实施方式
根据本发明涉及的四吡咯化合物制备方法的实施方式，优选在贫营养培养基培养大肠杆菌，再从所述贫营养培养基中分离、回收四吡咯化合物，从而制备得到具有卟啉环结构的四吡咯化合物。即，本发明是在培养基中培养、增殖大肠杆菌的过程中，使大肠杆菌产生四吡咯化合物，通过回收分泌到培养基中的四吡咯化合物来制备四吡咯化合物。为了防止培养基中的某些天然物质等成分妨碍四吡咯化合物的分离，因此作为培养基优选使用贫营养培养基。作为贫营养培养基，优选含有葡萄糖或乳糖的培养基，但并不限定于此。
在本发明中使用的大肠杆菌优选基因ypjD(b2611)由于突变而无法表达的大肠杆菌。可举例源于K12株及BL21株的大肠杆菌等。例如，优选源于K12株的基因ypjD(b2611)由于突变而无法表达的大肠杆菌。作为基因ypjD(b2611)由于突变而无法表达的大肠杆菌，可举例插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株。在所述突变株中，基因ypjD(b2611)的表达处于部分或完全缺失的状态。其次，K12株可以从国家生物资源中心(National BioResource)得到，BL21株可以从例如Takara Bio得到。另外，作为插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株，可举例为，能从国家生物资源中心(NationalBioResource)获得的JD23504等。
在本实施方式中，首先，将大肠杆菌在贫营养培养基中培养。此时优选将大肠杆菌在贫营养培养基以外的适当培养基(例如LB培养基等)中进行预培养，再将得到的预培养物接种到贫营养培养基中进行培养。
大肠杆菌的培养条件，采用大肠杆菌常规培养条件即可。当将大肠杆菌进行预培养后，变换培养基，而在贫营养培养基中进行培养时，这对无论何种培养条件都是相同的。例如，使用LB培养基在15℃～40℃的温度下预培养6小时～24小时后，将得到的细胞悬浊液再于贫营养培养基中在20℃～40℃的温度下培养12小时～96小时。由此，培养基中的细胞增殖，就可以得到目标四吡咯化合物带有特有色调的培养物(产物)。
其次，可如下从上述培养物中分离目标四吡咯化合物。
具体而言，培养物通过离心分离得到上清液，将其过滤后采用例如离子交换树脂色谱柱或反相色谱柱从滤液中吸附、分离四吡咯化合物。例如，培养物用离心机使细胞沉淀，得到含有培养物(产物)的上清液。接着，将上述上清液用一定孔径(如0.22μm)的滤膜过滤后，再利用上述色谱柱吸附于离子交换树脂。随后可用例如20％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液等从离子交换树脂洗脱出产物后，进行冷冻干燥。另外，此情况中的洗脱也可使用含有酸或碱的溶液的有机溶剂。根据本实施方式可以得到1种或2种以上的四吡咯化合物，例如，从500mL的细胞悬浊液中可得数～数十mg的四吡咯化合物。
将由上述操作分离的产物经NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)等分析，可以证实含有四吡咯化合物。此外，对该产物进行吸光度分析，可知是在染料的特定波长范围内有吸收的化合物。很多情况下是显示出与叶绿素、血红素或酞菁类似的双吸收峰的染料化合物。这类染料化合物可作为由光激发电子的光催化剂或电子传递物而使用。另外，由于其在水溶液中或经由细胞膜参与氧化还原反应，因此认为其在电池中也能发挥作用。
如上所述，根据本发明，使用大肠杆菌可以制备卟吩、卟啉及卟啉络合物等卟啉类四吡咯化合物及含有金属的四吡咯化合物或络合物，不需要像化学合成法那样，根据目标化合物的种类选择制备装置、催化剂，且不需要使用溶剂，对环境产生不良影响的危险较少。另外，在培养大肠杆菌时，也不需要向培养基中添加5-氨基酮戊酸等四吡咯化合物的前体，并且只需回收分泌到培养基中的四吡咯化合物，不需要从菌体中提取。即，根据本发明培养大肠杆菌或回收四吡咯化合物由于不需要特定的化合物或装置，可以简便地制备四吡咯化合物。这样获得的四吡咯化合物可以在医疗、食品及电子学等各种产业领域使用。
在本实施方式中，向贫营养培养基中添加含有在所述培养基中作为离子的金属元素或作为离子而解离的金属元素的化合物，由此得到含该金属的四吡咯化合物或络合物。作为金属，只要在培养基中成为离子的金属即可。而所述含金属的化合物需可溶于酸性、碱性或中性水溶液。作为上述金属元素可举例选自金(Au)、铜(Cu)、钾(K)、锰(Mn)、锌(Zn)及钌(Ru)中的至少1种金属。此外，金属可以以无机金属化合物或有机金属化合物的状态添加。作为无机金属化合物，可举例上述金属的硫酸盐、碳酸盐、硝酸盐、硫代硫酸盐、氧化物、氮化物或卤化物。而作为有机金属化合物，可举例金硫苹果酸钠及苹果酸锌等。
由上所述，通过向贫营养培养基中添加含有在所述培养基中的作为离子的金属元素或作为离子而解离的金属元素的化合物，可得到色调与金属种类相对应的四吡咯化合物或络合物。即，在培养基中培养大肠杆菌，则被摄入大肠杆菌细胞内的金属元素或金属化合物，通过大肠杆菌基因的作用，被转化成带有各种金属所赋予的色调的化合物。之后，所述化合物在细胞中作为产物被吐出，通过从培养基中回收就可得到作为染料有用的化合物。为了得到所需色调的化合物，选择与该色调对应的金属即可，不必像化学合成法那样，为每种目标化合物开发新的方法。此外，得到的化合物除可在光催化剂、电池等领域以外，还可在光记忆介质、信息记忆介质、电子传递介质、半导体元件及电极等领域适用。
此外，本发明并不限于上述实施方式，可以在不脱离本发明宗旨的范围内实施各种变形。
以下说明本发明的实施例。
实施例
实施例1：
将插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株(NationalBioResource JD23504)在2mL LB培养基(细菌用胰蛋白胨：1％、细菌用酵母提取物：0.5％，NaCl：0.5％)中于37℃的温度预培养12小时。得到的细胞悬浊液取1mL接种到水溶液(9g KH2PO4、21gK2HPO4、2g(NH4)2SO4、1g柠檬酸二水合物、3.6g葡萄糖及100mgMgSO4溶解于1L去离子水中制得)中，于37℃的温度下培养24小时。
经过24小时的培养，培养液的颜色由开始培养时的无色转为粉红色。该培养液离心分离后使细胞沉淀，得到的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤。接着使滤液通过填充阴离子交换树脂的柱后，将树脂吸附的培养物用20％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液洗脱，对洗脱物进行冷冻干燥。由此，就可得到带有粉红色的产物。
对该产物进行下述各仪器分析，可以证实是具有图1所示结构的四吡咯化合物。图1中的标记A～G与图4所示13C NMR谱的标记对应，其他图中也一样。接着，对产物进行NMR分析，证实含有四吡咯化合物。之后，用ICP(电感耦合等离子体)质量分析检测出了钾(K)，因此回收到钾与离子结合或形成络合物的化合物。接着进一步对其进行吸光度分析，如图2所示，可以证实是含索雷带的卟啉所特有的双吸收峰。图2中在波长395nm及波长549nm处分别有峰。由此证实，产物为游离电子可传递的有机染料。
上述得到的四吡咯化合物溶于不同溶剂中(样品1及2)、进行二维NMR测定(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)，解析谱，进行结构解吸。
对于样品1，将样品用CD3OD溶解，按以下条件进行NMR测定。
●装置：INOVA500型(varian公司制)
●共振频率：499.8MHz(1H)
●基准：3.31ppm(CD2HOD、1H NMR)
49.421ppm(CD3OD、13C NMR)
●累计次数：1H NMR(16次)、13C NMR(53428)、COSY(16次)、NOESY(8次)、HSQC(32次)、HMBC(128次)
●其他：NOESY的混合时间设定为400毫秒。
其次，对于样品2，将样品用溶剂CD3CN∶D2O∶CD3COOD＝90∶10∶0.1溶解，按以下条件进行NMR测定。
●装置：INOVA600型(varian公司制)
●共振频率：599.8MHz(1H)
●基准：1.92ppm(CD2HCN、1H NMR)
1.28ppm(CD3CN、13C NMR)
●累计次数：1H NMR(64次)、13C NMR(50000)、COSY(16次)、NOESY(16次)、HSQC(32次)、HMBC(128次)
●其他：NOESY的混合时间设定为400毫秒。
关于样品1的结构解析：
图3示1H NMR谱(溶剂：CD3OD)。结果为，在10.0～10.5ppm附近(d)、4.3ppm附近(f)、3.6ppm附近(g)及3.2ppm附近(e)观测到推测为源于目的成分的信号。各信号强度比约为1∶2∶3∶2。这里的d～g在其他图中也是相同的。
图4示13C NMR谱。由B、C的信号推定为芳香族化合物。
该图中，从化学位移值来看，1H NMR的d信号为通常不可见的特征信号，且考虑到是芳香族化合物，则卟啉骨架作为候选被考虑到。如下所述，将二维NMR谱(图5～9)解析为卟啉并不矛盾。另外，在J.org.Chem.Vol.164，No.21，1999(7973-7982)中记载了与图1的推定结构类似的化合物，其1H NMR化学位移值显示相当好的一致性，因此推断为卟啉结构是合理的。
以下说明二维NMR解析。
图5示HSQC谱。HSQC谱是检测J1CH的测定法。解析结果如图所示。关于质子信号，进行直接结合的碳的编号的大写字母编号。
图6示COSY谱。COSY谱是检测1H-1H间自旋结合的测定法。由解析结果可知f和e自旋结合，从信号强度比及F与E的化学位移值来看，是-CH2-CH2-X的可能性极高。其中，X为结构不明的未确定成分。
图7示HMBC谱。HMBC谱是检测JnCH(n＝约2～4)的测定法，可以得到异核远隔结合相关谱。解析该谱的结果，得到(e，A)、(e，B)、(e，F)、(g，B)、(g，C)、(f，A)、(f，B)、(f，C)、(f，E)等的相关。这些相关与图1所示推定结构不矛盾。
图8及图9示NOESY谱。NOESY谱是检测磁化交换的测定法，从由交叉驰豫引起的磁化传递可以得到有关核自旋间距离的信息。解析该谱得到的结果，在(g，e)、(f，g)、(f，e)、(d，f)、(d，e)、(d，g)观测到NOE相关。这些NOE相关支持图1所示的推定结构。
关于样品2的结构分析：
图10示1H NMR谱，图11示13C NMR谱(溶剂：CD3CN∶D2O∶CD3COOD＝90∶10∶0.1)。图10中方框围起来的信号为杂质。与上述样品1的谱进行比较的结果，推测主成分结构相同。这也可从COSY、NOESY、HSQC及HMBC各谱的分析结果得到支持。
图12为样品2的NOESY谱的放大图。观测到d质子分离成4种，按磁场由小到大的顺序(从数字小的一方开始)进行编号：d1～d4。其NOE相关汇总如下。
●d1及d4与甲基和-CH2-CH2-X有NOE相关。
●d2与仅-CH2-CH2-X有NOE相关。
●d3与仅甲基有NOE相关
这里没有明确观测到甲基间或-CH2-CH2-X间的NOE相关，由此得到了图1侧链的配置。
对于13C信号及1H信号的编号而言，将在几乎相同的区域中观测到的信号统一进行编号。这是由于卟啉骨架是重复结构，从而详细归属困难。至于重复的个数而言，由于观测到的甲基(g)有4个，因此推断为4。
综上所述，由样品1及2的分析结果能够得到图1的结构。只是作为侧链的甲基及-CH2-CH2-X各共4个即可，附加位置只要是图1所示8个位置中的任一个就不与数据矛盾，因此不限于图1所示的附加位置。
以下，对于-CH2-CH2-X中相当于X的部分进行探讨。
对上述得到的产物进行以下分析。
(1)由热分解GC/MS的定性分析
为了去除TFA，将样品于加热炉内280℃加热10min后在600℃进行热分解，将分解产物用下述气相色谱/质量分析装置(以下简称“GC/MS”)进行分离分析。
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测定样品：将0.5mL向2mg样品加入了1mL AcCN的溶液注入样品杯中，氮气清洗流去除AcCN。
(2)由电喷雾-质量分析装置分析：
为了确定溶液中成分的分子量，用下述电喷雾-质量分析装置(以下简称“ESI-MS”)进行分析。
装置名称：Applied Biosystems制Qstar
导入溶剂：AcCN/0.05％甲酸水溶液(50/50)
导入方法：用30μL环直接导入测定溶液。
测定模式：阳性模式
测定溶液：在管形瓶中取少量向2mg样品加入1mL AcCN的溶液后，用导入溶剂稀释到约100ppm。
用上述GC/MS进行分析，结果从样品中检测到二氧化碳。并且，根据用上述ESI-MS进行分析的结果(图14)，由于检测到分子量59的碎片离子(峰为4个)，证实该碎片含有乙酯或乙酸基(丙酸基)。
接着，对上述产物用热分解GC-MS进行分析，如图15所示，主要成分为吡咯化合物。这可以通过将各成分的质谱与数据库进行比对得到证实，证实分子中含有吡咯环结构。关于具体的分子量，如图13所示，以附加有氢离子的离子而被检测出，分子量655.2760-1.0078＝654.2682。综上所述，可以证实是侧链含有4个乙酯或乙酸基(丙酸基)及4个甲基的，分子量为654、分子式为C36H38O8N4的卟啉化合物。
实施例2：
将插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株(NationalBioResource JD23504)在2mL LB培养基(细菌用胰蛋白胨：1％、细菌用酵母提取物：0.5％，NaCl：0.5％)中于37℃的温度预培养12小时。得到的细胞悬浊液取1mL接种到水溶液(20mg MnCl2、1g柠檬酸二水合物、3.6g葡萄糖及100mg MgSO4溶解于1L去离子水中制得)中，于37℃的温度下培养24小时。
经过24小时的培养，培养液的颜色由开始培养时的无色转为红褐色。该培养液离心分离后使细胞沉淀，得到的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤。接着使滤液通过填充阴离子交换树脂的柱后，将树脂吸附的培养物用20％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液洗脱，对洗脱物进行冷冻干燥。由此，就可得到带有红褐色的产物。
接着，对上述产物用热分解GC-MS进行分析，如图16所示，主要成分为吡咯化合物。这可以通过将各成分的质谱与数据库进行比对得到证实，证实分子中含有吡咯环结构。另外，根据ESI-MS质量分析结果，得出该化合物分子量为707(图17)，进一步根据MS/MS测定结果，依次检测出4个分子量为59的碎片(图18)，同实施例1一样，由于通过热分解GC/MS分析检测出CO2，认定含有共4个乙酯或乙酸基(丙酸基)。显示橙色色调的该产物的吸光谱如图19所示。
此外，根据XPS元素分析(图20)知道含有Mn，根据上述详细的质量分析的结果可以证实，本实施例的产物是与实施例1的产物具有相同的卟啉化合物结构的化合物，但由实施例1的产物的质量654.2682与本实施例的产物的质量(如图17所示，得到分子量为707.1905)的详细的质量差，得知本实施例的产物是在实施例1的产物的中央脱掉2个氢原子，并配位上3价Mn离子(分子量654.2682-1.0078×2+54.9380(Mn的分子量)＝707.1906，与实测值几乎一致。)的产物。
综上所述，可以证实是侧链含有4个-CH2-CH2-COOH(丙酸基)及4个甲基的，分子量(离子质量)为707的，离子式为[C36H36O8N4·Mn(III)]+的卟啉化合物。
实施例3：
将插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株(NationalBioResource JD23504)在2mL LB培养基(细菌用胰蛋白胨：1％、细菌用酵母提取物：0.5％，NaCl：0.5％)中于37℃的温度预培养12小时。得到的细胞悬浊液取1mL接种到水溶液(25mg金硫苹果酸钠、1g柠檬酸二水合物、3.6g葡萄糖及100mg MgSO4溶解于1L去离子水中制得)中，于37℃的温度下培养24小时。
经过24小时的培养，培养液的颜色由开始培养时的无色转为黄色。该培养液离心分离后使细胞沉淀，得到的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤。接着使滤液通过填充阴离子交换树脂的柱后，将树脂吸附的培养物用20％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液洗脱，对洗脱物进行冷冻干燥，由此，就可得到带有黄色的产物。对该产物进行ICP质量分析，证实含有金(Au)。进一步，对上述产物用热分解GC-MS进行分析，证实主要成分为吡咯化合物，分子中含有吡咯环结构。
实施例4：
将插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株(NationalBioResource JD23504)在2mL LB培养基(细菌用胰蛋白胨：1％、细菌用酵母提取物：0.5％，NaCl：0.5％)中于37℃的温度预培养12小时。得到的细胞悬浊液取1mL接种到水溶液(20mg CuCl2、1g柠檬酸二水合物、3.6g葡萄糖及100mg MgSO4溶解于1L去离子水中制得)中，于37℃的温度下培养24小时。
经过24小时的培养，培养液的颜色由开始培养时的无色转为蓝绿色。该培养液离心分离后使细胞沉淀，得到的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤。接着使滤液通过填充阴离子交换树脂的柱，将树脂吸附的培养物用20％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液洗脱，对洗脱液进行冷冻干燥。由此，就可得到带有绿色的产物。对该产物进行ICP质量分析，证实含有铜(Cu)。进一步，对上述产物用热分解GC-MS进行分析，证实主要成分为吡咯化合物，分子中含有吡咯环结构。
实施例5：
将插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株(NationalBioResource JD23504)在2mL LB培养基(细菌用胰蛋白胨：1％、细菌用酵母提取物：0.5％，NaCl：0.5％)中于37℃的温度预培养12小时。得到的细胞悬浊液取1mL接种到水溶液(17mg ZnCl2、1g柠檬酸二水合物、3.6g葡萄糖及100mg MgSO4溶解于1L去离子水中制得)中，于37℃的温度下培养24小时。
经过24小时的培养，培养液的颜色由开始培养时的无色转为略带红色的绿色。对该培养液按实施例1记载的方法进行处理，得到带有绿色的产物。
对该带有绿色色调的培养产物根据TOF-MS法进行质量分析，结果如图21所示，为分子量落入307～1294范围内的混合物，再对其进行ICP质量分析，证实产物含有锌(Zn)。从图22所示吸光度曲线可以知道，在372nm及445nm处有2个峰。进一步，对上述产物用热分解GC-MS进行分析，证实主要成分为吡咯化合物，分子中含有吡咯环结构。
实施例6：
将插入了基因ypjD(b2611)的转座子的突变株(NationalBioResource JD23504)在2mL LB培养基(细菌用胰蛋白胨：1％、细菌用酵母提取物：0.5％，NaCl：0.5％)中于37℃的温度预培养12小时。得到的细胞悬浊液取1mL接种到水溶液(10mg RuCl3、1g柠檬酸二水合物、3.6g葡萄糖及100mg MgSO4溶解于1L去离子水中制得)中，于37℃的温度下培养24小时。
经过24小时的培养，培养液的颜色由开始培养时的无色转为蓝绿色。该培养液离心分离后使细胞沉淀，得到的上清液用孔径0.22μm的滤膜过滤。接着使滤液通过填充阴离子交换树脂的柱，将树脂吸附的培养物用20％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液洗脱，对洗脱液进行冷冻干燥。由此，就可得到带有绿色的产物。对该产物进行ICP质量分析，证实含有钌(Ru)。进一步，对上述产物用热分解GC-MS进行分析，证实主要成分为吡咯化合物，分子中含有吡咯环结构。