一种可使其产物分泌到细胞外的嵌合杀虫蛋白基因.pdf

一种可使其产物分泌到细胞外的嵌合杀虫蛋白基因
    本发明属植物基因工程领域，涉及用化学方法合成了由苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白CrylAb(N端编码331个氨基酸)和CrylAc部分(C端编码284个氨基酸)组成的融合蛋白基因Btlm的1848个碱基对序列，合成的基因在植物中表达后可赋于转基因植物高抗虫性。为了使植物中表达的Btlm杀虫蛋白能分泌到细胞外的细胞间隙以提高杀虫蛋白的稳定性，同时减轻Bt杀虫蛋白对植物细胞正常功能的干扰作用，有利于筛选到农艺性状变化不大的抗虫转基因植物，本发明在合成了上述杀虫蛋白基因Btlm基础上又在其5′端连接了一个人工合成的编码烟草致病相关蛋白PRlb信号肽的核苷酸序列，从而组建成一个1947bp的嵌合杀虫蛋白基因BtSlm。用Btlm和BtSlm构建植物表达载体后转化了烟草和棉花，从转化再生植株中可选到高效抗虫转基因植物，转基因烟草的虫试结果表明表达BtSlm的植株抗虫性高于表达Btlm的。

    苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体蛋白可作为生物农药特异地毒杀某些昆虫，该晶体蛋白被昆虫摄取后，在昆虫肠道的碱性条件下溶解产生130KD左右的前毒素分子。经肠道蛋白酶水解前毒素的C端被降解，最后产生由N端65-70KD组成的毒蛋白。该毒蛋白的N端一段残基(就CrylA而言为28个)也要被肠蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒蛋白。活化地毒蛋白与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合，插入到中肠细胞膜上形成0.5-1.0nm的小空或离子通道，引起胞内离子的外渗及水的内渗，结果细胞溶涨破裂，大量细胞遭到破坏，使幼虫停止进食而死亡。已证明Bt晶体蛋白对人体无毒性作用，所以Bt制剂已作为一种无公害的天然的微生物杀虫剂在农业、林业及环境卫生等方面应用了五十多年，Bt制剂的产量也在逐年增加。但由于在自然条件下Bt晶体蛋白稳定性差，不能渗透到组织内部以及杀虫谱窄等因素的限制使该生物杀虫剂的发展一直受到很大的制约，所以目前对农业害虫的防治主要还是靠化学杀虫剂。八十年代中期随着植物基因工程技术的成熟、Bt基因克隆的成功及对Bt晶体蛋白杀虫剂机制研究的深入，使人们有可能将Bt基因转入植物获得可表达杀虫蛋白的抗虫转基因植物。目前，全世界已有二十六种以上的Bt转基因植物，包括棉花，玉米，水稻、马铃薯等主要农作物。这些转基因植物都获得了明显的抗虫性。

    野生型Bt晶体蛋白基因在转基因植物中的表达量非常低。在CaMV35S启动子驱动下其表达量约占总可溶性蛋白的0.001％左右，所以不能使转基因植物获得毒杀多数对Bt毒蛋白不太敏感的昆虫的能力，如很多农作物的主要鳞翅目害虫。

    Perlark等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324-3328，1991)根据植物基因的密码子使用频率及可能影响植物mRNA稳定性的基序在保持原Bt基因编码的氨基酸序列不变前提下，对Bt晶体蛋白基因Cryl Ab和CrylAc进行了部分改造或全部重新合成。部分改造和重新合成的基因在转基因植物中表达的杀虫蛋白量比野生型基因的表达量分别提高了约10倍和100倍。然而，Bt基因在植物中的表达调控有许多问题仍待进一步研究，Bt转基因植物的实际应用中在有些方面还需要很大改进。譬如，目前合成的Bt基因在植物中表达后都是停留在细胞内的，外源蛋白在细胞内的高表达必然对细胞自身的生理功能产生一定干扰，使转基因植物的原始性状受到一定影响。如在抗虫转基因植物选育过程中往往发现，抗虫性高的转基因植物其农艺性较差，影响其产量和品质，而农艺性状与原始品种相似的植株抗虫性却不够理想。引起这些问题的原因是多方面的，如转化再生过程中可能引起体细胞的变异，外源基因在植物染色体上插入的位置不同可能会激活或干扰某些植物基因的表达等都可能导致农艺性状的改变。外源基因产物在转化细胞中的积累，特别是在高水平表达时外源蛋白在植物细胞中的积累，可能对细胞的正常生理功能造成很大干扰，最后导致植物某些特状的改变。另外外源基因表达产物在胞内环境下，很易于与胞内各种蛋白酶接触，使其稳定性下降。所以在胞内大量积累外源蛋白对植物本身和外源基因产物两方面都会有不利的影响。

    为了克服上述存在的问题，本发明考虑到Bt蛋白分泌到胞外会提高其稳定性，从而提高其在植物中的积累量，最终导致转基因植物杀虫活性的提高，同时也可减轻表达产物对植物细胞功能的干扰。目前，已有证据表明来自烟草的PRlb蛋白的信号肽不但可以使病原相关蛋白分泌至胞外(Cornelissen等EMBOJ.5：37-40，1986)，而且也可以使外源蛋白分泌至胞外(Denecke等1990 The Plant Cell 2：51-59)。所以，基于以上已有的研究背景，本发明合成了从N端第一个氨基酸残基开始至第331个及第332至615个氨基酸组成的CrylAb与CrylAc融合基因，最后构建成的这个嵌合Bt基因命名为Btlm。在Btlm基础上又将合成的一个分泌信号肽PRlb-s编码序列与Btlm连接以形成一个嵌合蛋白基因BtSlm，分别构建了这两个基因的植物表达载体，通过农杆菌介导转化了烟草和棉花。转基因植物的虫试结果表明这两个合成的杀虫蛋白基因都可在植物中高效表达Bt蛋白的抗虫活性，BtSlm植株的抗虫性略高于Btlm的转基因植株，所以根据不同目的这两个基因在植物抗虫基因工程的研究与开发中都是非常有运用价值的抗虫基因。

    为了实现本发明的目的，具体采取如下的技术步骤：

      通过Bt CrylA融合蛋白基因(Btlm)寡核苷酸引物的合成；

          Btlm基因片段的合成及克隆(附图1)；  

          Btlm基因的组装得到编码CrylA融合蛋白基因克隆pSKBtlm(附图2)；

      Btlm基因序列与信号肽编码序列的连接，构建带有信号肽编

      码序列的BtSlm基因克隆pSlm(附图3)；

      Btlm和嵌合BtSlm基因插入二元表达载体pBin438构成植物

      表达载体pBlm和pBSlm(附图6)，并将其转化到大肠杆菌

      或土壤农杆菌[Agrobacterium tumefaciens]LBA4404；

    pBlm和pBSlm或它们的根癌土壤农杆菌LBA4404转化子应用于植物转化，获得农艺性状好、具有高抗虫性的转基因植物。

    为了更好地理解本发明，结合下列附图对本发明予以详细说明：附图1.CrylA基因片段的合成及亚克隆构建示意图图中缩写：PI-1～PV-9：不同寡核苷酸引物的编号，编号后面括号内的数字为引物的碱基数；SK：pBluescriptIISK+；KL：Klenow enzyme；Am：Ampicillin抗性基因；Kb：千碱基对；Bm：BamHI；H3：HindIII；R1：EcoRI；RV：EcoRV；Sc：SacI；SL：SalI。

    A.第一区段(BamH1-EcoR1)亚克隆pBtfsI的构建

    B.第二区段(EcoR1-EcoRv)亚克隆pBtsII的构建

    C.第三区段(EcoRV-EcoR1)亚克隆pBtfslII的构建

    D.第四区段(EcoRI-SacI)亚克隆pBtsIV的构建

    E.第五区段(SacI-salI)  亚克隆pBtfsV的构建附图2.CrylA融合杀虫蛋白基因克隆pSKBtlm的构建附图3.带分泌信号肽编码序列的嵌合Bt基因BtSlm的重组质粒pSlm构建附图4.合成的含分泌信号肽编码序列的嵌合杀虫蛋白基因BtSlm的核苷酸序列及氨基酸

    序列附图5.合成的Btlm融合杀虫蛋白编码区DNA序列与野生型相应部分

    DNA序列的比较。

    W(上行)……野生型基因序列；M(下行)……合成的融合杀虫

    蛋白基因Btlm基因序列。方框内的碱基为W和M序列相同的碱

    基附表1.改造前后融合杀虫蛋白基因Btlm编码区密码子使用频率的变化

    及与植物密码子使用频率的比较。

    ※密码子百分比指该密码子在该基因编码区内与编码相同氨基酸

    的密码子总数的比例；植物密码子使用频率％指在双子叶植物中

    的使用频率(Murray EE.et al.Nucleic Acid Res.17：477-499 1989)；

    aa-氨基酸代码。附图6.融合Bt基因Btlm及嵌合Bt基因BtSlm的植物表达载体的构建

    Amp：氨苄青霉素抗性；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；Kn：

    卡那霉素抗性基因；DE-35SP：带双增强子的CaMV35S启动子；

    RB和LB分别为T-DNA的右边界和左边界序列。附图7.转化再生烟草植株的PCR检测

    引物：35S正向引物、Bt反向引物

    1：入-Ecot 14I Marker

    2：阳性对照(pBlm质粒)

    3：阴性对照(非转基因烟草)

    4-13：泳道4-10为pBlm转基因植株的PCR结果；泳道11-13为

    pBSlm转基因植株的PCR结果。引物为35S+和Re-Bt-。附图8.转基因烟草植株的Southern blot分析(HindIII单酶切)

    与Btlm基因探针杂交结果

          泳道1.pSKBtlm质粒作为阳性对照

          泳道2.泳道2、3、4为三株pBlm转基因植株；5、6

             为两株pBSlm转基因植株

          泳道7.非转基因烟草作为对照附图9.转基因烟草的蛋白免疫分析

    泳道1.  大肠杆菌表达的CrylAc蛋白(68KD)

    泳道2.  非转基因烟草对照

    泳道3-9.不同转基因烟草植株(3-5为pBlm转基因植株；6-8为

            pBSlm转基因植株附图10.转基因烟草植株的ELISA检测结果

    用于分析的植株数分别为：对照6株；pBlm转基因植株8株；

    pBSlm转基因植株22株。附图11.不同基因结构转化再生植株对棉铃虫的抗性分布

    各基因结构后面所注的括号内数字表示总的参试植株数附表2.转基因烟草植株子代的遗传分析实施例一带信号肽序列的嵌合杀虫蛋白基因BtSlm的合成1.苏云金杆菌CrylA融合杀虫活性蛋白基因Btlm的合成1.1 CrylA融合蛋白基因Btlm寡核苷酸引物的合成

    寡核苷酸引物由中科院微生物研究所新技术中心用Applied Biosystem的DNA合成仪合成，经OPC(寡核苷酸纯化柱)或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后即可用于双链DNA的合成。为了克隆方便，根据CrylAb和CrylAc基因内存在的内切酶识别位点，将该基因的毒性区分为五个区段进行引物合成。第一区段(PI)共6个引物(BamH1-EcoR1)，它们的序列如下：PIf-1(+)5′ACGGATCCACC ATG GAC AAC CCAATC AAC GAA TGC ATT CCA TAC AAC TGC TTG

    AGT AAC CCA GAA GTT       68merPIf-2(-)5′GGA GAT GTC GAT TGG AGT GTA ACC GGT TTC GAT GCG TTC TCC ACC AAG   TAC TTC AAC TTC TGG GTT    66merPIf-3-5′GAA CTC GCT GAG CAG AAA CTG TGT CAA GGA CAA GGA GAT  GTC GAT                          48merPI-2(-)：5′ACC CCA GAT GAT GTC AAC TAG TCC GAG CAC GAA CCC AGC ACC TGG CAC

              GAA  CTC GCT GAG   60merPI-3(+)：5′ATC ATC TGG GGT ATC TTT GGT CCA TCC CAA TGG GAC GCA TTC CTG45merPI-4(-)：5′GC GAA TTC TTC GAT CCT CTG GTT GAT GAG CTG TTC AAT TTG AAC CAG GAA

              TGC GTC第二区段(PII)共8个引物(EcoR1-EcoRV)，它们的序列如下：PII-1(+)：5′AA GAA TTC GCT AGG AAC CAG GCC ATC TCT AGG TTG GAA GGA CTC AGC

              AAT CTC TAC CAA ATC TAT 65merPII-2(-)：5′CTC CCT GAG AGC TGG GTT AGT AGG ATC GGC CTC CCA TTC TCT GAA AGA

              CTC TC ATA GAT TTG GTA  66merPII-3(+)：5′T CTC AGG GAG GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAC GAT ATG AAC AGC GCC

              TTG ACC ACT GCT ATC CCA T 65merPII-4(-)：5′TT AGC GGC TTG AAC GTA CAC GGA CAA GAG AGG CAC CTG GTA GTT CTG

              GAC TGC GAA CAA TGG GAT AGC   68merPII-5(+)：5′CAA GCC GCT AAT CTT CAT CTC AGC GTG CTT CGA GAC GTT TCA GTG TTT

              GGA CAG AGG TGG GGA TTC G    67merPII-6(-)：5′C GGT GTA GTT TCC AAT GAG CCT AGT AAG GTC GTT GTA TCT GCT ATT GAT

               GGT TGC AGC ATC GAA TCC CCA   70merPII-7(+)：5′AAC TAC ACC GAC CAC GCT GTT CGT TGG TAC AAC ACT GGT TTG GAG CGT

               GTC TGG GGT CCT GAT AGC AGA   69merPII-8(-)：5′AC GAT ATC CAA CAC TGT AAG GGT CAA TTC TCT CCT GAA CTG GTT GTA

               TCT AAT CCA ATC TCT GCT ATC AG 70mer第三区段(  )共6个引物(EcoRV-EcoR1)，它们的序列如下：PIII-1(+)：5′TTG GAT ATC GTG TCT CTC TTC CCG AAC TAT GAC TCC AGA ACC

               TAC CCT ATC CGT ACA GTG        60merPIII-2(-)：5′AAG AAC TGG GTT AGT ATA GAT TTC TCT GGT AAG TTG GGA CAC

              TGT ACG GAT AGG                 54merPIII-3(+)：5′ACT AAC CCA GTT CTT GAG AAC TTC GAC GGT ACG TTC CGT GGT

              TCT GCC CAA GGT ATC GAA GGC     63merPIII-4(-)：5′GAT AGT TAT GCT GTT CAA GAT GTC CAT CAA GTG TGG GCT CCT

              GAT GGA GCC TTC GAT ACC         60merPIII-5(+)：5′AAC ACG ATA ACT ATC TAC ACC GAT GCT CAC AGA GGA GAG TAT

              TAC TGG TCT GGA CAC CAG ATC     63merPIII-6(-)：5′GGT GAA TTC GGG CCC GCT GAA TCC AAC TGG AGA GGC CAT

              GAT CTG GTG TCC AGA第四区段(PIV)共6个引物(EcoR1-SacI)，其序列如下：PIV-1(+)：5′CC GAA TTC ACC TTC CCT CTC TAT GGA ACT ATG GGT AAC GCC GCT CCA

             CAA CAA AGG ATC GTT GCT CA   67merPIV-2(-)：5′GAA TGG CCT TCT GTA CAA AGT GGA AGA CAA GGT TCT GTA GAC ACC CTG

             ACC TAG TTG AGC AAC GA    65merPIV-3(+)：5′A AGG CCA TTC AAT ATC GGT ATC AAC AAC CAG CAA CTT TCC GTT CTC

             GAT GGA ACA GAG TTC GCC TAT   67merPIV-4(-)：5′A GCT AGC AAC GGT TCC GGA CTT TCT GTA AAC AGC GGA TGG CAA GTT

             AGA AGA GGT TCC ATA GGC GGA C    68merPIV-5(+)：5′GTT GAT AGC TTG GAC GAA ATT CCA CCA CAG AAC AAC AAT GTG CCA CCC

             AGG CAA GGA TTC AGC CAC AGG T   70merPIV-6(-)：5′AGG AGC TCT GAT GAT GCT CAC GCT ACT GTT GCT GAA ACC GGA ACG GAA

              CAT GGA CAC ATG GCT CAA CCT GTG GCT    72mer第五区段(PV)共9个引物(SacI-SalI)，其序列如下：PV-1(+)：5′TC AGA GCT CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAG TTC AAC

             AAT ATC ATT GCA TCC GAT AGC ATC 71merPV-2(-)：5′CC TGA AAT GAC TGA ACC ATT GAA GAG AA GTT TCC CTT AAC TGC AGG

             AAT TTG AGT GAT GCT ATC G 66merPV-3(+)：5′TC ATT TCA GGA CCA GGA TTC ACA GGA GGA GAC CTC GTT AGA CTC AAC

             AGC ACT GGA AAT AAC ATC   65merPV-4(-)：5′ATA TCT GGT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACT CCT ATT CAT

             CTC AAC GTT AAT TGG GGT  67merPV-5(+)：5′T ACC AGA TAT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACT CCTATT CATCTC

             AAC GTT AAT TGG GGT   67merPV-6(-)：5′GAG GTT ATC CAA GGA GGT AGC TGT AGC TGG AAC TGT GTT GCT GAA GAT

             AGA TGA ATT ACC CCA ATT A  67merPV-7(+)：5′G GAT AACCTC CAA TCC AGC GAC TTC GGA TAC TTT GAG AGC GCC AAT GCT

             TTC ACA TCT TCA CTC GGC AAC   70merPV-8(-)：5′T CAC ACC TGC AGT TC ACT AA GTT TCT AAC ACC CAC TAT GTT GCC GAG T50merPV-9(-)：5′CA GTC GAC TCA TTC ATC CTC GAG TGT TGC AGT AAC TGG AAT GAA CTC

             AAA TCT GTC TAT GAT CAC ACC TGC AGT   72mer1.2 CrylA融合基因片段的合成及克隆取各个区段中两个相邻引物各20pmol(10μl)混合，在70℃变性10min，自然冷却后加入10X Klenow酶缓冲液(100mmol/L Tris-Cl PH7.5，0.5mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，50mmol/L  DTT)2μl，Klenow DNA聚合酶1单位，加dNTP至0.1mmol/L在总体积20μl内37℃保温lh，反应产物与另一个经Klenow酶聚合反应产生的相邻大片段混合变性后，在两端引物存在下进行PCR扩增以产生更大的DNA片段。PCR反应在20或50μl体积中由50mmol/L KCl，10mmol/L，Tris-HCl pH8.8，1.5mmol/LMgCl2，0.1mg/ml BSA，0.2mmol/L dNTP，5′端和3′端引物各1μmol/L，0.05U/μl Taq DNA polymerase，1μl/每个反应来自Klenow或PCR反应的产物作为模板组成的反应混合物以94℃变性4min然后94℃，1min；40-50℃(退火温度根据引物与模板配对的碱基数确定)，1min；72℃，1min共进行30个循环。每个区段的PCR最终产物经相应的内切酶酶解后与用同样酶解的克隆载体pBluecriptIISK+或pSP71连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含X-gal和IPTG的LB平板上选取白色菌落，经质粒提取、质粒的酶切分析及DNA序列分析后即可选到CrylA基因片段的亚克隆pBtSI(第一区段)，pBtSII(第二区段)，pBtSIII(第三区段)，pBtSIV(第四区段)和pBtfSV(第五区段)。这五个亚克隆的构建过程见图1A-1E。以上的DNA酶切、载体的制备、连接反应、感受态细胞的制备、转化、克隆的筛选都按照《分子克隆》一书(Sambrook J.et al.《Molecular Cloning》2nd ed.CSH Laboratory Press，1989)所述方法进行。DNA序列分析按Pharmacia公司T7DNA sequencing Kit提供的方法进行。1.3融合杀虫蛋白CrylAc基因的组装

    经序列分析证明各个亚克隆中Bt基因片段的序列正确后，用常规的重组DNA技术按各亚克隆的酶切位点彼此按次序连接后即得到编码CrylA融合蛋白Btlm的基因克隆pSKBtlm构建过程见图2.1.4融合杀虫蛋白基因序列的矫正

    在对每个亚克隆进行序列分析后发现在有些克隆中有碱基的缺失或置换。为了获得完全正确的基因序列，在亚克隆基础上用按Clontech公司的定点突变盒说明书的方法对有误的碱基处进行定点突变。突变的选择引物为Stu/ScaI：5′GTGGACTGGTGAAGTACTCAACCAAGTC或AflIII/BglII引物：5′CAGGAAAGAAGATCTGAGCAAAAG。突变引物由需改变的碱基与两端10-15个碱基组成的寡核苷酸组成。突变引物应与选择引物在同一条DNA链上。

    对亚克隆pBtfS12中Bt基因片段中EcoRI左右出现的碱基错误则用两对引物通过PCR方法进行了改正，为便于筛选突变的转化子，同时将此EcoRI位点去除。两对引物分别为

    ①PI-1+mI-

    mI- 5′ CCTAGCGAACTCTTCGATCCTCTGGTTGATGAG  33mer

    ②PII-8+mII+

    mII+ 5′  ATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGG  36mer

    对pBtfS12改造后的重组质粒定名为pBtfS12PCR反应条件及克隆方法同前所述。1.5带有分泌信号肽编码序列的嵌合杀虫蛋白基因克隆pSlm的构建(a)分泌信号肽编码序列的合成及克隆

    为了使Bt融合杀虫蛋白基因在植物中表达后其蛋白产物不在胞内集累而分泌到胞外的细胞间隙，本发明首次将人工合成的烟草PRlb蛋白的信号肽编码序列PRlbS与上述合成的CrylA融合蛋白基因Btlm连接后得到带有分泌信号肽编码序列的嵌合杀虫蛋白基因BtSlm。BtSlm基因的重组质粒pSlm的构建过程如附图3所示。其中合成的PRlb分泌信号肽的编码区序列如下：Slb-1：5′CAT CTA GAT CT ACC ATG GGA TTT TTC CTT TTT TCT CAA ATG CCA TCC TTCTTT CTC GTG TCC ACT    51merSlb-2：5′TAG TCG ACA CGC GTG AGA GGA GTG AGA GAT AAT CAG GAA AAG GAG AAGAGT GGA CAC GAG    60mer以上两个各取20pmol，在50ml klenow酶反应体系中(如上1.2中所述)37℃反应1h后，加苯体积酚/氯仿(1∶1)抽取一次，取上层水溶液加入2倍体积乙醇及5ml 3M NaAc，混匀后置一70℃沉淀DNAlhr，12000rpm离心10分钟收集沉淀，70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于20ml无菌水中，按“分子克隆”所述方法对上述DNA及PUC19质粒DNA进行XbaI和SalI酶解，酶解后通过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化Slb DNA片段，并与用用样酶酶解的pUC19连接即得到含Slb的重组质粒pUSP，转化大肠杆菌DH5A后即可在含Xgal和IPTG平板上筛选到含有该重组质粒的转化子，经酶切分析和DNA序列分析证明分泌信号肽Slb的序列正确，但在张的BglII酶切位点序列在合成时发生了错误由AGATCT变为AGATTC由于该位点的错误不会影响Slb信号肽的表达，所以在pUSP中仍保留了这一序列pUSP的构建过程见附图3所示。为了适当提高Slb序列中的GC含量及避免一些植物中罕见的密码子在合成时对其中的15个密码子进行了改变，但其编码的氨基酸未发生变化。(b)带有分泌信号肽编码序列的嵌合杀虫蛋白基因Btlm克隆pSlm的构建

    按“分子克隆”一书所述的重组DNA方法用MluI酶解质粒pUSP然后用Klenow酶补平末端再用SalI酶解与用BamH1酶解，Klenow酶补平并用SalI酶解pSKBtlm后分离到的1.8kb融合杀虫蛋白基因片段连接后即得到含有分泌信号肽编号序列的嵌合杀虫蛋白基因BtSlm的克隆pSlm(详见附图3)。序列分析表明BtSlm基因的序列与原设计一致，其DNA序列和编码的氨基酸序列见权利要求1和2以及附图4。合成的嵌合杀虫蛋白基因BtSlm全长1947bp，其中第1-第90核苷酸编码分泌信号肽Slb；91-99为由酶切位点形成的三个密码子；第100-1092和1093-1947分别编码CrylAb第1-331氨基酸和CrylAc第332-616氨基酸(包括一个终子密码子)，即Btlm基因。Btlm基因与相应野生型基因核苷酸序列的比较见附图5，Btlm基因的GC比由野生型的37％增加到47.4％，其密码子使用频率的变化更有利于该基因在植物中的表达。Btlm基因密码子使用频率与野生型基因的比较见附表1。2、融合基因Btlm及嵌合基因BtSlm的植物表达载体的构建及农杆菌的转化二元表达载体pBin438含有由带双增强子的CaMV 35S启动子(DE35Sp)、TMV-RNA cDNA的Ω片段-来自pBR322的BamHI-SalI片段及Nos转录终止序列组成的外源基因表达框架(李太元等，中国科学(B辑)24：276-282，1995)。用BamHI和SalI将pSKBtlm中的融合基因Btlm切出后插入到pBin438的BamHI和SalI位点之间构建成植物表达载体pBlm。用XbaI酶解pSlm，然后用Klenow酶将末端补平，再用SalI酶解，在Agarose胶上电泳回收1.9kb的BtSlm基因片段与用BamH1酶解，Klenow补平，SalI酶解后的pBin438建连接则构建成BtSlm的植物表达载体pBSlm。以上连接产物分别转化大肠杆菌DH5A后，挑选抗Kanamycin克隆经酶切分析证明构建正确后用冻融法(An et al，Methods inEnzymology 153：293，1987)将以上表达载体分别转化到土壤农杆菌(A.tumefaciens)LB4404中，经卡那霉素筛选，质粒分析证明pBS29K结构完全正确后即可用于植物转化。这个植物表达载体的具体构建过程见附图3。实施例二抗虫转基因植物的获得1.烟草的转化

    用无菌培养的烟草NC89的叶片通过与根癌土壤杆菌共培养的叶盘法(Horch et al.Science 227：1229-1231，1985)将以上构建的pBlm和pBSlm中的T-DNA(包括NPTII基因和相应的抗虫基因)转入到烟草染色体上分别获得了一批抗卡那霉素的抗虫转基因烟草植株。2.转化再生烟草植株的分析2.1转化再生植株的PCR检测

    烟草DNA提取和转基因烟草的PCR检测按李太元等所述方法(中国科学B辑24：276-282，1994)进行，PCR引物为：35S+   5′CTGACGTAAGGGATGACGC      19merRe-Bt   5′TTGAATTGAATACGCATCTCC    21mer

    用这两个引物进行PCR所得产物约500bP。部分抗卡那霉素的再生植株的PCR结果见附图7。这些PCR结果表明Btlm或BtSlm抗虫基因可能已整合到所检测的7株和3烟草的染色体上。2.2 Southern杂交分析(1)植物DNA的提取

    取2克叶片在液氮中研磨成粉后按Paterson等报导的方法(PlantMol.Bol.Rep，11(2)：122-127，1993)提取细胞核DNA。DNA的定量用紫外测定法，即1OD260＝50μg/ml或在Agarose电泳后用EB染色比较确定。(2)植物DNA的酶解和电泳

    取20μgDNA加入150单位的HindIII和20μl 10×限制性内切酶缓冲液，加无菌重蒸水至总体积为200μl，37℃保温过夜。然后加入20μl 3M NaAcPH5.5及2倍体积的95％乙醇，混匀后置-70℃ 15min，12000rpm离心5min沉淀DNA，用70％乙醇洗沉淀一次，将DNA沉淀真空干燥后溶于适量TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA PH8.0)，在0.8％Agarose胶上以80V电泳分离DNA。(3)DNA的转膜、引物标记及杂交反应

    均参照分子克隆一书(Sambrook et al.CSHL Press，1989)所述进行，所用探针为用α-32P-dCTP和Ready To Go DNA标记试剂盒标记的EcoRV和XhoI酶解的S29K基因片段(1.1Kb)。对部分植株的Southern杂交结果(见附图8C)证明BT基因和API-BA基因已整合到所检测的烟草染色体中，而且在所检测的植株中都是单拷贝插入。2.3转基因烟草中的Bt杀虫蛋白质检测(a)转基因烟草中Bt蛋白的酶联免疫检测(ELISA)

    烟草叶片50mg左右，液氮研磨后加入提取缓冲液(50mM Na2CO3，pH9.5，1uM Leupeptin，lmM PMSF，0.05％(v/v))Tween-20，0.1％(w/v)NaCl，0.05％(v/v)巯基乙醇)，10,000rpm离心10min。取上清用于ELISA检测。采取双抗夹心法，用包被液(50mM Na2CO3，0.02％(w/v)NaN3)包被一抗，一抗为鸡抗B.t.血清(1∶2500)，二抗用鼠抗B.t.血清(1∶1000)，酶联抗体用羊抗鼠的碱性磷酸酯酶标记的IgG，抗体稀释用磷酸缓冲液PBST(40g/L NaCl，4.4g/L KH2PO4，29.11g/L Na2HPO412H2O，0.5ml/L Tween-20，pH 7.2-7.4)，用lmg/mL对硝基苯磷酸二钠(-Nitrophenyl Phoshate Disodium(pNPP))(Sigma公司产品)显色15-30min，405nm测紫外线吸收值。用Bio-Rad protein assay kit测定蛋白浓度，对照用空白转化的植株叶片，用Bt晶体蛋白作标准曲线，计算Bt蛋白的表达量。

    对8株转Btlm的抗虫植株及22株转BtSlm的抗虫植株进行ELISA检测结果归纳为附图10，结果初步表明转Btlm的植株中Bt杀虫蛋白平均表达量为叶片总可溶性蛋白的0.07％而转BtSlm基因植株中的Bt杀虫蛋白平均表达量可达0.23％，虽然检测中对照的本底反应较高，但总的比较看后者的表达量是前者的三倍，这种迹象表明加了分泌信号肽后可能改变了Bt蛋白的细胞定位，从而增加了Bt蛋白的稳定性有利于Bt蛋白的集累。(b)Westernblot分析

    取100mg新鲜叶片，液氮研磨后加入100μl 2×上样缓冲液，100℃煮3-5min，12000rpm离心5min后，所得上清即可用于电泳分析。取上述蛋白提取液20μl，在10％SDS-PAGE胶上，用Tris-甘氨酸缓冲体系(PH8.3)，电压60V，电泳4-6hr。电泳结束后，用Bio-Rad半干转移仪恒压9伏，30min将蛋白转移至用甲醇预处理的PVDF膜上。然后将膜置于溶液III中封闭未结合蛋白的位置，室温下摇1hr或4℃过夜；将膜转入一抗反应液(溶液I+1％BSA，ProteinA Spharose6B柱纯化过的免抗CrylAc抗体，1∶500倍稀释)中，室温摇1hr；用溶液I洗3次，每次3-5min；将膜置于显色液(10ml溶液II+33μlNBT+66μlBCIP)中显色。Western blot所用溶液如下：2×上样缓冲液：125mM Tris-HCl PH6.8，20％甘油，4％SDS，0.2％溴酚蓝，2％巯基乙醇半干转移缓冲液：48mmol/L Tris，39 mmol/L甘氨酸，0.0375％SDS，20％甲醇溶液I：20mmol/L Tris-HCl PH7.4，0.15 mol/L NaCl，1 mmol/LEDTA，0.1％Tween-20溶液II：0.1mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2(PH9.5)溶液III：含5％脱脂牛乳粉的溶液I。部分植株的定性Western blot分析结果见附图9，结果表明改造后的Btlm或BtSlm基因在转基因植株中有明显的表达。特异免疫反应的蛋白分子量与1.8KbBtlm基因片段在大肠杆菌中表达产物(泳道1)大小一致，表明这两个Bt基因都能在植物中正确表达杀虫蛋白，而且BtSlm表达的嵌合杀虫蛋白上的信号肽已被正确加工除去。但对有关信号肽是否发挥了其应有的功能及其加工情况尚需进一步的实验证明。2.4转基因烟草的抗虫实验及子代遗传分析取转基因烟草或非转基因烟草的新鲜叶片用无菌水冲洗干净并用纱布将叶上的水吸干后放入小塑料盒内，每盒放一头人工饲养的棉铃虫(Heliothisarmigera Hübner)，每株烟草做6～12头虫。虫试盒加盖后，在25℃放置3天或5天后统计幼虫死亡率。抗虫试验重复三次。转化再生烟草虫试结果归纳为附图11。

    虫试结果结果表明转Btlm和转BtSlm基因的植株中都可选到高抗虫性的植株，具有50％以上的试虫死亡率的植株分别占总参试植株数的76％和85％，这一结果与Bt蛋白的表达水平一致，又一次表明转带有信号肽编码序列的BtSlm基因的转基因植株可能更易于选到高抗虫性植株。

    为了了解Btlm和BtSlm基因在转基因植株中的遗传稳定性，对部分植株的自交一代植株的卡那霉素抗性及抗虫性进行检测。取转基因植株自交一代的种子(T1)按做无菌苗的操作方法，将灭菌后的种子转移到含有200mg/ml卡那霉素的MS0平板培养基上，置光照培养箱内培养，待幼苗长出一对真叶后不抗卡那霉素的植株很快变为白色，而抗卡那霉素的小苗仍保持绿色，计各个株系的绿苗数和白苗数，统计卡那霉素抗的分离比。同时对子代植株进行抗虫试验，方法同上所述，统计抗虫性在子一代中的分离情况。卡那霉素抗性的统计分计结果见附表2所示：子代分析结果表明由表达载体带到植物染色体上的NPTII基因(卡那霉素抗性基因)在转基因植株子代基本是按单基因分离的，所以应是遗传稳定的，可以从子代中选到转基因纯合系，而且与NPTII紧密连锁的Bt基因的抗虫性也显示出3∶1的分离特点，初步表明合成的Bt基因Btlm和BtSlm在转基因植株后代也可以稳定遗传。

    用pBlm和pBSlm的农杆菌转化子已转化了棉花的生产品种冀合321并经PCR检查及抗棉铃虫试验初步选到了高效抗虫转基因植株，所以本发明提供的Bt融合杀虫蛋白基因Btlm和BtSlm可用于植物的抗虫基因工程研究与开发。

    附表1  改造前后融合杀虫蛋白基因Btlm编码区密码子使用频率的变化及与植物密码子使用频率的比较密码aa    Btlm植物密码子频率％密码aa    Btlm植物密码子频率％密码aa    Btlm植物密码子频率％密码aa    Btlm植物密码子频率％  密码子数  *密码子％  密码子数  *密码子％  密码子数  *密码子％  密码子数  *密码子％改前改后改前改后改前改后改前改后改前改后改前改后改前改后改前改后 TTT      F    31      7      86.1    19.4    45 TTC      F    5       29     13.9    80.6    55 TTA      L    22      0      44.9    0       10 TTG      L    5       18     10.2    36.7    26 TCT    S      12      15     19.4     24.2    25 TCC    S      7       17     11.3     27.4    18 TCA    S      12      4      19.3     6.5     19 TCG    S      7       0      11.3     0       6 TAT    Y      21      9      84.0     36.0    43 TAC    Y      4       16     16.0     64.0    57 TAA    End    0       0      -        -       48 TAG    End    0       0      -        -       19 TGT     C      1      0      50.0     0        44 TGC     C      1      2      50.0     100      56 TGA     End    0      0      -        -        33 TGG     W      10     10     100      100      100 CTT      L    10      8      20.4    16.3    28 CTC      L    2       19     4.1     38.8    19 CTA      L    9       2      18.4    4.1     8 CTG      L    1       2      2.0     4.1     9 CCT    P      10      9      30.3     27.3    32 CCC    P      2       2      6.1      6.1     17 CCA    P      15      21     45.5     63.6    42 CCG    P      6       1      18.2     3.0     9 CAT    H      8       5      80.0     50.0    54 CAC    H      2       5      20.0     50.0    46 CAA    Q      22      14     81.5     51.9    59 CAG    Q      5       13     18.5     48.1    41 CGT     R      7      8      17.1     19.5     12 CGC     R      1      1      2.4      2.5      36 cGA     R      4      1      9.8      2.4      4 CGG     R      1      0      2.4      0        13 ATT      I    23      13     47.9    27.1    45 ATC      I    6       31     12.5    64.6    37 ATA      I    19      4      39.6    8.3     37 ATG      M    8       8      100     100     100 ACT    T      11      13     29.7     35.1    35 ACC    T      7       14     18.9     37.8    30 ACA    T      13      10     35.1     27.0    27 ACG    T      6       0      16.2     0       8 AAT    N      34      12     70.8     25.0    - AAC    N      14      36     29.2     75.0    55 AAA    K      1       0      50.0     0       39 AAG    K      1       2      50.0     100     61 AGT     S      21     5      33.9     8.0      14 AGC     S      3      21     4.8      33.9     18 AGA     R      23     18     56.1     43.9     30 AGG     R      5      13     12.2     31.7     25 GTT      V    18      20     43.9    48.8    34 GTC      V    0       4      0       9.8     24 GTA      V    17      1      41.5    2.4     11 GTG      V    6       16     14.6    39.0    31 GCT    A      19      18     54.3     51.4    42 GCC    A      4       9      11.4     25.7    27 GCA    A      11      8      31.4     22.9    25 GCG    A      1       0      2.9      0       6 GAT    D      20      11     80.0     44.0    58 GAC    D      5       14     20.0     56.0    42 GAA    E      26      16     86.7     53.3    49 GAG    E      4       14     13.3     46.7    51 GGT     G      12     19     26.1     41.3     34 GGC     G      5      2      10.9     4.3      16 GGA     G      22     21     47.8     45.7     38 GGG     G      7      4      15.2     8.7      12

               附表2.转基因烟草植株子代的遗传分析H0：0-T＝0，α＝0.05，df＝1，x20.05＝3.841当x2＜x20.05，卡那霉素的抗性比率符合典型的3∶1分离比Expression    vecror  Transgenic  plant No.Green plant number/White    plant number    x2    3∶1  segregation    pBlm    17    174/59    0.0014    Yes    424    107/33    0.1523    Yes    410    190/25    33.876    No    407    372/115    0.4989    Yes    1mQ    143/43    0.9316    Yes    413    90/31    0.0248    Yes  pBSlm    7m-3    223/70    0.1923    yes NC89，Non-transformed control    0/198      -     -