转基因水稻胚乳在遗传学演示实验上的应用 本发明涉及生物学教学器具领域，具体地，本发明涉及一种可用于遗传学教学和转基因教学的转基因胚乳或子叶及含所述胚乳或子叶的相应教学器具。
植物转基因技术已经成为当今生物工程领域中的一门重要技术，广泛应用于植物遗传学研究和育种实践。越来越多的转基因植物也从实验室的实验材料，逐步成为有直接经济价值的品种和商品。
随着分子遗传学理论和技术的发展，基因已经不再是一个模糊的、可望而不可及的概念，而作为具体的、具有实际功能的、可以进行操作的一段DNA序列，正在被分离、克隆和重组。一个物种的基因，通过转基因技术可以导入到另一个物种中去，并可以使它在生物体的某一特定组织或细胞中表达。利用相关的检测技术不仅能证明它的存在，而且能观察到或获得它相应的表达产物。这种突飞猛进的发展，无疑向遗传学教学和实验提出了新的教学任务，如何使转基因方面的知识更普及，更提高。
生命科学是一门实验科学，学生对知识的摄取不仅要靠老师地传授和自己的阅读，而且，还需要相应的实验来证明，这样才有助于理解和提高。进行基因的有关实验，既要有专业知识和技术，还要有仪器设备和经费的支撑，这就给安排实验带来了一定困难。对转基因教学(例如植物转基因教学)而言，由于缺乏必要的实验条件和受时间的限制，不可能让学生亲自动手进行转基因植物的培育，而且，也没有合适的实验材料可供学生实验，让他们直接观察转基因的结果，或证明被转基因在植物中的真实存在。
为了传播转基因植物方面的知识，丰富遗传学教学的实验内容，本领域迫切需要建立转基因植物演示实验以及相关的器具，以便通过实验让学生观察到被转的外源基因的真实存在和转基因后代的遗传分离。
本发明的目的就是提供一种新的用于遗传学教学和转基因教学的转基因胚乳或子叶及相应的器具，从而满足实验教学内容要有代表性，材料选择要有可操作性，课时安排要有时间性，仪器设备和费用要简单便宜等多方面的要求。
在本发明的第一方面，提供了一种胚乳或子叶，所述胚乳或子叶含有β-葡萄糖苷酸酶，该β-葡萄糖苷酸酶是在胚乳或子叶形成过程中由植物自身产生的。较佳地，所述的植物选自下组：水稻、大麦、玉米、小麦、拟南芥、油菜、白菜。更佳地，所述的植物是水稻。
在本发明的第二方面，提供了上述胚乳或子叶的用途，其特征在于，它被用于制造用于生物学教学的器具。
在本发明的第三方面，提供了一种教学器具，它包括：
一基板，在基板上设有至少一个放置孔；
其中，所述的放置孔内放置植物胚乳或子叶，其中至少部分所述胚乳或子叶含有β-葡萄糖苷酸酶，该β-葡萄糖苷酸酶是在胚乳或子叶形成过程中由植物自身产生的。
在本发明的一优选例中，放置孔的数目为1-10000个，更佳地为10-5000个，最佳地为20-2500个。
在本发明的另一优选例中，所述基板上还设为对照区，所述对照区有至少一个放置孔，用于放置非转基因的植物胚乳或子叶。
在本发明的另一优选例中，所述教学器具还包括一封闭件，用于封闭基板的放置孔。较佳地，所述的封闭件是塑料膜，例如采用的保鲜膜。
在附图中，
图1是GUS转基因水稻植株试管苗照片。
图2是GUS转基因水稻植株PCR检测电泳图。
图3是GUS转基因水稻植株Southern检测电泳图。
图4是GUS转基因水稻胚乳的GUS检测照片。
图5是p13W4质粒的T-DNA区的结构图。其中，TSS：转录起始位点；ATG：翻译起始密码子；232Wx-pro：232品种的蜡质基因动启子；GUS-β-葡萄糖苷酸酶；Wx frag：蜡质基因756bp反义序列；E-EcoR I，B-BamH I，X-Xba I，S-Sal I，P-Pst I，H-Hind III。
本发明人经过多年广泛而深入的研究，发现植物的胚乳或子叶其实是一种较合适的教学材料，并在此基础上培育了一批可供实验用的GUS转基因水稻，并制造了相应的教学材料，建立了一套正确、快速检测目的基因存在的实验方法，从而实现了本发明。
胚乳(endosperm)是大多数有花植物种子中的营养组织。胚乳包住胚并通过一个独特的过程产生，该过程与雄性配子对卵细胞的受精过程相似。来自花粉粒的第二雄性配子与胚囊中的两个雌核发生融合，因此胚乳细胞是三倍体，含有三套染色体。胚乳中含有种子发芽时利用的养料储备，如淀粉、脂肪和蛋白质。
子叶(cotyledon)是被子植物或裸子植物的胚中的一个结构，它在发芽后可变成第一个绿叶。子叶在胚中数目是被子植物分类学上的一个重要特征。单子叶植物(例如禾本科植物、棕榈和百合)有单片子叶，而双子叶植物(被子植物的大多数种类)有两片。在裸子植物的每粒种子中可能有不多于12片子叶。在含有胚乳的种子中，子叶较薄。然而，当子叶是主要的养料贮存组织时，子叶可以非常大，例如在豌豆和蚕豆种子中的子叶。特别适用于本发明的子叶是含有淀粉等营养成分，在种子中主要作为营养贮存组织的子叶。
适用于本发明的胚乳或子叶，可来自双子叶或单子叶植物，尤其是禾本科、十字花科和豆科植物。合适的植物例子包括(但并不限于)：水稻、大麦、玉米、小麦、拟南芥、油菜、白菜。
较佳地，本发明的胚乳或子叶已经与种壳分离。
以下以胚乳为例，进一步阐述本发明。
为了使转基因胚乳区别与未转基因的胚乳，一种优选的方法是用GUS基因。Gus基因编码β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)，该酶催化β-葡萄糖苷酯类水解。β-葡萄糖苷酸酶存在于某些细菌体内，不存在于包括水稻在内的绝大多数植物细胞中。
β-葡萄糖苷酸酶也可对一些人工合成的底物进行催化反应，在使用X-Gluc(5-溴-4-氯-3吲哚-β-葡萄糖苷酸酯)试剂作为底物时，通过显色反应就可直接观察到组织器官中Gus基因的活性。当该基因存在并表达时，它产生的酶可将X-Gluc水解成蓝色物质，用肉眼或显微镜就可观察到它的存在。如果Gus基因不存在或不表达，X-Gluc就不能水解，也就无法形成蓝色物质。通常这种颜色反应在保温条件下，30-45分钟就能完成。Gus基因已经被分离克隆，而且，常作为植物转基因研究中的报道基因，用于检测外源基因的导入、表达以及组织特异性表达的研究。
为了使外源GUS基因在胚乳中表达，可使用指导基因在胚乳表达的启动子。对于不同的植物，可选用不同的启动子。对于水稻而言，一种合适的启动子是水稻蜡质基因的启动子。水稻蜡质基因是一种编码结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(starch granule bound starch synthase)基因，它具有只在胚乳和花粉粒组织中表达的特点，这种特定的时空表达是由蜡质基因的启动子决定的(中国专利申请99124204.1，1999年12月2日提交申请)。
利用本领域常规的基因重组技术，用蜡质基因的启动子替换掉Gus基因本身的启动子，就可构建成一个蜡质基因启动子和Gus基因组成的融合结构，这个融合结构中的Gus基因表达就具有蜡质基因的时空表达特点。利用转基因技术，将这个融合结构导入水稻。如果融合结构确已整合在染色体上，并且能正常表达的话，那么，这种转基因植株上收获的种子，用X-Gluc溶液处理，就能在胚乳组织中直接观察到蓝色物质存在。
由于融合结构的插入是随机的，当它以不同拷贝数插入染色体上，插入的外源Gus基因在染色体的减数分裂过程中，会随同同源染色体的分离，形成不同的雌雄配子，受精结实的种子中，就能观察到蓝颜色和非蓝颜色的胚乳存在，这种颜色分离可通过卡方测验，检查孟德尔分离规律。
在本发明的另一方面，提供了一种水稻蜡质基因启动子和Gus基因组成的融合质粒，以及由该质粒通过遗传转化，获得的具有β-葡萄糖苷酸酶的水稻胚乳和相关禾本科植物胚乳的方法。
具体地，一种产生GUS转基因水稻的方法包括如下步骤：
(1)制备载体，该载体含处于蜡质基因的启动子控制下的GUS基因；
(2)用步骤(1)的载体转化农杆菌；
(3)用步骤(2)的农杆菌转化水稻，得到GUS转基因水稻。
利用步骤(3)中的GUS转基因水稻或其子代，就可获得GUS转基因种子或胚乳。虽然完整的具有繁殖力的GUS转基因种子也可用于教学用途，但是作为教学用途的转基因胚乳，宜没有繁殖力(即去除了种壳或胚)，以防止转基因植物的扩散。
就教学方法而言，如前所述，在生物学教学中，至今还没有一套可供学生实验用的，并在短时间内直接演示被转基因在植物中真实表达的实验方法。通过基因重组技术构建成蜡质基因启动子和Gus基因组成的融合结构，使Gus基因表达具有蜡质基因的时空表达特点，再利用转基因技术，将这融合结构导入水稻，使这种转基因植株种子中的胚乳组织具有Gus基因表达特点，用X-Gluc溶液处理胚乳，就能在30分钟内直接观察到因Gus基因表达而显示的蓝色物质存在。这种生物学教学实验方法是前所未有的。
就教学材料而言，通过转基因技术将Gus基因转入水稻，获得转基因水稻种子，用种子的胚乳与X-Gluc溶液处理，转基因胚乳产生蓝色颜色反应，具有良好的重演性。此外，水稻胚乳无法繁殖，防止基因的扩散和飘移，充分满足了安全性方面的要求。Gus基因表达产物的检测能在30分钟内完成，适合实验课时间的要求。水稻胚乳小容易剥取、解剖和保存。作为学生实验用材料具备了实验重演性、可操作性、时间性、方便性等特点。此外，胚乳作为教学材料还具有成本低的优点。
就教学器具而言，为了达到演示转基因结果和分离规律存在的实验教学目的，选用了本发明的教学器具作为主要实验器具。一种常用的教学器具是多孔细胞培养板，例如96孔板或其他规格的多孔板。多孔板的各孔可将胚乳隔开，既可充分演示各胚乳所显示的颜色反应结果，防止胚乳间颜色反应的污染；也便于统计胚乳颜色分离的数目。细胞培养板孔径小，可限制胚乳大小和X-Gluc溶液的体积，有效地节省试剂和试材。此外，一种优选的教学器具是塑料细胞培养板，它轻巧和壁薄，不易破碎；容易感温和浮在水面。当然，玻璃或陶瓷等其他材质的多孔板也是优选的。
本发明的优点在于：
1.通过转基因水稻胚乳与X-Gluc反应，观察到转基因的结果，即呈蓝色的胚乳。从而可以在短时间内清楚、有效地显示转基因水稻中转入的Gus基因的真实存在，达到演示的目的。这种实验方法和材料在遗传学教学中还没有先例。
2.通过转基因水稻胚乳与X-Gluc反应，观察转基因后代的遗传分离，并通过卡方测验，来检测其分离比是否符合孟德尔分离规律，可以加深学生对基因概念和分离规律的理解。
3.转基因水稻种子多，胚乳小而且容易操作和保存，具有实验材料方便性的特点。
4.实验中多孔细胞培养板的应用，孔径小而且可将各胚乳隔开，既可以显示各胚乳的颜色反应结果，也便于统计胚乳颜色分离的数目，又可以节省试剂。具有实验方便、节省费用的优点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
GUS转基因水稻胚乳的制备
一、材料
(1)p13W4质粒。p13W4质粒由中国科学院上海植物生理所王宗阳教授构建并提供，构建过程如下：
将水稻蜡质基因翻译起始点(ATG)5′上游区3.1kb的DNA片段与Gus基因编码区及胭脂碱合成酶基因(Nos)的终止子构建成蜡质基因-GUS融合结构。为了适宜于农杆菌介导转化水稻，再将这一融合结构构建在双元载体pCAMBIA1300的多克隆位点中，获得双元载体p13WG3.1。该质粒上有一BamHI限制性酶切位点，它位于蜡质基因启动区与Gus基因编码区之间，在该质粒p13WG3.1的BamH I位点上插入一段反方向的蜡质基因BamH I片段(来自籼稻品种232中蜡质基因第2333位bp到第3087位bp的BamH I片段，转录起始点为第1位bp)，就构建成p13W4质粒(图5)。
(2)供试根癌农杆菌菌种：EHA105
(3)水稻组织培养培养基：
愈伤组织诱导培养基：N6D2+2mg/L 2，4-D+0.5g/L水解酪蛋白+1.8g/LGelerite。
共培养培养基：N6D2+2mg/L 2，4-D+0.5g/L水解酪蛋白+1.8g/L Gelerite。
抗性筛选培养基：N6D2+50mg/L潮霉素+500mg/L羧苄青霉素钠。
分化培养基：MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L ZT+0.5mg/L KT+0.2mg/LNAA+0.25g/L水解酪蛋白+25mg/L潮霉素+500mg/L羧苄青霉素钠+1.8g/LGelerite。
生根培养：1/2MS+0.5mg/L NAA+25mg/L潮霉素+500mg/L羧苄青霉素钠+1.8g/L Gelerite。
(4)农杆菌培养基：
YEB固体培养基；YEB液体培养基；AB培养基；AAM培养基(AAM)：AA培养基的盐分和氨基酸加MS培养基的维生素、0.5g/L水解酪蛋白、36g/L葡萄糖、68.5g/L蔗糖、19.6mg/L乙酰丁香酮。其中YEB和AB培养基均加卡那霉素50mg/L。
(5)供试水稻品种：中花11粳稻品种
二、方法
(1)转化：
通过冻融法将p13W4质粒导入根癌农杆菌EHA105菌种。
(2)农杆菌培养：
取单菌落接种于YEB液体培养基，28℃振荡培养24h。次日吸取0.5ml菌液接入50mlAB液体培养基中，再在28℃振荡培养24h。次日在4000转条件下离心收集菌体，菌体再重新悬浮于1/2体积的AAM培养基中，供愈伤组织共培养之用。
(3)水稻愈伤组织诱导和遗传转化：
取授粉10～14天未成熟水稻种子，经70％乙醇、2％NaClO溶液消毒和用无菌水冲洗后，用解剖刀挑出幼胚并接种于N6D2培养基诱导愈伤组织，7天后，取盾片处长出的愈伤组织浸泡于AAM农杆菌培养液中，轻微振荡20min，取出愈伤组织并吸干菌液，转至铺有无菌滤纸的N6D2C培养基上，26℃下暗培养3天。共培养后的愈伤组织，转入N6D2S1的选择培养基上，15天后从中挑取正常生长的愈伤组织，转入N6D2S2的选择培养基上筛选，经两次筛选后，取抗性愈伤组织转至分化培养基，进行15h/日光照培养。7天后出现绿点，10～15天后形成小苗，转入1/2MSNH培养基生根后，移至温室盆栽，并收获种子(图1)。将种子的颖壳与胚乳和胚分开，然后切去胚获得胚乳。
实施例2
转基因植株的分子鉴定
(1)PCR检测
用常规方法(如CTAB方法)提取转基因植株叶片的总DNA，然后，用PCR引物扩增导入的外源GUS基因片段。引物w4P1(5′-TGGCAAGAACAAGCATAGACC-3′)与反义waxy基因编码链的一段DNA序列互补，引物w4P2(5′-TAACATACGGCGTGACATCG-3′)与GUS基因编码链的一段DNA序列互补，扩增反应的系统为：
10×反应缓冲液 5μl
2mmol 4×dNTPs 5μl
引物w4P1 50pmol
引物w4P2 50pmol
模板DNA 100ng水稻总DNA
TaqDNA聚合酶 2个单位
加ddH2O至50μl
扩增反应的条件：94℃，5min，55℃，5min，加TaqDNA聚合酶；
94℃，45sec，64℃ 45sec，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。
扩增后取6μl扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
结果如图2所示：从左至右为泳道1-12。其中，泳道1为分子量标准，泳道2为对照，泳道3-12为转基因植株。未转化植株中扩增不到相应的626bp大小的DNA片段，转基因植株中均能扩增到相应大小的DNA片段。
(2)Southern分子检测
按Sombrook等的方法，取15ug水稻DNA，经限制性内切酶消化和0.8％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶上DNA经脱嘌呤，变性和中和后，用毛细管法将DNA转移到尼龙膜上，经80℃干燥2小时后，尼龙膜在68℃预杂交液中预杂交2小时，然后加入标记好的探针DNA(GUS基因片段)，并于68℃杂交液中杂交过夜，杂交膜经洗脱后，进行-70℃放射自显影5-7天。
结果如图3所示。图3(上)为总DNA经EcoR I消化，以GUS基因片段为探针的Southern杂交。各泳道是1：p13W4质粒DNA/EcoR I；2：未转基因植株DNA；3-9：转基因植株DNA。
图3(下)为总DNA经Hind III消化，以GUS基因片段为探针的Southern杂交。各泳道是1：p13W4质粒DNA/BamH+Sca I；2：p13W4质粒DNA/HindIII；3：未转基因植株DNA；4-9：转基因植株DNA。
分子杂交证明，转基因植株中都能检测到与GUS基因片段杂交的DNA条带存在，外源GUS基因的确已转入水稻植株。
实施例4
转基因胚乳的Gus基因检测
自交结实的胚乳经X-Gluc溶液在37℃处理30分钟，能观察到有蓝色胚乳出现，这证明转入的外源基因能正常表达。
实施例4
教学实验器具和方法
一、教学器具
96孔塑料细胞培养板；水浴锅或保温瓶；手工刀；玻璃或塑料毛细吸管；15′10cm保鲜膜；X-Gluc溶液和70％酒精。转基因水稻的胚乳和未转基因水稻胚乳。
二、实验方法
1. 水浴锅或保温瓶的水温调至37℃。
2.将转基因实验组和未转基因实验组种子分开，对每粒种子切取五分之一胚乳，按组分别将切取的胚乳放入96孔细胞培养板中，每孔一粒，并对二组胚乳分别做上记号(余下的胚乳可供下一次实验用)。
1.吸管吸取适量X-Gluc溶液，按孔滴入，使胚乳浸没(X-Gluc试剂价格昂贵，为了节约试剂，切取的胚乳要小，溶液只要浸没胚乳就可以)。
4.为了防止溶液蒸发，将保鲜膜复在细胞培养板上，然后，将细胞培养板小心地漂浮在37℃水中，严防水浴锅中的水进入加有X-Gluc溶液和胚乳的孔中。
5.保温30分钟后，取出细胞培养板，揭去保鲜膜，观察结果。能在转基因实验组的胚乳中观察到有的胚乳呈蓝色，有的胚乳仍呈白色的颜色分离。未转基因实验组的胚乳全部呈白色。
6.可用70％的酒精进行保存。
三、结果
结果如图4所示，在转基因实验组的胚乳中观察到有的胚乳呈蓝色，有的胚乳仍呈白色的颜色分离。未转基因实验组的胚乳全部呈白色。
四、论述
通过实验可以在转基因组中观察到有蓝色的胚乳存在，这种蓝色的胚乳是由于转入了Gus基因，编码产生了β-葡萄糖苷酸酶，这种酶将试剂中的X-Gluc水解成蓝色物质的结果。而未转基因组的胚乳全部呈白色，这是因为未转基因组的胚乳中没有Gus基因，因此，X-Gluc就不能水解，也就无法形成蓝色物质。
转基因组的胚乳中观察到有的胚乳呈蓝色，有的胚乳仍呈白色，这种颜色分离是染色体分离的结果。Gus基因是从某些细菌中分离和克隆到的基因，对水稻而言是外源基因。通过转基因方法将其插入到水稻染色体上后，它和其他染色体上的内源基因一样，也是按照孟德尔遗传规律，在减数分裂过程中会发生分离重组。因此，在杂合型的转基因水稻植株上收获的种子，就Gus基因而言，同样也存在分离，当其胚乳与X-Gluc溶液保温反应后，在不同籽粒的胚乳中可以直接观察到颜色分离的现象。
由于转基因组检测的胚乳数目较多，而且胚乳又被各自隔开，因此，可以通过卡方测验，来检测其分离比是否符合孟德尔分离规律。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。