2H，m，CH2)，3.92(1H，m，CH)，4.97(1H，m，CH)，7.78(4H，m，Ar-H)，8.15(1H，s，Pyr-H)，9.31(1H，s，NH)，9.39(1H，s，NH)；MS(+ve)：466.3；tR＝6.26分钟(XBridge 2)。

化合物[23]：4-(9-环戊基-8-异丙基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(CD3OD)：0.83(3H，d，J 7Hz，CHCH3)，0.93(3H，d，J 7Hz，CHCH3)，1.41(2H，m，CH)，1.65(4H，m，CH)，1.79(2H，M，CH)，1.91(2H，m，CH)，2.17(2H，m，CH)，2.41(2H，m，2x CH)，2.71(4H，m，CH3+CH)，2.91(2H，m，CH)，3.35(3H，s，CH3)，3.90(1H，m，CH)，3.94(3H，s，OCH3)，4.21(1H，m，CH)，4.27(1H，m，CH)，7.18(2H，m，Ar-H)，8.23(1H，s，Pyr-H)，8.56(1H，d，J 8.5Hz，Ar-H)；MS(+ve)：550.3；tR＝8.40分钟(XBridge 2)。

化合物[24]：4-[9-(1-乙基-丙基)-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基]-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：0.85(6H，t，J 7.5，CH2CH3)，1.62(8H，m，CH+CH2)，1.76(2H，d，J 7Hz，CH)，1.94(2H，dd，J 10Hz，10Hz，CH)，2.17(3H，s，N-CH3)，2.64(2H，m，CH2)，2.80(2H，d，J 11Hz，CH)，3.18(3H，s，N-CH3)，3.49(2H，m，CH2)，3.75(1H，m，CH)，3.95(3H，s，OCH3)，4.65(1H，m，CH)，7.49(2H，m，Ar-H)，7.69(1H，s，Pyr-H)，8.07(1H，s，NH)，8.10(1H，d，J 9Hz，Ar-H)，8.37(1H，d，J 9Hz，Ar-H)；MS(+ve)：510.3；tR＝8.35分钟(XBridge 2)。

化合物[25]：3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-4-[6-氧代-9-(四氢-吡喃-4-基)-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基]-苯甲酰胺

¹H NMR(CD3OD)：1.60(2H，m，CH)，1.69(2H，d，J 11Hz，CH)，1.93(2H，d，J 12Hz，CH)，1.97(2H，dd，J 12Hz，12Hz，CH)，2.18(3H，s，N-CH3)，2.61(2H，m，CH2)，2.80(2H，d，J 10.5Hz，CH)，3.48(2H，dd，J 11Hz，CH)，3.62(2H，m，CH2)，3.75(1H，m，CH)，3.95(3H，s，OCH3)，4.04(2H，d，J 8Hz，CH)，4.85(1H，s，CH)，7.49(2H，m，Ar-H)，7.66(1H，s，NH)，7.81(1H，s，Pyr-H)，8.11(1H，d，J7.5Hz，Ar-H)，8.33(1H，d，J 8Hz，Ar-H)，9.45(1H，s，NH)；MS(+ve)：510.1；tR＝5.34分钟(XBridge 2)。

化合物[26]：3-甲氧基-4-[5-甲基-6-氧代-9-(四氢-吡喃-4-基)-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基]-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(CD3OD)：1.73(2H，ddd，J 3Hz，12Hz，18Hz，CH)，1.84(2H，d，J 11Hz，CH)，1.98(4H，m，烷基CH)，2.19(2H，dd，J 10.5Hz，10.5Hz，CH)，2.33(3H，s，N-CH3)，2.71(2H，m，CH2)，2.97(2H，d，J 12Hz，CH)，3.65(2H，dd，J11Hz，CH)，3.75(2H，m，CH2)，3.92(1H，m，CH)，4.02(3H，s，OCH3)，4.12(1H，dd，J 4Hz，11Hz，CH)，4.78(1H，m，CH)，7.53(2H，m，Ar-H)，8.04(1H，s，Pyr-H)，8.45(1H，d，J 9Hz，Ar-H)；MS(+ve)：524.3；tR＝5.71分钟(XBridge 2)。

化合物[27]：4-[5-乙基-9-(1-乙基-丙基)-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基]-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：0.86(6H，t，J 7.5Hz，CH3)，0.94(3H，d，J 7Hz，CH3)，1.63(6H，m，烷基CH+CH2)，1.78(2H，d，J 11Hz，CH)，1.94(2H，dd，J 11.5Hz，CH)，2.18(3H，s，N-CH3)，2.57(2H，m，CH2)，2.80(2H，m，CH2)，3.47(2H，m，CH2)，3.77(3H，m，CH+CH2)，3.96(3H，s，OCH3)，4.59(1H，m，CH)，7.50(2H，m，Ar-H)，7.24(1H，s，NH)，8.01(2H，m，Ar-H+Pyr-H)，8.39(1H，d，J 9Hz，Ar-H)；MS(+ve)：524.3；tR＝7.56分钟(XBridge 2)。

化合物[29]：4-(9-苄基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：1.58(2H，ddd，J 4Hz，12.5Hz，24.5Hz，CH)，1.73(2H，d，J11.5Hz，CH)，1.93(2H，dd，J 15Hz，CH)，2.17(3H，s，N-CH3)，2.69(2H，m，CH2)，2.78(2H，d，J 11.5Hz，CH)，3.22(3H，s，N-CH3)，3.63(2H，m，CH2)，3.72(1H，m，CH)，3.91(3H，s，OCH3)，4.87(2H，s，CH2)，7.23-7.32(4H，m，Ar-H)，7.35-7.43(2H，m，Ar-H)，7.44(1H，d，J 2Hz，Ar-H)，7.72(1H，s，Pyr-H)，8.04(1H，d，J 7.5Hz，Ar-H)，8.12(1H，d，J 8.5Hz)，8.16(1H，s，NH)；MS(+ve)：530.4；tR＝4.55分钟(XBridge 2)。

化合物[30]：3-甲氧基-4-(5-甲基-6-氧代-9-苯基-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：1.56(2H，dd，J 11.5Hz，20.5Hz，CH)，1.75(2H，d，J10Hz，CH)，1.95(2H，m，CH)，2.18(3H，s，N-CH3)，2.83(3H，m，CH+CH2)，3.16(1H，s，CH)，3.27(3H，s，N-CH3)，3.71(1H，m，N-CH)，3.88(3H，s，OCH3)，4.06(2H，m，CH2)；MS(+ve)：516.3；tR＝2.72分钟(XBridge 2)。

化合物[31]：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-螺[嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-3，1′-环丙烷]-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：0.66(2H，d，J 6Hz，环丙基-CH)，0.91(2H，d，J 6Hz，环丙基-CH)，1.50(2H，m，CH)，1.58(4H，m，CH)，1.69(2H，m，CH)，1.77(2H，m，CH)，1.95(4H，m，CH)，2.16(3H，s，N-CH3)，2.73(1H，s，CH)，2.79(2H，d，J11Hz，CH)，2.89(1H，s，CH)，3.16(3H，s，N-CH3)，3.47(2H，s，CH2)，3.72(1H，m，CH)，3.94(3H，s，OCH3)，4.86(1H，m，CH)，7.46(2H，m，Ar-H)，7.67(1H，s，NH)，7.95(1H，s，Pyr-H)，8.07(1H，d，J 8Hz，Ar-H)，8.38(1H，d，J 8Hz，Ar-H)；MS(+ve)：534.3；tR＝3.05分钟(XBridge 2)。

化合物[32]：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

¹H NMR(DMSO)：1.09(6H，s，CH3)，1.58(6H，m，CH2)，1.74(4H，m，CJ)，1.95(4H，m，CH)，2.16(3H，s，NCH3)，2.73(2H，d，J 11.5Hz，CH)，3.18(3H，s，NCH3)，3.37(2H，s，CH2)，3.74(1H，m，CH)，3.94(3H，s，OCH3)，5.19(1H，m，CH)，7.46(2H，m，Ar-H)，7.67(1H，s，NH)，7.98(1H，s，Pyr-H)，8.07～(1H，d，J8Hz，Ar-H)，8.36(1H，d，J 8Hz)；MS(+ve)：536.40；tR＝3.32分钟(XBridge2)。

酰胺偶联

下述也通过实施例1，步骤7中所述的方法制备：

化合物[33]：4-(9-环戊基-5，8-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

黄色固体(31％)。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.24(d，J＝6.5Hz，3H，CH₃)，1.36-2.17(m，16H，8x环戊-H和4x哌啶-H)，2.51(s，3H，CH₃)，3.14-3.16(m，2H，CH₂)，3.28(s，3H，CH₃)，4.00(s，3H，CH₃)，4.04-4.06(m，1H，CH)，4.71-4.74(m，1H，CH)，7.49-7.52(m，2H)，7.99(s，1H)，8.41(d，J＝8.5Hz，1H，苯-H)；MS+ve：522.4。R_t＝10.03分钟(纯度97％，Vydac 1)

化合物[34]：4-(9-环戊基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

黄色固体(38％)；MS+ve：508.3。R_t＝9.53分钟(纯度97％，Vydac 1)

化合物[35]：4-(9-环己基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

灰白色固体(33％)；¹H NMR(CD₃OD)：δ1.34-1.41(m，2H)，1.44(d，J＝6.5Hz，3H，CH₃)，1.60-1.99(m，8H)，2.22-2.26(m，2H)，2.73-2.77(m，1H)，2.91(s，3H，CH₃)，2.96-3.25(m，5H)，3.61-3.63(m，2H，CH₂)，4.01(s，3H，CH₃)，4.17-4.21(m，1H，CH)，4.33-4.36(m，1H，CH)，7.59(dd，J＝2.0和8.5Hz，1H，苯-H)，7.63(d，J＝2.0Hz，1H，苯-H)，7.69(s，1H，嘧啶-H)，8.00(d，J＝8.5Hz，1H，苯-H)；MS+ve：522.2。R_t＝10.17分钟(纯度100％，Vydac1)。

化合物[36]：4-(9-环戊基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

紫色固体(40％)；¹H NMR(CD₃OD)：δ1.65-2.25(m，8H，环戊-H)，2.34(s，3H，CH₃)，2.73-2.75(m，2H，CH₂)，3.69-3.71(m，2H，CH₂)，3.90-3.94(m，1H，CH)，4.01(s，3H，CH₃)，5.22-5.25(m，1H，CH)，7.48-7.51(m，2H，2x苯-H)，7.76(s，1H，嘧啶-H)，8.47(s，1H，NH)；MS+ve：493.4。R_t＝9.21分钟(纯度92％，Vydac 1)。

化合物[37]：4-(9-环戊基-5，8-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

灰白色固体(45％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.17(d，J＝6.0Hz，3H，CH₃)，1.29-2.10(m，16H，8x环戊-H和8x哌啶-H)，2.21(bs，3H，CH₃)，2.81-2.83(m，2H，CH₂)，3.21(s，3H，CH₃)，3.73-3.76(m，1H，CH)，4.03-4.05(m，1H，CH，4.68-4.72(m，1H，CH)，7.74-7.79(m，4H，苯-H)，8.11(s，1H，嘧啶-H)，9.47(bs，1H，NH)；MS+ve：492.3。R_t＝9.70分钟(纯度92％，Vydac 1)。

化合物[38]：4-(9-环戊基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

灰白色固体(15％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.25(d，J＝7.0Hz，3H，CH₃)，1.51-2.04(m，10H)，2.09(s，3H，CH₃)，2.55-2.66(m，6H)，2.78-2.79(m，2H，CH₂)，3.05-3.15(m，1H，CH)，3.95-4.04(m，1H，CH)，5.13-5.15(m，1H，CH)，7.75(dd，J＝8.5Hz，4H，苯-H)，7.81(s，1H，嘧啶-H)，8.24(d，J＝7Hz，1H，NH)，9.48(s，1H，NH)，9.66(bs，1H，NH)；MS+ve：478.3。R_t＝9.28分钟(纯度100％，Vydac 1)。

化合物[39]：4-(9-环己基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺

灰白色固体(19％)；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.16-1.98(m，18H，10x环己烷-H)和8x哌啶-H)，2.18(s，3H，CH₃)，2.60(dd，J＝5Hz，2H，CH₂)，3.60(dd，J＝5Hz，2H，CH₂)，3.73-3.76(m，1H，CH)，3.95(s，3H，CH₃)，4.58-4.63(m，1H，CH)，7.46(dd，J＝2.0和8.0Hz，1H，苯-H)，7.49(d，J＝2Hz，1H，苯-H)，7.60(s，1H)，7.78(s，1H)，8.10(d，J＝8.0Hz，1H，NH)，8.37(d，J＝8.0Hz，1H，苯-H)，9.41(bs，1H，NH)；MS+ve：508.4。R_t＝9.70分钟(纯度95％，Vydac1)。

实施例2

通用实验

分析和制备RP-HPLC-MS使用Waters XBridge(50x4.6mm C183.5μm或100x4.6mm C183.5μm)和XBridge(100x19mm C185μm)柱进行，使用线性梯度的溶剂A(水，含0.1％氢氧化铵和5％乙腈)/溶剂B(乙腈)系统。制备RP-HPLC使用Apex Prepsil ODS 10μ柱(22x250mm)进行，使用线性梯度的溶剂A(水，含0.1％TFA)/溶剂B(乙腈)。质谱使用WatersZQ2000单四级杆质谱仪(电喷雾离子化(ESI))获得。

所用的梯度如下：

中间体1：2-氯-9-环戊基-5-甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮

1.亚硫酰氯(2.1当量)，MeOH，于0℃添加，回流2小时；2.环戊酮(0.77当量)，乙酸钠(0.77当量)，三乙酰氧基硼氢化钠(1.11当量)，DCM，室温16小时；3.2，4-二氯-5-硝基嘧啶(1.1当量)，K₂CO₃(1当量)，丙酮，0℃-室温16小时；4.NH₄Cl(8.5当量)，Fe(8当量)，EtOH/H₂O(4∶1)，回流2.5小时；5.MeI(1.18当量)，NaH(1.07当量)，DMF，-10℃-室温，3小时。

步骤1：3-氨基丙酸甲基酯

将β-丙氨酸(9.37g，0.105mol，1.0当量)加入到MeOH(50mL)中，并将混合物冷却至0℃，然后滴加亚硫酰氯(16mL，0.221mol，2.1当量)[小心：添加放热]。将反应温热至室温，然后加热回流2小时。溶液在真空中浓缩，用叔丁基甲基醚处理，并通过过滤移出所得结晶。产物为白色晶态固体(11g，100％)；¹H(DMSO-d₆)：δ2.73(2H，dd，J＝7Hz，CH₂)，2.98(2H，dd，J＝7Hz，CH₂)，3.61(3H，s，CH₃)，8.28(2H，bs，NH₂)；MS+ve：104.1。

步骤2：3-(环戊基氨基)丙酸甲基酯

将3-氨基丙酸甲基酯(9.37g，0.09mol)溶于DCM(200mL)中。加入环戊酮(6.43mL，0.07mol，0.77当量)，乙酸钠(5.96g，0.07mol，0.77当量)和三乙酰氧基硼氢化钠(22g，0.10mol，1.11当量)，然后将反应在室温搅拌16小时。添加20％碳酸氢钠(100mL)和2M氢氧化钠(50mL)，且产物使用DCM/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，干燥(MgSO₄)，然后在减压下蒸发，得到产物，为淡黄色油状物(8.90g，55％)；MS+ve：172.4。

步骤3：3-[环戊基(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]丙酸甲基酯

将3-(环戊基氨基)丙酸甲基酯(0.838g，0.005mol，1当量)和K₂CO₃(0.676g，0.005mol，1当量)添加到丙酮(5mL)中，并将所得混合物冷却至0℃，然后滴加2，4-二氯-5-硝基嘧啶(1.04g，0.0055mol，1.1当量)。将反应混合物(RM)温热至室温，并再继续搅拌16小时，然后再添加0.12当量的嘧啶。再继续搅拌3小时。反应混合物在减压下蒸发，且产物使用EtOAc/H₂O萃取。有机萃取液用饱和NaCl洗涤，干燥(MgSO₄)，并在减压下蒸发，得到产物，为褐色油状残余物(1.04g，65％)；MS+ve：329.2；R_t＝3.78分钟(分析_1)。

步骤4：2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-6H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

将3-[环戊基(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]丙酸甲基酯(1.0g，0.003mol，1当量)和NH₄Cl(1.38g，0.025mol，8.5当量)添加到EtOH/H₂O(4∶1，10mL)中，并将混合物加热至回流。分批加入铁粉(1.36g，0.024mol，8当量)，且2小时后，将反应混合物趁热通过硅藻土过滤，用EtOAc(10mL)和EtOH(10mL)[都是热的]洗涤。溶剂在减压下蒸发，得到产物，为褐色固体(0.35g，43％)；¹H(DMSO-d₆)：δ1.55(4H，m，2CH₂)，1.7(2H，m，CH₂)，1.83(2H，m，CH₂)，2.66(2H，t，J＝5Hz，CH₂)，3.57(2H，t，J＝5Hz，CH₂)，5.01(1H，m，CH)，7.83(1H，s，CH)，9.71(1H，s，NH)；MS+ve：267.2；R_t＝2.87分钟(分析_1)。

步骤5：2-氯-9-环戊基-5-甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮

将2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-6H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮(0.318g，0.0012mol)和MeI(0.088mL，0.0014mol，1.18当量)添加到DMF(5mL)中，并将溶液冷却到-10℃。加入NaH(0.03g，0.0013mol，1.07当量)，且反应混合物在0℃搅拌30分钟，并在室温搅拌30分钟。减压下蒸发溶剂，且产物使用EtOAc/H₂O萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl洗涤，干燥(MgSO₄)，并在减压下蒸发，得到产物，为紫色油状残余物(0.25g，75％)；¹H(DMSO-d₆)：δ1.55(4H，m，2CH₂)，1.7(2H，m，CH₂)，1.9(2H，m，CH₂)，2.63(2H，t，J＝5Hz，CH₂)，3.17(3H，s，CH₃)，3.65(2H，t，J＝5Hz，CH₂)，4.74(1H，m，CH)，8.14(1H，s，CH)；MS+ve：281.2；R_t＝3.11分钟(分析_1)。

使用与对于上述中间体1所述相似的方法，制备下述中间体2-4：

中间体2：2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮

1-氨基甲基-环丙烷羧酸乙基酯与环戊酮、乙酸钠和三乙酰氧基硼氢化钠在DCM中反应，得到1-环戊基氨基甲基-环丙烷羧酸乙基酯

¹H NMR(CDCl₃)：0.84(3H，t，J 7Hz，CH3)，1.25(4H，m，CH2)，1.37(2H，m，CH)，1.54(2H，m，CH)，1.70(2H，m，CH)，1.83(2H，m，CH)，2.71(2H，s，CH2)，3.10(1H，m，CH)，4.16(2H，q，J 7Hz，CH2CH3)。

1-环戊基氨基甲基-环丙烷羧酸乙基酯与2，4-二氯-5-硝基嘧啶和K₂CO₃在丙酮中反应，得到1-{[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-甲基}环丙烷羧酸乙基酯。用NH₄Cl和铁粉在乙醇中处理，得到1-{[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-甲基}-环丙烷羧酸乙基酯

MS(+ve)：339.2，341.2；Rt＝4.15分钟(分析_2)。

上述化合物在DMF中加热至140℃，保持2小时。溶剂在真空中蒸发，加入乙酸乙酯，且过滤所得固体，并在真空下干燥得到2′-氯-9′-环戊基-8′，9′-二氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮

MS(+ve)：293.2，295.2；Rt＝3.48分钟(分析_2)。2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-7，1′-环丙烷]-6-酮和MeI和NaH在DMF中反应，得到2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮

MS(+ve)：307.1，309.2；Rt＝3.67分钟(分析_3)。

中间体3：2-氯-9-环戊基-5，7，7-三甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮

3-氨基-2，2-二甲基-丙酸乙基酯与环戊酮、乙酸钠和三乙酰氧基硼氢化钠在DCM中反应，得到3-环戊基氨基-2，2-二甲基-丙酸乙基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.19(6H，s，CH3)，1.25(3H，t，J 7Hz，CH3)，1.28(2H，m，CH)，1.49(2H，m，CH)，1.65(2H，m，CH)，2.64(1H，s，CH2)，3.01(1H，m，CH)，4.10(2H，q，J 7.5Hz，CH2)

3-环戊基氨基-2，2-二甲基-丙酸乙基酯与2，4-二氯-5-硝基嘧啶和K₂CO₃在丙酮中反应，得到3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2，2-二甲基-丙酸乙基酯

MS(+ve)：371.1，373.1；Rt＝4.67分钟(分析_2)。

3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2，2-二甲基-丙酸乙基酯与NH₄Cl和铁粉在乙醇中反应，得到3-[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2，2-二甲基-丙酸乙基酯

MS(+ve)：341.2，343.2；Rt＝4.25分钟(分析_2)。

3-[(5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-2，2-二甲基-丙酸乙基酯在DMF中加热至140℃，保持2小时。溶剂在真空中蒸发，加入乙酸乙酯，且过滤所得固体，并在真空下干燥，得到2-氯-9-环戊基-7，7-二甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮

MS(+ve)：295.1，297.2；Rt＝3.58分钟(分析_2)。

2-氯-9-环戊基-7，7-二甲基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6-酮与MeI和NaH在DMF中反应，得到2-氯-9-环戊基-5，7，7-三甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮

MS(+ve)：309.1，311.2；Rt＝3.90分钟(分析_3)。中间体4：2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮

1-氨基甲基-环丁烷羧酸甲基酯与环戊酮、乙酸钠和三乙酰氧基硼氢化钠在DCM中反应，得到1-环戊基氨基甲基-环丁烷羧酸甲基酯

¹H NMR(CDCl3)：1.36(2H，m，CH2)，1.51(2H，m，CH2)，1.66(2H，m，CH2)，1.95(4H，m，2xCH2)，2.15(2H，m，CH2)，2.43(4H，m，2xCH2)，2.93(2H，s，CH2)，3.21(1H，m，CH)，3.76(3H，s，CH3)。

1-环戊基氨基甲基-环丁烷羧酸甲基酯与2，4-二氯-5-硝基嘧啶和K₂CO₃在丙酮中反应，得到1-{[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-甲基}-环丁烷羧酸甲基酯

MS(+ve)：369.2，371.2；Rt＝3.48分钟(分析_1)。

1-{[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-环戊基-氨基]-甲基}-环丁烷羧酸甲基酯与NH4Cl和铁粉在乙醇中反应，得到2′-氯-9′-环戊基-8′，9′-二氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮，直接分离。

MS(+ve)：307.2，309.2；Rt＝3.48分钟(分析_1)。

2-氯-9-环戊基-5，7，8，9-四氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-7，1′-环丁烷]-6-酮与MeI和NaH在DMF中反应，得到2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮

MS(+ve)：321.2，323.3；Rt＝3.77分钟(分析_1)。

中间体5：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸

将2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮(中间体2)(0.70g，2.5mmol，1当量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.25g，7.5mmol，3当量)和TFA(1.43g，12.5mmol，5当量)在TFE(25mL)中加热至回流，保持18小时。溶剂在真空中蒸发，且所得残余物用MeOH研磨，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(0.81g，74％)。

Rt＝1.88分钟(分析_1)MS(+ve)：438.4，MS(-ve)：436.5。

中间体6：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸

将2-氯-9-环戊基-5，7，7-三甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮(中间体3)(0.35g，1.14mmol，1当量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(0.57g，3.42mmol，3当量)和TFA(0.42mL，5.7mmol，5当量)在TFE(10mL)中加热至回流，保持36小时。在真空中蒸发溶剂，且所得残余物用EtOAc研磨，得到4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(0.38g，76％)。

MS(+ve)：440.3，MS(-ve)：438.5。

中间体7：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸

将2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮(中间体4)(1.02g，3.18mmol，1当量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.6g，9.5mmol，3当量)和TFA(1.2mL，15.9mmol，5当量)在TFE(40mL)中加热至回流，保持24小时。在真空中蒸发溶剂，且所得残余物用EtOAc研磨，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(1.08g，75％)。

Rt＝2.10分钟(分析_1)；MS(+ve)：452.3，MS(-ve)：450.4。

中间体8：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸

将2-氯-9-环戊基-5-甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮(中间体1)(0.70g，2.5mmol，1当量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.25g，7.5mmol，3当量)和TFA(0.93mL，12.5mmol，5当量)在TFE(25mL)中加热至回流，持续20小时。在真空中蒸发溶剂，且所得残余物用MeOH研磨，得到′4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(0.66g，64％)。

Rt＝1.88分钟(分析_1)；MS(+ve)：412.4，MS(-ve)：410.5。

中间体9：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟苯甲酸

将2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮(中间体2)(0.42g，1.36mmol，1当量)，4-氨基-3-氟苯甲酸(0.63g，4.1mmol，3当量)和TFA(0.51mL，6.8mmol，5当量)在TFE(10mL)中加热至回流，保持36小时。再加入4-氨基-3-氟苯甲酸(0.63g，4.1mmol，3当量)和TFA(0.51mL，6.8mmol，5当量)，且反应再次加热至回流，保持4天。在真空中蒸发溶剂，且所得残余物用EtOAc研磨，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟苯甲酸(0.41g，71％)。

Rt＝1.93分钟(分析_1)；MS(+ve)：426.3

中间体10：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟苯甲酸

将2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮(中间体4)(0.20g，0.63mmol，1当量)，4-氨基-3-氟苯甲酸(0.30g，1.9mmol，3当量)和TFA(0.24mL，3.2mmol，5当量)在TFE中加热至回流，保持18小时。再加入4-氨基-3-氟苯甲酸(0.20g)和TFA(0.1mL)，且将反应再次加热至回流，保持2天。再加入TFA(0.24mL)，且将反应再次加热至回流，保持3天。真空中蒸发溶剂，且所得残余物用EtOAc研磨，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟苯甲酸(0.15g，55％)。

Rt＝2.02分钟(分析_1)；MS(+ve)：440.3；MS(-ve)：438.4

中间体11：4-氨基-N-(反-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

4-氨基-N-(反-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺为本领域中已知的化合物，且通过WO 2007/090844A1中描述的方法制备。

中间体12：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺

将4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体8)(0.49g，1.2mmol，1当量)，TBTU(0.42g，1.3mmol，1.1当量)和DIPEA(0.40mL，2.4mmol，2当量)在DCM(25mL)中一起搅拌30分钟，然后加入4-氨基-1-BOC-哌啶(0.29g，1.4mmol，1.2当量)。反应混合物于室温搅拌20小时，然后用DCM(30mL)稀释，并依次用水(2x15mL)，50％饱和碳酸氢钠水溶液(1x20mL)，碳酸钾水溶液(1x20mL)和饱和盐水(1x20mL)洗涤。在真空中浓缩，分离4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(1-BOC-哌啶-4-基)苯甲酰胺，其没有进一步纯化即使用(0.71g)。Rt＝3.58分钟(分析_1)。

加入盐酸甲醇溶液，并将溶液在室温搅拌4小时。真空中浓缩，得到4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺的盐酸盐。将该盐分配于DCM和pH 8的碳酸钾水溶液之间。分离DCM层，水层用DCM和EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，并在真空中浓缩，得到4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺，为游离碱(0.51g)。

Rt＝2.78分钟(分析_1)；MS(+ve)：494；MS(-ve)：492。

化合物[254]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(22mg，0.05mmol，1当量)，DIPEA(17μl，0.10mmol，2当量)和TBTU(18mg，0.055mmol，1.1当量)添加到0.5mL DMF中，且将所得溶液在室温搅拌30分钟，然后添加1-氨基-4-甲基哌嗪(12μl，0.1mmol，2当量)。然后将反应混合物在室温搅拌4小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(白色固体，8mg，30％)。

Rt＝2.63分钟(分析_1)MS(+ve)：535.5；MS(-ve)：533.6；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.63-0.70(2H，m)，0.87-0.94(2H，m)，1.43-1.54(2H，m)，1.55-1.63(2H，m)，1.64-1.73(2H，m)，1.83-1.94(2H，m)，2.18(3H，s)，2.31-2.48(4H，m)，2.92(4H，m)，3.16(3H，s)，3.47(2H，s)，3.94(3H，s)，4.78-4.91(1H，m)，7.35-7.48(2H，m)，7.68(1H，s)，7.98(1H，s)，8.39(1H，d，J＝8.3Hz)，9.31(1H，s)。

化合物[218]：(±)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体7)(15mg，0.033mmol)，DIPEA(12μl，0.066mmol，2当量)和TBTU(12mg，0.036mmol，1.1当量)添加到0.5mL DMF中，且所得溶液在室温搅拌5分钟，然后添加3-氨基奎宁环二盐酸盐(8mg，0.04mmol，1.2当量)和DIPEA(13μL)。然后反应混合物在室温搅拌3小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到(±)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺。

Rt＝3.26分钟(分析_1)；MS(+ve)：560.4；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：8.37(d，J＝8.3Hz，1H)，8.08(d，J＝6.8Hz，1H)，8.05(s，1H)，7.73(s，1H)，7.45-7.53(m，2H)，4.82(五重峰，J＝8.3Hz，1H)，3.84-4.01(m，4H)，3.64(s，2H)，3.18(s，3H)，3.04-3.14(m，1H)，2.88(t，J＝9.8Hz，1H)，2.58-2.75(m，4H)，2.21-2.33(m，2H)，2.07(s，2H)，1.97(br.s.，2H)，1.87(br.s.，2H)，1.76(d，J＝4.9Hz，2H)，1.56-1.70(m，8H)，1.30(br.s.，1H)

化合物[195]：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯甲酰胺

将4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体6)(20mg，0.046mmol，1当量)，DIPEA(16μl，0.091mmol，2当量)和TBTU(16mg，0.05mmol，1.1当量)添加到0.5mL DMF中，且所得溶液在室温搅拌5分钟，然后添加1-氨基-4-甲基哌嗪(7mg)。然后将反应混合物于室温搅拌16小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯甲酰胺。

Rt＝2.81分钟(分析_1)；MS(+ve)：537.5；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：1.09(6H，s)，1.61(4H，m)，1.73(2H，m)，1.87(2H，m)，2.19(3H，s)，2.42(2H，m)，2.92(4H，m)，3.29(3H，s)，3.37(3H，m)，3.93(3H，s)，3.17(1H，m)，7.40(2H，m)，7.68(1H，s)，7.98(1H，s)，8.37(1H，d，J 7Hz)，9.30(1H，s)。

化合物[221]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体7)(15mg，0.033mmol，1当量)，DIPEA(12μl，0.066mmol，2当量)和TBTU(12mg，0.036mmol，1.1当量)添加到0.5mL DMF中，且所得溶液在室温搅拌5分钟，然后添加1-氨基-4-甲基哌嗪(5mg)和DIPEA(13μL)。然后反应混合物在室温搅拌3小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-

3-甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺。

Rt＝2.79分钟(分析_1)；MS(+ve)：549.5；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：9.31(s，1H)，8.37(d，J＝8.3Hz，1H)，8.05(s，1H)，7.72(s，1H)，7.37-7.47(m，2H)，4.73-4.86(m，1H)，3.93(s，3H)，3.64(s，2H)，3.18(s，3H)，2.92(br.s.，4H)，2.36(br.s.，4H)，2.27(d，J＝9.3Hz，2H)，2.18(s，3H)，1.97(br.s.，2H)，1.79-1.91(m，1H)，1.76(br.s.，2H)，1.54-1.72(m，7H)。

化合物[371]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮(中间体2)(0.14g，0.45mmol，1当量)，4-氨基-N-(反-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(中间体11)(0.26g，0.67mmol，1.5当量)和TFA(0.17mL，2.2mmol，5当量)在TFE(3mL)中一起在80℃加热18小时。进一步加入定量的中间体2(0.14g)，且反应进一步加热48小时。反应混合物在真空中浓缩，且残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化，用0→20％氨/MeOH/DCM梯度洗脱，然后通过制备HPLC(制备_4)纯化，最后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(0.11g，25％)。

Rt＝3.18分钟(分析_1)；ES(+ve)：657.6；ES(-ve)：655.7；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.05(d，J＝4.20Hz，3H)，0.44(d，J＝7.74Hz，2H)，0.67(d，J＝1.61Hz，2H)，0.74-0.85(m，1H)，0.90(s，2H)，1.23-1.44(m，3H)，1.44-1.55(m，2H)，1.54-1.64(m，2H)，1.64-1.74(m，2H)，1.88(br.s.，5H)，2.08(s，3H)，2.13(d，J＝6.45Hz，2H)，2.17-2.28(m，1H)，2.29-2.47(m，3H)，2.60-2.67(m，1H)，3.06-3.23(m，5H)，3.47(s，2H)，3.65-3.79(m，1H)，3.94(s，2H)，4.05-4.13(m，1H)，4.78-4.91(m，1H)，7.48(s，2H)，7.67(s，1H)，7.98(s，1H)，8.00-8.07(m，1H)，8.31-8.45(m，1H)。

化合物[372]：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将2-氯-9-环戊基-5，7，7-三甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮(中间体3)(0.13g，0.43mmol，1当量)，4-氨基-N-(反-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(中间体11)(0.26g，0.67mmol，1.5当量)和TFA(0.17mL，2.2mmol，5当量)在TFE(3mL)中于80℃一起加热18小时。再加入定量的中间体6(0.13g)，且反应进一步加热48小时。反应混合物在真空中浓缩，且残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化，用0→20％氨/MeOH/DCM梯度洗脱，然后通过制备HPLC(制备_4)纯化，最后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(0.03g，7％)。

Rt＝3.38分钟(分析_1)；ES(+ve)：659.6；ES(-ve)：657.7；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.05(d，J＝3.86Hz，3H)，0.40-0.48(m，3H)，0.73-0.84(m，2H)，1.03-1.13(m，10H)，1.18(s，1H)，1.24-1.43(m，6H)，1.61(br.s.，3H)，1.74(d，J＝9.65Hz，2H)，1.88(br.s.，5H)，2.08(s，5H)，2.13(d，J＝6.75Hz，2H)，2.17-2.25(m，1H)，2.36(br.s.，3H)，2.60-2.67(m，1H)，3.14-3.22(m，2H)，3.37(s，1H)，3.51(s，1H)，3.94(s，2H)，5.18(t，J＝8.52Hz，1H)，7.43-7.50(m，1H)，7.67(s，1H)，7.98(s，1H)，8.03(d，J＝7.72Hz，1H)，8.35(d，J＝8.36Hz，1H)。

或者，本领域技术人员将理解实施例5、6能够通过中间体5或6与已知化合物反-4-(4-环丙基甲基-哌嗪-1-基)-环己基胺(如US 6,861,422B2中所述)使用标准酰胺键形成条件(如实施例1中所述的那些)的反应合成。

化合物[345]：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-[1-(四氢-吡喃-4-基)-哌啶-4-基]-苯甲酰胺

将4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺(中间体12)(35mg，0.07mmol，1当量)和三乙酰氧基硼氢化钠(18mg，0.084mmol，1.2当量)在DCM(0.5mL)中与四氢吡喃-4-酮(6.5μL，0.07mmol，1当量)在室温反应2天。再加入三乙酰氧基硼氢化钠(18mg，1.2当量)和四氢吡喃-4-酮(6.5μL，1当量)，及乙酸(4μL，1当量)。2天后，反应混合物用DCM稀释，用水洗涤，且有机层在真空中浓缩。所得残余物通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-[1-(四氢-吡喃-4-基)-哌啶-4-基]-苯甲酰胺(10mg，25％)。

Rt＝2.74分钟(分析_1)；ES(+ve)：578.5；ES(-ve)：576.7。

化合物[373]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟苯甲酸(中间体10)(100mg，0.23mmol，1当量)，DIPEA(80μl，0.46mmol，2当量)和TBTU(80mg，0.25mmol，1.1当量)添加到1mL DMF中，且所得溶液在室温搅拌10分钟，然后加入1-氨基-4-甲基哌嗪(33μL，0.27mmol，1.2当量)。然后将反应混合物在室温搅拌1小时，然后分成2等份，并通过制备RP-HPLC-MS(制备_3)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(0.05g，41％)。

Rt＝2.74分钟(分析_1)；MS(+ve)：537.5；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：1.55-1.65(8H，m)，1.71(2H，m)，1.88(2H，m)，2.18(3H，s)，2.28(2H，q，J 10.5Hz)，2.41-2.52(4H，m)，2.89(4H，m)，3.18(3H，s)，3.61(2H，s)，4.76(1H，五重峰，8.5Hz)，7.61(2H，m)，8.03(1H，s)，8.12(1H，dd，J 8Hz，8.5Hz)，8.76(1H，s)，9.36(1H，s)。

化合物[374]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟苯甲酸(中间体9)(0.27g，0.63mmol，1当量)，DIPEA(0.21mL，1.26mmol，2当量)和TBTU(0.22g，0.69mmol，1.1当量)添加到5mL DCM中，并将所得溶液于室温搅拌30分钟，然后添加1-氨基-4-甲基哌嗪(91μl，0.75mmol，1.2当量)。然后反应混合物在室温搅拌4小时，然后用水洗涤，在真空中浓缩，且残余物通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-氟-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(0.14g，44％)。

Rt＝2.58分钟(分析_1)；MS(+ve)：523.4；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.65-0.67(2H，s，CH2)，0.85-0.95(2H，m，CH2)，1.23-1.82(8H，m，烷基-H)，2.18(3H，s，CH3)，2.36-2.41(4H，m，烷基-H)，2.88(4H，s，烷基-H)，3.16(3H，s，CH3)，3.44(2H，s，烷基-H)，4.77-4.80(1H，m，CH)，7.6(2H，m，芳基-H)，7.96(1H，s，芳基-H)，8.16(1H，t，J＝8Hz，芳基-H)，8.70(1H，s，NH)，9.35(1H，s，NH)。

化合物[194]：(±)-4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺

将4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体6)(20mg，0.046mmol，1当量)，DIPEA(16μl，0.091mmol，2当量)和TBTU(16mg，0.05mmol，1.1当量)添加到0.5mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌5分钟，然后添加3-氨基奎宁环二盐酸盐(11mg，0.055mmol，1.1当量)。然后将反应混合物于室温搅拌16小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到(±)-4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-

3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺(8mg，32％)。

Rt＝3.28分钟(分析_1)；MS(+ve)：548.5；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：8.37(1H，d，J 8Hz)，8.07(1H，d，J 6.5Hz)，7.98(1H，s)，7.69(1H，s)，7.47-7.50(2H，m)，5.19(1H，五重峰，J 8Hz)，3.95(4H，m)，3.37(2H，s)，3.18(3H，s)，3.11(1H，m)，2.89(1H，m)，2.65-2.72(4H，m)，1.88(2H，m)，1.73-1.87(4H，m)，1.57-1.61(6H，m)，1.31(1H，m)，1.09(6H，s)。

化合物[186]：(±)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(25mg，0.057mmol，1当量)，DIPEA(20μL，0.11mmol，2当量)和TBTU(20mg，0.063mmol，1.1当量)添加到0.5mL DMF中，且所得溶液在室温搅拌15分钟，然后添加3-氨基奎宁环二盐酸盐(11mg，0.055mmol，1.1当量)和DIPEA(40μL)。然后将反应混合物于室温搅拌16小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到(±)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺。

Rt＝3.02分钟(分析_1)；MS(+ve)：546.4；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：8.40(1H，d，J 8Hz)，8.08(1H，d，J 7Hz)，7.98(1H，s)，7.69(1H，s)，7.47-7.50(2H，m)，4.87(1H，五重峰，J 9Hz)，4.10(1H，q，J 5.5Hz)，3.95(4H，m)，3.47(2H，s)，3.27(3H，s)，3.07(1H，m)，2.08(1H，m)，2.63-2.86(4H，m)，1.88(3H，m)，1.78(1H，m)，1.68(2H，m)，1.50-1.62(5H，m)，1.32(1H，m)，0.90(2H，m)，0.66(2H，m)。

化合物[375]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(48mg，0.11mmol，1当量)，DIPEA(36μL，0.22mmol，2当量)和TBTU(39mg，0.12mmol，1.1当量)添加到5mL DCM中，并将所得溶液于室温搅拌15分钟，然后添加2-(4-氨基哌嗪-1-基)乙醇(19mg，0.13mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌16小时，然后在真空中浓缩，并通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)-3-甲氧基苯甲酰胺(24mg，39％)。

Rt＝2.48分钟(分析_1)；MS(+ve)：565.4；1HNMR(DMSO)δppm：0.66-0.67(2H，m，CH2)，0.88-0.90(2H，m，CH2)，1.23-1.90(8H，m，烷基-H)，2.34-2.41(4H，m，烷基-H)，2.91(4H，t，J＝4Hz，烷基-H)，3.16(3H，s，CH3)，3.46-3.51(4H，m，)，3.93(3H，s，CH3)，4.38-4.45(1H，m，)4.81-4.87(1H，m，CH)，7.40(2H，d，J＝10.5Hz，芳基-H)，7.67(1H，s)，7.98(1H，s)，8.39(1H，d，J＝8Hz，芳基-H)，9.30(1H，s，NH)。

化合物[376]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-吗啉代苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(50mg，0.11mmol，1当量)，DIPEA(38μL，0.23mmol，2当量)和TBTU(40mg，0.12mmol，1.1当量)添加到5mL DCM中，并将所得溶液于室温搅拌15分钟，然后添加4-氨基吗啉(12mg，0.14mmol，1.2当量)。然后反应混合物在室温搅拌16小时，然后在真空中浓缩，并通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-吗啉代苯甲酰胺(26mg，44％)。

Rt＝2.72分钟(分析_1)；MS(+ve)：522.4；1H NMR(DMSO)δppm：0.65-0.71(2H，m，CH2)，0.85-0.91(2H，m，CH2)，1.23-1.88(8H，m，烷基-H)，2.92(4H，t，J＝4Hz，烷基-H)，3.16(3H，s，CH3)，3.47(2H，s，烷基-H)，3.66(4H，t，J＝4.5Hz)，3.94(3H，s，CH3)，4.81-4.87(1H，m，CH)，7.41(2H，d，J＝9.5Hz)，7.69(1H，s)，7.98(1H，s)，8.40(1H，d，J＝8Hz)，9.41(1H，s，NH)。

化合物[347]：(R)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(0.11g，0.25mmol，1当量)，DIPEA(0.17mL)和TBTU(88mg，0.28mmol，1.1当量)添加到5mLDCM中，且将所得溶液于室温搅拌30分钟，然后添加(R)-(+)-3-氨基奎宁环二盐酸盐(60mg，0.30mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌16小时，然后用DCM稀释，并依次用水(x2)，50％饱和碳酸氢钠水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)，并在真空中浓缩。残余物溶解于最少量的EtOAc，然后添加正庚烷以沉淀(R)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺(白色固体，0.13g，96％)。

Rt＝3.07分钟(分析_1)；MS(+ve)：546.5；MS(-ve)：544.6；1H NMR(DMSO-d₆)δppm 0.62-0.72(2H，m)，0.87-0.94(2H，m)，1.20-1.38(1H，m)，1.44-1.54(2H，m)，1.54-1.64(4H，m)，1.64-1.74(2H，m)，1.75-1.85(1H，m)，1.85-1.95(3H，m)，2.65-2.79(4H，m)，2.83-3.01(1H，m)，3.11-3.21(4H，m)，3.47(2H，s)，3.95(4H，s)，4.77-4.93(1H，m)，7.42-7.54(2H，m)，7.69(1H，s)，7.98(1H，s)，8.10(1H，d，J＝6.3Hz)，8.39(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[348]：(S)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(0.11g，0.25mmol，1当量)，DIPEA(0.17mL)和TBTU(88mg，0.28mmol，1.1当量)添加到5mLDCM中，并将所得溶液于室温搅拌30分钟，然后添加(S)-(-)-3-氨基奎宁环二盐酸盐(60mg，0.30mmol，1.2当量)。然后反应混合物在室温搅拌16小时，然后用DCM稀释，并依次用水(x2)，50％饱和碳酸氢钠水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)，并在真空中浓缩。残余物溶于最少量的EtOAc中，然后添加正庚烷以沉淀(S)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎宁环-3-基)苯甲酰胺(白色固体，0.075g，55％)。

Rt＝3.04分钟(分析_1)；MS(+ve)：546.5；MS(-ve)：544.6；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.59-0.74(2H，m)，0.86-0.97(2H，m)，1.20-1.43(1H，m)，1.45-1.75(7H，m)，1.76-1.98(4H，m)，2.66-2.86(3H，m)，2.89-3.07(1H，m)，3.17(3H，s)，3.47(3H，s)，3.89-4.02(4H，m)，4.76-4.96(1H，m)，7.42-7.59(2H，m)，7.70(1H，s)，7.98(1H，s)，8.14(1H，d，J＝6.3Hz)，8.40(1H，d，J＝7.8Hz)。

化合物[377]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将2′-氯-9′-环戊基-5′-甲基-8′，9′-二氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-6′(5′H)-酮(中间体4)(0.065g，0.2mmol，1当量)，4-氨基-N-(反-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(中间体11)(0.24g，0.6mmol，3当量)和TFA(75μL，1mmol，5当量)在TFE(6mL)中一起加热至回流40小时。反应混合物在真空中浓缩，且将残余物分配于EtOAc和饱和碳酸氢钠中。分离有机层，用饱和盐水洗涤，并在真空中浓缩得到残余物，其通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丁烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺。

Rt＝3.41分钟(分析_1)；ES(+ve)：671.6；ES(-ve)：669.7；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.03(2H，dd，J 9.5Hz，5Hz)，0.41(2H，dd，J 10Hz，5Hz)，0.79(1H，m)，1.20-1.37(4H，m)，1.55-1.94(18H，m)，2.04(2H，d，J 6.5Hz)，2.16-2.46(8H，m)，3.15(3H，s)，3.32(2H，s)，3.69(1H，m)，3.90(3H，s)，4.79(1H，m)，7.44(2H，m)，7.68(1H，s)，8.01(2H，m)，8.34(1H，d，J 8.5Hz)。

化合物[378]：4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将2-氯-9-环戊基-5-甲基-8，9-二氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-6(7H)-酮(中间体1)(0.13g，0.43mmol，1当量)，4-氨基-N-(反-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(中间体11)(0.26g，0.67mmol，1.5当量)和TFA(0.17mL，2.2mmol，5当量)在TFE(3mL)于80℃一起加热18小时。再加入定量的中间体1(0.10g)，且反应进一步加热48小时。反应混合物在真空中浓缩，且残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化，用0→20％氨/MeOH/DCM梯度洗脱，然后通过制备HPLC(制备_4)纯化，最后通过制备RP-HPLC-MS(制备_1)纯化，得到4-(9-环戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-N-((反)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(0.11g，26％)。

Rt＝2.88分钟(分析1)；ES(+ve)：631.5；ES(-ve)：629.6；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：-0.15-0.11(m，2H)，0.40(d，J＝8.06Hz，2H)，0.63-0.85(m，1H)，1.11-1.41(m，3H)，1.57(br.s.，2H)，1.69(d，J＝17.73Hz，2H)，1.74-1.95(m，6H)，2.04(s，2H)，2.09(d，J＝6.45Hz，2H)，2.16(d，J＝9.67Hz，1H)，2.32(br.s.，2H)，2.49(br.s.，1H)，2.51-2.59(m，2H)，2.59(br.s.，1H)，3.07-3.17(m，3H)，3.27(s，5H)，3.53-3.62(m，2H)，3.67(dd，J＝7.41，3.55Hz，1H)，3.89(s，2H)，4.04(q，J＝5.37Hz，1H)，4.76(五重峰，J＝8.22Hz，1H)，7.38-7.48(m，2H)，7.68(s，1H)，7.99(d，J＝7.74Hz，1H)，8.03(s，1H)，8.33(d，J＝8.06Hz，1H)。

中间体13-19：4-(胺-取代的)环己胺

1.[类似于Abdel-Magid A.F.等人.(1996)J.Org.Chem.，61，3849-3862中的方法III]三乙酰氧基硼氢化钠(1.5当量)，乙酸(1当量)，胺(1.1当量)，THF，室温20小时；2.H₂，10％Pd/C，60℃，甲醇，流动氢化；3.碘化钠(4当量)，三甲基氯硅烷(4当量)，乙腈，0℃-室温，18小时。

步骤1：

将N-苄基氧基羰基-4-氨基环己酮(本领域[WO2007/002181A2]中已知的化合物)(通常1mmol的范围)与乙酸和三乙酰氧基硼氢化钠一起加入到含THF(5mL)、适宜取代的-哌嗪、-高哌嗪或吗啉的反应管中。反应在环境温度搅拌20小时。反应用NaHCO₃溶液(2mL)终止，然后用1N HCl溶液酸化至pH2。混合物用EtOAc洗涤，然后分离水层，并用2N NaOH溶液碱化至pH10。产物萃取到EtOAc中，其用饱和NaCl洗涤，干燥(MgSO₄)，并在减压下蒸发，得到所需的4-(胺-取代的)环己基氨基甲酸苄基酯。

步骤2：

将各个4-(胺-取代的)环己基氨基甲酸苄基酯溶于甲醇中，浓度为0.05M。使用下述条件进行氢化：H-Cube^TM(ThalesNano Inc.)流动反应器，1mL/分钟的流速，经加热至60℃的10％Pd/C催化剂，在完全氢模式(fullhydrogen mode)下。减压下浓缩，得到所需的4-(胺-取代的)环己烷胺产物，为固体。固体盐酸盐能够通过用HCl乙醚溶液搅拌得到。

当需要在N-苄基存在下选择性脱保护苄基氨基甲酸酯(中间体16&18)时，使用步骤3代替步骤2。

步骤3：

将碘化钠(1.5mmol，4当量)溶于无水乙腈(5mL)中，并搅拌，同时加入三甲基氯硅烷(1.5mmol，4当量)。5分钟后，将该混合物缓慢加入到4-(胺-取代的)环己烷胺溶于无水乙腈(2mL)的溶液(在冰水浴中冷却)中。1小时后，移除冷却浴，且反应混合物在环境温度搅拌18小时。反应混合物在减压下浓缩，并再溶于1％水/甲醇溶液中。混合物吸附到SCX II柱上，用甲醇洗涤，并用氨/甲醇洗脱。在真空中浓缩，得到所需的4-(胺-取代的)环己烷胺。

nd＝无数据(在标准条件下没有检测到离子化)

化合物[379]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-乙基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(66mg，0.15mmol，1当量)，DIPEA(52μl，0.3mmol，2当量)和TBTU(54mg，0.17mmol，1.1当量)添加到1.5mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后添加4-(4-乙基哌嗪-1-基)环己烷胺(中间体13)三盐酸盐(58mg，0.18mmol，1.2当量)和DIPEA(78μL，0.45mmol，3当量)。然后反应混合物在室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-乙基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(无色玻璃状，26mg，28％)。

Rt＝3.00分钟(分析_1)MS(+ve)631.6；MS(-ve)629.7；Rt＝3.00分钟(分析_1)MS(+ve)631.6；MS(-ve)629.7；1H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.59-0.72(2H，m)，0.81-0.92(2H，m)，0.97(3H，t，J＝7.1Hz)，1.20-1.42(4H，m)，1.42-1.55(2H，m)，1.54-1.64(2H，m)，1.64-1.73(2H，m)，1.83(2H，d，J＝11.7Hz)，1.89(4H，d，J＝7.8Hz)，2.14-2.42(7H，m)，3.16(3H，s)，3.47(2H，s)，3.64-3.79(1H，m)，3.94(3H，s)，4.84(1H，五重峰，J＝8.7Hz)，7.40-7.54(2H，m)，7.67(1H，s)，7.98(1H，s)，8.03(1H，d，J＝7.8Hz)，8.38(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[380]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((顺)-4-(4-乙基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

从化合物[379]的合成和纯化分离单个化合物4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((顺)-4-(4-乙基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(无色玻璃状，27mg，29％)。

Rt＝3.13分钟(分析_1)MS(+ve)631.6；MS(-ve)629.7；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.60-0.72(2H，m)，0.83-0.93(2H，m)，0.98(3H，t，J＝7.1Hz)，1.38-1.55(6H，m)，1.55-1.63(2H，m)，1.63-1.80(4H，m)，1.80-1.96(4H，m)，2.02-2.17(1H，m)，2.16-2.44(7H，m)，3.16(3H，s)，3.47(2H，s)，3.79-3.92(1H，m)，3.94(3H，s)，4.84(1H，五重峰，J＝8.5Hz)，7.44-7.58(2H，m)，7.67(1H，s)，7.98(1H，s)，8.03(1H，d，J＝7.3Hz)，8.37(2H，d，J＝8.8Hz)。

化合物[381]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-(4-(4-(环丙基甲基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(88mg，0.2mmol，1当量)，DIPEA(70μl，0.4mmol，2当量)和TBTU(72mg，0.24mmol，1.2当量)添加到2mL DMF中，且将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后添加4-(4-(环丙基甲基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己烷胺(中间体14)(60mg，0.24mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-(4-(4-(环丙基甲基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺，为顺式和反式异构体的混合物(灰白色固体，67mg，50％)。

Rt＝4.12分钟(宽峰)(分析_1)MS(+ve)671.6；MS(-ve)669.7；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.01(2H，d，J＝4.4Hz)，0.40(2H，d，J＝7.3Hz)，0.63(2H，br.s.)，0.71-0.83(1H，m)，0.87(2H，br.s.)，1.02(1H，t，J＝7.1Hz)，1.25-1.38(2.5H，m)，1.39-1.52(3.5H，m)，1.52-1.61(2H，m)，1.65(4H，d，J＝5.9Hz)，1.70-1.80(3H，m)，1.85(3H，d，J＝4.4Hz)，2.21-2.31(1H，m)，2.55-2.83(8H，m)，3.13(3.5H，s)，3.35-3.55(3H，m)，3.69(0.5H，br.s.)，3.91(3.5H，s)，4.31(0.5H，t，J＝5.1Hz)，4.81(1H，t，J＝8.5Hz)，7.25-7.54(2H，m)，7.64(1H，s)，7.84-8.16(2H，m)，8.35(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[382]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-(4-(4-乙基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(44mg，0.1mmol，1当量)，DIPEA(35μl，0.2mmol，2当量)和TBTU(36mg，0.12mmol，1.2当量)添加到1mL DMF中，且所得溶液在室温搅拌20分钟，然后添加4-(4-乙基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己烷胺(中间体15)三盐酸盐(32mg，0.1mmol，1当量)和DIPEA(53μL，0.3mmol，3当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-(4-(4-乙基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺，为顺式和反式异构体的混合物(白色固体，10mg，16％)。

Rt＝3.98分钟，4.18分钟(宽峰)(分析_1)MS(+ve)645.6；MS(-ve)643.7；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.57-0.74(2H，m)，0.82-0.93(2H，m)，0.95-1.09(3H，m)，1.30-1.42(2H，m)，1.42-1.54(3.5H，m)，1.58(2H，d，J＝4.4Hz)，1.63-1.75(3.5H，m)，1.75-1.83(1.5H，m)，1.88(3.5H，br.s.)，1.98-2.16(1.5H，m)，2.59-2.86(4H，m)，3.17(4H，s)，3.41-3.53(3.5H，m)，3.78(2.5H，m)，3.88-4.02(3.5H，m)，4.06-4.38(1H，m)，4.76-4.91(1H，m)，7.39-7.57(2H，m)，7.59-7.78(1H，m)，7.98(2H，s)，8.31-8.45(1H，m)

化合物[383]：N-(4-(4-苄基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己基)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(66mg，0.15mmol，1当量)，DIPEA(52μl，0.3mmol，2当量)和TBTU(54mg，0.17mmol，1.1当量)添加到1mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后添加溶于DMF(0.5mL)的4-(4-苄基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己烷胺(中间体16)(54mg，0.19mmol，1.27当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_5)纯化，得到N-(4-(4-苄基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)环己基)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺，为顺式和反式异构体的混合物(灰白色固体，33mg，31％)。

Rt＝4.40分钟(分析_1)MS(+ve)707.6；MS(-ve)705.7；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.73(2H，br.s.)，0.96(2H，br.s.)，1.22-2.22(19H，m)，2.64-2.91(4H，m)，3.23(5H，s)，3.53(8H，s)，3.89-4.24(4H，m)，4.91(1H，t，J＝8.5Hz)，5.82(0H，s)，7.23-8.54(10H，m)。

化合物[384]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(66mg，0.15mmol，1当量)，DIPEA(52μl，0.3mmol，2当量)和TBTU(54mg，0.17mmol，1.1当量)添加到1mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后加入溶于DMF(0.5mL)的4-(4-甲基哌嗪-1-基)环己烷胺(中间体17)(35mg，0.18mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2和制备_3)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((反)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(白色固体，17mg，18％)。

Rt＝2.85分钟(分析_1)MS(+ve)617.5；MS(-ve)615.6；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.61-0.76(2H，m)，0.89(1H，t，J＝6.8Hz)，0.92-0.98(2H，m)，1.22-1.47(5H，m)，1.47-1.79(6H，m)，1.81-2.02(5H，m)，2.07-2.20(3H，m)，2.20-2.42(4H，m)，3.20(4H，s)，3.34(3H，s)，3.51(2H，s)，3.67-3.82(1H，m)，3.98(3H，s)，4.88(1H，五重峰，J＝8.5Hz)，7.42-7.59(2H，m)，7.71(1H，s)，8.02(1H，s)，8.08(1H，d，J＝7.8Hz)，8.42(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[385]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((顺)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺

从化合物[384]的合成和纯化分离单个化合物4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-N-((顺)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)环己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(白色固体，34mg，37％)。

Rt＝2.93分钟(分析_1)MS(+ve)617.5；MS(-ve)615.6；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.62-0.80(2H，m)，0.84-1.02(4H，m)，1.18-1.36(4H，m)，1.43-1.84(12H，m)，1.84-2.03(4H，m)，2.09-2.22(4H，m)，2.41(4H，br.s.)，3.21(3H，s)，3.52(2H，s)，3.89-3.97(1H，m)，3.99(3H，s)，4.89(1H，五重峰，J＝8.5Hz)，7.47-7.61(2H，m)，7.72(1H，s)，8.03(1H，s)，8.08(1H，d，J＝7.3Hz)，8.43(1H，d，J＝9.3Hz)。

化合物[386]：N-((反)-4-(4-苄基哌嗪-1-基)环己基)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(66mg，0.15mmol，1当量)，DIPEA(52μl，0.3mmol，2当量)和TBTU(54mg，0.17mmol，1.1当量)添加到1mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后添加溶于DMF(0.5mL)中的4-(4-苄基哌嗪-1-基)环己烷胺(中间体18)(35mg，0.18mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到N-((反)-4-(4-苄基哌嗪-1-基)环己基)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(白色固体，13mg，13％)。

Rt＝3.64分钟(分析_1)MS(+ve)693.6；MS(-ve)691.7；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.62-0.79(2H，m)，0.85-1.02(2H，m)，1.20-1.46(4H，m)，1.46-1.58(2H，m)，1.59-1.67(2H，m)，1.67-1.78(2H，m)，1.80-2.02(6H，m)，2.12(1H，s)，2.18-2.46(6H，m)，3.20(3H，s)，3.43-3.56(5H，m)，3.67-3.84(1H，m)，3.97(3H，s)，4.88(1H，五重峰，J＝8.4Hz)，7.22-7.42(6H，m)，7.44-7.59(2H，m)，7.71(1H，s)，8.02(1H，s)，8.08(1H，d，J＝7.8Hz)，8.42(1H，d，J＝7.8Hz)。

化合物[387]：N-((顺)-4-(4-苄基哌嗪-1-基)环己基)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺

从化合物[386]的合成和纯化分离单个化合物N-((顺)-4-(4-苄基哌嗪-1-基)环己基)-4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(白色固体，20mg，19％)。

Rt＝3.85分钟(分析1)MS(+ve)693.6；MS(-ve)691.7；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.62-0.79(2H，m)，0.87-1.01(2H，m)，1.43-1.59(5H，m)，1.59-1.67(2H，m)，1.66-1.74(2H，m)，1.75-1.84(2H，m)，1.92(4H，br.s.)，2.07-2.29(2H，m)，2.41(4H，br.s.)，3.20(3H，s)，3.51(4H，s)，3.87-4.05(4H，m)，4.74-4.99(1H，m)，7.24-7.39(5H，m)，7.50-7.56(2H，m)，7.71(1H，s)，8.02(1H，s)，8.07(1H，d，J＝6.8Hz)，8.42(1H，d，J＝8.8Hz)。

化合物[388]：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-((反)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺

将4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体6)(66mg，0.15mmol，1当量)，DIPEA(52μl，0.3mmol，2当量)和TBTU(54mg，0.17mmol，1.1当量)添加到1.5mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后添加4-吗啉代环己烷胺(中间体16)(33mg，0.18mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-((反)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺(灰白色固体，10mg，11％)。

Rt＝3.16分钟(分析_1)MS(+ve)606.4；MS(-ve)604.5；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：1.07-1.18(7H，m)，1.24-1.49(4H，m)，1.58-1.71(4H，m)，1.71-1.84(2H，m)，1.83-2.03(6H，m)，2.23(1H，t，J＝10.5Hz)，2.43-2.51(3H，m)，3.17-3.28(4H，m)，3.42(3H，br.s.)，3.60(4H，br.s.)，3.64(1H，br.s.)，3.71-3.83(1H，m)，3.98(3H，s)，5.23(1H，t，J＝8.3Hz)，7.44-7.60(2H，m)，7.72(1H，s)，8.02(1H，s)，8.09(1H，d，J＝7.8Hz)，8.40(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[389]：4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-((顺)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺

从化合物[388]的合成和纯化分离单个化合物4-(9-环戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氢-5H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂-2-基氨基)-3-甲氧基-N-((顺)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺(白色固体，22mg，24％)。

Rt＝3.31分钟(分析_1)MS(+ve)606.4；MS(-ve)604.5；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：1.13(6H，s)，1.39-1.60(4H，m)，1.60-1.71(4H，m)，1.71-1.85(4H，m)，1.85-2.01(4H，m)，2.07-2.22(2H，m)，2.42-2.48(4H，m)，3.22(4H，s)，3.64(4H，br.s.)，3.87-4.05(4H，m)，5.14-5.31(1H，m)，7.45-7.62(2H，m)，7.71(1H，s)，8.02(1H，s)，8.09(1H，d，J＝7.3Hz)，8.39(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[390]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-((反)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺

将4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中间体5)(66mg，0.15mmol，1当量)，DIPEA(52μl，0.3mmol，2当量)和TBTU(54mg，0.17mmol，1.1当量)添加到1.5mL DMF中，并将所得溶液于室温搅拌20分钟，然后添加4-吗啉代环己烷胺(中间体16)(33mg，0.18mmol，1.2当量)。然后将反应混合物于室温搅拌2小时，然后通过制备RP-HPLC-MS(制备_2)纯化，得到4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-((反)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺(灰白色固体，13mg，14％)。

Rt＝2.96分钟(分析_1)MS(+ve)604.4；MS(-ve)602.5；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.72(2H，s)，0.95(2H，s)，1.24-1.49(4H，m)，1.49-1.60(2H，m)，1.60-1.69(2H，m)，1.69-1.82(2H，m)，1.82-2.03(6H，m)，2.14(1H，s)，2.17-2.32(1H，m)，3.22(4H，s)，3.53(2H，s)，3.61(4H，br.s.)，3.71-3.84(1H，m)，4.00(3H，s)，4.90(1H，五重峰，J＝8.5Hz)，7.43-7.61(2H，m)，7.73(1H，s)，8.04(1H，s)，8.10(1H，d，J＝7.8Hz)，8.44(1H，d，J＝8.3Hz)。

化合物[391]：4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-((顺)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺

从化合物[390]的合成和纯化分离单个化合物4-(9′-环戊基-5′-甲基-6′-氧代-5′，6′，8′，9′-四氢螺[环丙烷-1，7′-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮杂]-2′-基氨基)-3-甲氧基-N-((顺)-4-吗啉代环己基)苯甲酰胺(白色固体，27mg，30％)。

Rt＝3.10分钟(分析_1)MS(+ve)604.4；MS(-ve)602.5；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm：0.66-0.81(2H，m)，0.88-1.03(2H，m)，1.45-1.86(12H，m)，1.87-2.02(4H，m)，2.10-2.21(1H，m)，2.47(4H，br.s.)，3.22(3H，s)，3.52(2H，s)，3.65(4H，br.s.)，3.89-4.05(4H，m)，4.90(1H，五重峰，J＝8.5Hz)，7.50-7.63(2H，m)，7.73(1H，s)，8.03(1H，s)，8.10(1H，d，J＝7.3Hz)，8.43(1H)。

实施例3

通过PCR分离由HeLa mRNA分离全长人CDC25C克隆体，并在BamHI-HindIII片段上插入到pRsetA中。从该载体上切下CDC25C的氨基末端片段(编码残基1-300)，并插入到pET28a(NcoI和BamHI位点之间)。在T7启动子的控制下表达，编码蛋白在羧基末端带His₆标记物。将载体转移到大肠杆菌株BRL(DE3)pLysS中用于表达实验。CDC25C在BL21(DE3)RIL细菌细胞中表达，在LB培养基中于37℃生长，直到OD_600nm为0.6。表达用1mM IPTG诱导，并将细菌培养物再生长3小时。通过离心收集细菌，并将细胞沉淀物再悬于50mM Tris pH7.5和10％蔗糖中，快速冷冻，并存储于-70℃直到使用。CDC25C蛋白从大肠杆菌包含体中纯化。包含体在缓冲液(50mM Tris pH8.0，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％triton X-100)中分离。在6M尿素存在下变性后，蛋白通过缓慢渗析尿素而再折叠。将该蛋白存储于25mM Tris pH8.0，100mM NaCl，1mM DTT，1mM EDTA和10％甘油(-70℃)中，直到使用。

来自胎肺cDNA库，利用引物插入到限制酶位点的方法来扩增全长人PLK1(XM_047240)(氨基酸1-603)克隆体。5’引物(gccgctagcgacgatgacgataagatgagtgctgcagtgactgcagggaagc)在ATG起始密码子之前具有Nhe1位点。将3’引物(ggaattcttaggaggccttgagacgg)插入到EcoR1位点前的终止密码子。将PCR产克隆到杆状病毒表达载体pSSP1的Nhe1/EcoR1位点。克隆到该载体导致在PLK1构建体的氨基末端带有His₆标记物融合。将传代数小于20的Sf9细胞分离，得到300mL培养体积，细胞密度为1.5x10⁶细胞/mL。细胞仅用于对数生长期中的表达。加入PLK1杆状病毒(来自P2扩增)，得到传染倍数为3，即相当于每个昆虫细胞3个病毒颗粒。烧瓶在27℃培养，同时以100r.p.m.振摇48小时。收集后，检测细胞密度和存活率，培养物以2500r.p.m.旋转5分钟，并用冰冷的磷酸盐缓冲的盐水洗涤。洗涤液以相同速度再旋转，且沉淀物快速冷冻。PLK1蛋白在金属亲和柱上纯化。昆虫细胞沉淀物在缓冲液(10mMTris-HCl pH8.0，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，1mM PMSF，1mM苄脒，20mM咪唑和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)中裂解，且将预清除的上清液负载于NiNTA-琼脂糖(Qiagen)上。该亲和柱用裂解缓冲液洗涤，且结合的蛋白用在相同缓冲液中的250mM咪唑洗脱。对25mM Tris HCl，pH7.5，100mM NaCl，1mM DTT，1mM PMSF，1mM苄脒，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)和10％甘油渗析过夜后，纯化的蛋白存储于-70℃直到使用。

实施例4

PLK1蛋白激酶测试使用96-孔板形式通过在20mM Tris/HCl缓冲液pH7.5(补充有25mM β-甘油磷酸酯，5mM EGTA，1mM DTT和1mMNaVO₃)中培养CDC25C(2μg/孔)和PLK1(1μg/孔)进行。加入在测试缓冲液中的一系列稀释的测试化合物。反应通过加入100μM ATP和0.5μCi的[γ-³²P]-ATP引发。反应混合物在30℃培养1小时，然后用75mM正磷酸水溶液终止，转移至96-孔P81过滤板(Whatman)中，干燥，且CDC25C磷酸化的程度使用Packard TopCount板读取器通过闪烁计数评估。原始实验数据通过非线性回归分析参数进行分析，且IC₅₀值使用下述方程确定：y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))，其中y为％抑制，A为最小抑制，B为最大抑制，C为EC₅₀，且D为斜率因子。

细胞增殖测试使用人肿瘤细胞系(获自American Type Culture Collection，10801 University Boulevard，Manessas，VA 20110-2209，USA)进行。进行标准72-h MTT(噻唑基蓝；3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)实验(Loveland等人，Biochem.Int.，1992，27，501；Haselsberger等人，AntiCancer Drugs，1996，7，331)。简言之：根据倍增时间，将细胞接种于96-孔板中，并在37℃培养过夜。将测试化合物溶解于DMSO中，在100μL细胞培养基中制备1/3系列稀释液，加入到细胞中(一式三份)，并在37℃培养72小时。将MTT溶液于细胞培养基中，作为5mg/mL的储备液，并过滤灭菌。从细胞中移出培养基，然后用200μL PBS洗涤。然后加入MTT溶液，每孔20μL，并在黑暗处37℃培养4小时。移除MTT溶液，且细胞再次用200μL PBS洗涤。MTT染料用DMSO(每孔200μL)溶解，同时搅拌。在540nm读取吸光度，并使用曲线拟合软件(GraphPad Prism 3.00版，用于Windows，GraphPad Software，San Diego California USA)分析以确定IC₅₀值(抑制细胞生长50％的测试化合物的浓度)。

实施例5

PLK选择性

表4显示的是与所选的现有技术化合物相比，相对于PLK2和PLK3，化合物[218]对PLK1具有选择性。为了说明，本发明的化合物[218]对PLK1比PLK2的选择性是WO 07/095188的化合物[I-64]的2倍，是WO07/095188的化合物[I-76]的约6-倍，且是化合物[I-4]的7-倍。相似地，化合物[218]对PLK1比PLK3的选择性是WO 07/095188的化合物[I-64]的5倍，是WO 07/095188的化合物[I-76]的约12-倍，且是化合物[I-4]的5倍。

实施例6

溶解度研究

表5表明当与现有技术中已经已知的结构相关的化合物相比时，化合物[254](下图框中的结构)具有优异的溶解度和/或药代动力学性质。

WO07/095188 WO 07/095188

中的实施例I-76 化合物[254] 中的实施例I-253

WO 08/002958

中的实施例246

比浊度研究

如果将水溶性化合物的DMSO溶液加入到水性缓冲液中，混合物保持澄清，除非达到水溶解度极限。在溶解度极限以上，出现沉淀，且通过浑浊的混悬液的光被散射。散射光的强度测量是浊度溶解度检测的基础。

所选的化合物利用比浊计筛选以鉴定浊度出现时的浓度，由此得到动态溶解度指数。通过浊度法(2％DMSO：98％磷酸盐缓冲的盐水pH7.5)，化合物[254]在200μM(＞0.11mg/mL)是随意可溶的，其在该测试中是最高的浓度。相反，在相同的浊度法测试中，现有技术WO 07/095188的实施例[I-253]的最大可溶浓度测定为75μM(表6)。这表明化合物[254]在用于研究体外化合物活性的浓度范围于水性缓冲液中更加可溶。

药代动力学研究

为了体内研究化合物，通常需要更高的浓度。为了获得更高的浓度，通常使用盐形式的化合物。

化合物[254]和WO 07/095188的实施例[I-76]在多种药学相关溶剂混合物(可以用于将化合物给予活生物体)中以游离碱和盐酸盐进行研究。通过在溶剂中加热溶解化合物，将溶液冷却至25℃，并观察。冷却后没有形成沉淀，过饱和混合物易于形成凝胶状中间相，其不适合或不方便用于给药。从表5中所示数据可以清楚地看出化合物[254]及其HCl盐与实施例[I-76]及其相关HCl盐相比具有一贯地更好的溶解特性。

向小鼠通过静脉注射给药实施例[I-76]的HCl盐，其为在3％DMA 97％水中的溶液。通过达到化合物在稳定溶液中的最大浓度，判断最大耐受剂量。在最大耐受剂量，没有观察到异种移植物抗肿瘤作用(qdx7给药)，因为给药的化合物浓度不足。相反，水溶性明显更高的化合物[254]及其盐能够在更能够产生治疗疾病效果的浓度进行注射。

实施例8

化合物[371]的药代动力学性质

(a)方法学

所选化合物药代动力学的初步研究在禁食的有意识CD-1小鼠(25-30g)中进行。化合物以1mg/kg通过静脉给药或5-10mg/kg通过口服途径给药。每种给药途径21只雄性小鼠(每个时间点n＝3只小鼠)通过在尾静脉单次推注或通过口饲法给药溶液。血液样品通过心脏穿刺在静脉内给药后5、15、30、60、120、240和360分钟收集，以及在口服给药后30、60、120、240、360、480和1440分钟收集。将血液样品收集到含抗凝血肝素锂的管中，混合，并迅速放在碎冰上。通过离心从全血获得血浆，冷冻并存储于-80℃，待分析用。血浆浓度通过液相色谱-联用电喷雾阳离子模式的质谱(ESI LC/MS/MS)进行检测，使用在适合基质中制备的校准曲线。在所有情况中较低水平定量(lower level of quantification)(LLOQ)为约5ng/mL。血浆浓度-时间数据使用电脑程序WinNonLin 5.2版进行处理，从中通过非-区划(non-compartmental)分析利用Model 201(IV-bolus输入)或Model 200(Extravascular输出)计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUCall)。

(b)化合物[371]和[378]与所选的现有技术化合物的比较

将化合物[371]和[378]与一系列相关类似物比较进行进一步的药代动力学分析(参见表7；化合物[371]，相应于化合物H；化合物[378]，相应于化合物I)。

图1表明了每种测试化合物的血浆浓度对时间的曲线下面积(AUC)。这些实验中给予的溶媒保持恒定(静脉＝柠檬酸盐缓冲液pH3，1mL/kg；口服＝DMA/PEG400/10mM酒石酸盐缓冲液，pH4(1∶3∶6)，5ml/kg)。图2表示对于每种化合物口服生物利用度形式(％F)的相同数据。

结果表明化合物H和I与化合物A-G相比表现出明显更优的全身暴露和口服生物利用度。

实施例9

(a)细胞流量数据

使用体外细胞存活测试以检测药物在配对的亲代和药物抵抗肿瘤细胞系中的累积。所用的配对为人卵巢癌A2780系与其MDR对应体(counterpart)A2780/ADR，和人子宫肉瘤MES-SA系与其MDR对应体MES-SA/Dx5[Wesolowska O.，等人.(2005)Anticancer Res.，25，383-389]。

方法：将卵巢细胞系A2780及其多柔比星-抵抗配对A2780/ADR，以及子宫细胞系MES-SA及其多柔比星-抵抗配对MES-SA/DX5的培养的人肿瘤细胞以每孔3000细胞接种于Nunc 96-孔组织培养板中，每孔100μl，于含10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM培养基中。在每板中第一栏的孔中装有100μl DMEM培养基代替细胞以提供对于Alamar Blue的空白对照。将细胞在37℃和5％CO₂培养过夜。将溶于DMSO的感兴趣的化合物以不同浓度加入到细胞中。化合物的稀释液首先在DMEM制备，浓度为最终所需浓度的2倍，并将100μl该稀释液加入到细胞中。每类化合物在每种细胞系中一式三份进行测试。培养72小时后，将20μl Alamar Blue试剂(AbD Serotec)添加到每孔中，并培养3小时。然后在544/595nm读板。

反应的Alamar Blue试剂的量表示细胞的代谢活性。计算相对细胞活性，表示为对照(无化合物的细胞)的百分比，并获得活性化合物抑制细胞50％(IC₅₀)的浓度。该值从3个单独检测的平均值计算得到，并以空白校正(仅有培养基的对照)。

该测试在Biomek FxP(来自Beckman Coulter的自动化平台)上进行。在配有Beckman Coulter的Paradigm板读数器上读板。计算不对称比(Asymmetry ratios)，表示为化合物在药物抵抗的细胞中的IC₅₀值除以在亲代细胞中的IC₅₀值。图3显示的是所选化合物与现有技术化合物A′-J′(表8中限定的)在亲代和MDR肿瘤细胞中的比较。不对称比以相对于化合物[378]表示。

(b)PLK1的抑制

此外，与现有技术的化合物相比，在细胞存活测试中表现出低MDR/亲代细胞不对称的本发明化合物在抑制MDR肿瘤细胞中PLK1也更加有效。因此，它们作为治疗性PLK抑制剂更有效。中间体纤丝蛋白波形蛋白为PLK1磷酸化的细胞靶点。PLK1的抑制与磷酸-波形蛋白的降低相关。这已在A2780-A2780/ADR细胞系配对中进行了检测。

方法：将A2780细胞和A2780/ADR细胞置于独立的96-孔板(PerkinElmer)中，密度为20000细胞/孔，并在37℃和5％CO₂培养过夜。以一系列的浓度将测试化合物添加到细胞中，对于每种浓度的孔一式三份(细胞中DMSO的最高浓度为0.1％)。培养7小时后，将细胞固定在冰冷的3.7％甲醛中，保持10分钟。细胞在PBS中洗涤，然后在冷甲醇中渗透10分钟。细胞再次在PBS中洗涤，然后用含0.1％Triton X-100的PBS培养5分钟。细胞用含1％牛血清白蛋白的PBS(Sigma)洗涤，然后用对于磷酸-组蛋白H3-Ser10(1∶4000；Millipore)和磷酸-波形蛋白-Ser82(1∶1000；MBL)的抗体在1％牛血清白蛋白中培养3小时。抗体使用缀合至Alexafluor 488的山羊抗-小鼠IgG(Invitrogen)和缀合至Alexafluor 546山羊抗-兔IgG(Invitrogen)，于具有300nM DAPI的1％牛血清白蛋白(CambridgeBiosciences)中进行检测。板在Cellomics Arrayscan II HCS Reader(Cellomics)上使用10X物镜扫描。使用Cell Health Profiling V2 Bioapplication(Cellomics)获得和分析成像。仅在有丝分裂细胞(通过磷酸-组蛋白H3的存在限定)中检测磷酸-波形蛋白染色，强度高于用户限定的阈值，且对于每板报导每个有丝分裂细胞的平均染色强度。IC₅₀值为使用3个一式三份的孔的平均值获得。计算不对称比，表示为在药物抵抗的A2780/ADR细胞中的化合物的IC₅₀值除以在亲代A2780细胞中的IC₅₀值。图3显示的是在亲代和MDR肿瘤细胞中所选化合物与现有技术化合物A′-J′的比较(表8中限定的)。如上所述，不对称比以相对化合物[378]表示。

本发明所述方面的多种改变和变化对于本领域技术人员是明显的没有背离本发明的范围和精神。虽然本发明结合具体优选的实施方案进行描述，但应该理解本发明不应限于这些具体的实施方案。事实上，进行本发明所述的方式的多种改变对于相关领域技术人员是明显的，且包括在所附权利要求的范围内。

表1：对于所选的本发明化合物的PLK IC₅₀值(μM)；^***表示＜0.1μMIC₅₀；^**表示＜1.0μM IC₅₀；^*表示＜10.0μM IC₅₀