草甘膦降解酶基因和含该基因的载体 本发明属于分子遗传学技术领域，特别是应用现代分子生物学方法和DNA重组技术从土壤细菌中分离获得一种草甘膦降解酶基因。
化学除草已成为现代化农业生产的重要组成部分。全世界除草剂的总用量、施用面积及费用均已超过杀虫剂和杀菌剂的总和。在众多的除草剂中，草甘膦(N-phosphonomethylglycine)是目前世界上使用最为广泛的一种。它的优点是对人畜无毒，降解快，对环境污染非常小，而且价钱便宜，因而深受欢迎。仅美国每年销售量就达几百万美元。草甘膦是一种广谱、内吸性的除草剂，它可无选择地抑制所有植物的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3磷酸合成酶(下面简称：EPSPS)活性，阻断植物芳香族氨基酸的合成，因此它也抑制农作物的生长。应用基因工程技术培育对草甘膦具有抗性的农作物，对于安全使用草甘膦，无疑具有重要的意义。
目前，获得抗草甘膦转基因农作物研究途径主要有：一、导入过量表达的EPSP合成酶基因，以此抵御草甘膦的竞争性抑制；二、通过定点突变，获得对草甘膦低亲和性或无亲和性的EPSP合成酶，从而消除草甘膦的抑制作用。抗草甘膦转基因大豆是目前世界上产业化规模最大的转基因植物(2000年总面积约为1000万公顷)。然而除了大豆以外，其他转基因作物均未能商品化生产，这可能是由于植物代谢中存在着草甘膦作用的第二个靶位点。
在土壤细菌中，广泛存在降解草甘膦的酶，它们能把有机磷分解为无机磷，作为细菌地磷源加以吸收。现已证实草甘膦降解途径有二条。其一、裂解草甘膦分子为氨甲基磷酸盐(AMPA)，AMPA进一步被未知的随后步骤裂解出无机磷；其二，通过C-P裂解酶活性初始裂解C-P键，得到肌氨酸。用以草甘膦作为唯一磷源的培养基，培养根瘤菌(Flavobacterium spp.)菌株及农杆菌(Agrobacteriumspp.)，发现这些菌株能将草甘膦裂解成肌氨酸和无机磷。迄今，对草甘膦抗药性代谢机理方面的研究报道还很少，更没有把降解草甘膦基因导入植物并在转基因植物中表达的报道。
本发明的目的是提供一种草甘膦降解酶基因及含该基因的载体。
发明人在研究中发现苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)M010具有高效降解草甘膦的能力，提示其含有草甘膦降解酶基因。
本发明是根据基因互补的原理，利用现代分子生物学和DNA重组技术，选择具有降解草甘膦能力的微生物，从中分离和克隆草甘膦降解酶基因。本发明以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)M010菌株为材料建立基因文库，然后转化到没有降解草甘膦能力的大肠杆菌中，通过基因互补获得含有草甘膦降解酶基因的DNA序列。
本发明所用的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)M010购自广东省微生物研究所菌种保藏选育实验室(广东省微生物研究所菌种保藏目录1996)。
本发明的含草甘膦降解酶基因的DNA序列如序列表1所示。
下面通过实施例和附图进一步详细叙述本发明：
图1是野生型苜蓿根瘤菌M010在含有不同浓度草甘膦的无磷液体培养基中的生长曲线；
图2是含有草甘膦降解酶基因的质粒pCRGld的结构图；
图3是XLI-pCRGld以及XLI-pCR2.1转化子在含有不同浓度草甘膦的无磷液体培养基中的生长曲线；
图4是野生型苜蓿根瘤菌M010，XLI-pCRGld转化子以及XLI-pCR2.1转化子的体外降解草甘膦的活性比较。实施例1.检测苜蓿根瘤菌M010降解草甘膦能力
将苜蓿根瘤菌M010接种在含有0，2，4，6，8和10mM草甘膦的液体根瘤菌无磷培养基(培养基成分见表一)中，测定其生长曲线。从曲线上可见，在含2.0mM草甘膦的液体无磷培养基中，该菌的生长速度最快。但是随着草甘膦浓度的提高，其生长也逐渐受到抑制(生长曲线见图1)。说明苜蓿根瘤菌M010具有较强的降解草甘膦的能力。
表一、液体根瘤菌无磷培养基成分：
MOPS/KOH pH7.4 25mM， MgSO4 2mM，
柠檬酸铁 100μM， CaCl2 1.2mM，
NH4Cl 33mM， 维生素B1 0.5mg/L，
烟酸 0.1mg/1， 生物素 0.1mg/L，
泛酸 0.5mg/L， 丁二酸钠 50mM，
微量元素：
CoCl2 0.8μM， CuSO4 40μM，
H3BO4 14μM， MnCl2 0.1μM，
Na2MoO4 10μM， ZnSO4 1.5μM.实施例2.建立苜蓿根瘤菌M010基因文库
将苜蓿根瘤菌M010单菌落接种于200ml根瘤菌丰富培养基(培养基成分见表二)中，在28℃空气浴中震荡培养48小时。离心收菌，以5ml DNA提取缓冲液(50mM Tris-Cl，10 mM EDTA，1％SDS，5μg/ml溶菌酶)重悬菌体，用超声波破壁。然后用等体积的苯酚和氯仿抽提除蛋白，再通过酒精沉淀DNA。最后将DNA溶于1ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)。将DNA以限制性内切酶BamH I和EcoR I进行部分酶切。通过琼脂糖凝胶电泳将不同大小的DNA片段分开，并切下其中含有2-10kb左右片段的凝胶，用Omega公司试剂盒(Gel Extration Kit试剂盒)同收DNA。随后按载体∶插入片段＝1∶3的比例，用T4连接酶将该片段连接到已用相同酶切处理的质粒pCR 2.1上。将连接液转化大肠杆菌XL1-blue感受态细胞，涂布到含氨苄青霉素(Amp)50ug/ml的LB固体培养基上，37℃培养过夜。收集大约5000个转化子。
表二、根瘤菌丰富培养基成分：
酵母膏 1克 土壤浸提液 200毫升
甘露醇 10克 蒸馏水 800毫升pH7.2
[注]土壤浸提液的制法：取土壤50克，加水200毫升，在高压蒸汽锅中，以15磅压力蒸煮1
小时，过滤去固体物，滤液加水补足到200毫升。实施例3.降解草甘膦相关基因的克隆和序列分析
将上述实施例2制备的转化子菌落用大肠杆菌无磷液体培养基(培养基成份见表三)从LB固体培养基上洗脱下来，离心收集菌体，而后再用大肠杆菌无磷液体培养基重复洗涤2次，然后随机地涂布到含不同浓度草甘膦(0mM，0.05mM，0.1mM，0.25mM，0.5mM)的大肠杆菌无磷固体(培养基成份见表三)平板上，37℃培养3天。结果我们获得了一个能在含草甘膦的无磷固体培养基上生长的转化子，命名为XLI-pCRGld。只有含有完整的降解草甘膦酶基因的转化子才能利用培养基中的唯一磷源--草甘膦而生长。因此无疑XLI-pCRGld含有编码C-P裂解酶基因，我们把含有该基因的质粒命名为pCRGld。将pCRGld质粒DNA提纯并用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切检测。结果表明pCRGld包含一个2.7kb插入片段(见图2)。这个克隆含有的草甘膦降解酶基因的插入片段的核酸序列(命名为Gld) 经完全测序(结果如序列表1所示)。将Gld序列与Genebank、EMBL核酸序列库比较显示，未发现具有相似功能的同源性的序列。
表三、大肠杆菌液体无磷培养基成分：
MOPS(pH7.4) 40mM， N-三甲基甘氨酸 4mM，
次氮基三乙酸 15mM， NaCl 50mM.
NH4Cl 10mM， K2SO4 0.28mM.
MgSO4 7H2O 0.02mM， MgCl2 0.6mM.
亮氨酸 30mg/L， 色氨酸 20mg/L，
葡萄糖 20g/L， 微量元素：
MnSO4 H2O 6μM mM， FeSO4 7H2O 10μM，
CaCl2 2H2O 0.6μM， CoCl2 6H2O 0.4μM，
ZnSO4 7H2O 0.4μM， H3BO3 0.3μM，
Na2MoO4 2H2O 0.04μM， CuSO4 0.04μM，
固体培养基为液体培养基中加入15g/L琼脂，12g/L柠檬酸三钠。实施例4.检测pCRGld转化子的降解草甘膦的能力
为了更有力地证明Gld基因编码酶在草甘膦代谢中的活性，将XLI-pCRGld转化子与没有外源插入片段的XLI-pCR 2.1转化子做对比。首先将转化株接种到LB培养基中，37℃过夜培养。然后离心收取菌体，并用大肠杆菌液体无磷培养基洗涤2次，转接到草甘膦浓度为0，0.2，0.4，1，2mM的液体无磷培养基中，37℃培养72小时。检测培养液的OD600值，比较各菌在不同草甘膦浓度下的生长情况(测定结果如图3所示)。结果表明，XLI-pCRGld转化子在0.4mM草甘膦浓度下生长较好。而对照样品，即没有外源片段的XLI-pCR 2.1转化子在浓度为0.2mM的草甘膦作用下己完全被抑制。实施例5.测定草甘膦体外降解活性
从苜蓿根瘤菌M010，XLI-pCRGld以及XLI-pCR2.1转化子细胞中提取蛋白粗提物。
分别用5ml含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基培养XLI-pCRGld和XLI-pCR2.1转化子。200rpm、37℃空气浴振荡培养过夜。以1％的接种量，转接到新鲜的含有50μg/ml氨卞青霉素的400ml LB液体培养基中，200rpm、37℃继续培养至OD600＝1.0时，离心收取菌体。将苜蓿根瘤菌M010单菌落接种于400ml根瘤菌丰富培养基中，28℃，200rpm空气浴振荡培养至OD600＝1.0，离心收取菌体。分别用40ml缓冲液A(25mM MOPS pH 7.0)洗涤上述菌体，离心弃去上清，分别用5ml缓冲液A重悬各菌体。然后用Fluko公司的乳化机处理细胞悬液使其破壁。以12000rpm离心30分钟，弃去细胞碎片。上清液用于下述有关各菌体外降解草甘膦活性的测定。
用缓冲液A把草甘膦配制成490μM的浓度，调节其pH＝7.0。同时将各菌上清液，也即各菌的细胞蛋白粗提物，用缓冲液A调节蛋白浓度统一为200μg/ml。分别取500μl各菌上清液与500μl490μM草甘膦(pH＝7.0)混合，于室温中放置。定时取该反应液50μl，加入800μl孔雀绿溶液，精确记时60秒，立刻加入100μl 34％柠檬酸钠溶液并混匀以终止反应，静置15分钟，测定OD660，与标准曲线比较，可获知反应液中的无机磷含量。测定结果如图4所示。
从图4中可见，苜蓿根瘤菌M010细胞蛋白粗提物有较强的降解草甘膦释放无机磷的能力，XLI-pCRGld转化子也有较明显的降解草甘膦以释放无机磷的能力。并且，从曲线上可见，这两者的活性变化趋势是一致的。而对照样品XLI-pCR2.1转化子基本上没有降解草甘膦能力。实施例6.Gld DNA序列，pCRGld质粒以及XLI-pCRGld转化子的制备
为了明确Gld基因是由苜蓿根瘤杆菌中克隆而来，我们根据序列测定结果设计引物，(1)CGCGGATCCGCGGGTGGGTACGGGCACGT，(2)CCGGAATTCGCCGTACATCCGTTCGTTCTC，进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃90秒，55℃90秒，72℃150秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增反应完毕后，琼脂糖电泳分离PCR产物，以Gel Extraction Kit(Omega公司)回收DNA，用T4连接酶连接回收DNA片段到质粒载体pCR2.1，而后用标准氯化钙方法转化大肠杆菌XLl-blue，从而可以得到经扩增而来的Gld DNA序列，pCRGld质粒以及XLI-pCRGld转化子。对PCR扩增而来的Gld DNA序列进行序列测定，结果与我们从苜蓿根瘤杆菌直接克隆的Gld DNA序列一致。
降解草甘膦策略可成为取代EPSPS蛋白过量表达策略的一个十分有效的方法，在构建转基因农作物方面具有巨大的潜在优势。因此选择可降解草甘膦的微生物，克隆其降解酶基因，并导入农作物中，培育出能降解草甘膦的农作物新品种，是21世纪植物基因工程的热门课题。本发明不仅将扩大现有除草剂的应用范围和提高农业生产力，而且还会影响新型除草剂的设计和使用。既具有基础理论研究意义，也具有巨大的市场应用前景。另外，在全球数以万计的转基因植物中，绝大多数采用抗生素抗性基因(如卡那霉素抗性基因)作为标记基因。目前人们对转基因植物的担心之一就是这类基因可能会转移到人、动物肠道微生物或环境微生物的基因组中，导致抗生素类药物或农药失效。以除草剂抗性基因替代抗生素抗性基因是发展趋势之一。
序列表11.序列特征：长度：2670bp；类型：核酸；链数：单链；几何结构：线性；2.分子类型：DNA；3.来源：克隆；苜蓿根瘤杆菌；4.序列描述：SEQ ID NO.1
GGATCCGCGG GTGGTATCGG GCACGTCCTG GATCACCGGC GCCGACGAAC CCAACAGGCA 60
CGTGGTGGGG CTGGTCGCCG GCCGCGACTT CACCCCCGAC GGCACCATCG AGGCCGCCGA 120
TGTGCGCGAC GGCGATCCGT CGCCGGACGG CGCCGGGGTG CTCACCTCGG CCCGCGGCAT 180
CGAGATCGGC CACATCTTCC AGCTGGGCCG CAAGTACGCC GACGCGTTCG GCGCCGACGT 240
GCTCGGCGAG AACGGCAAGC CGGTGCGGCT GACCATGGGC TCCTACGGCA TCGGGGTGTC 300
ACGGATGGTC GCGGTGATCG CCGAACAGCA GCATGACGAG ATGGGCTTGC GCTGGCCGGC 360
TTCGGTCGCG CCGTTCGACG TGCACGTGGT CATCGCCAAC AAGGACGCCG GTGCCCGCGA 420
GGGCGCCACC GAGTTGGCCG GTGAGCTGTC CCGGCTGGGC TTCGAGGTGC TCTTCGACGA 480
CCGCACCGCC TCACCGGGGG TGAAGTTCAA GGACGCCGAA CTGCTCGGCA TGCCGTGGAT 540
CGTGGTGGTC GGGCGGGGCT GGGCCGACGG GGTCGTGGAG CTGCGCAACC GATTCACCGG 600
CGAGGCCCGC GAGATCGCGG CCGAGGGTGC GGCCGCCGAG GTGGCCGCCC AGCTGCGGGC 660
CTAACCGGTC TTCTCTGGCC CGCCCGGGAA TGCCGTGGTG ATCTGGGGGA CTCCGAGCAC 720
CTGGTTCCAG CGGGCAGCCA GCACCGCGGC CTGCGTCATC GCGGTCACCG CGAAGCCGCG 780
GTCCTCGGTT GTCTGCGCCT GTTCCAGCAC GGCTCGCCAT GCGGTGGCGG TGCACCGCCA 840
GTTCGGCGGC ATCGCCGGGG TCGGTCACCT CCAGCGGCAA GCTCGTAACC GGCCGCCGGC 900
AGTGGCGGGG TCACCGAGTG TTCGGCCAGC ATGACCAGTG CCTCTTCGCG GCGCGCCCGG 960
TGCTGGGCCA TCGACTCGGC GACCAGGGCG TTGTCCTCGG CCGTGGAATG CGCCGAGACC 1020ACGCCGTAGC CGTAGATCGC GCCGTGCTCG GTGGCGACCG CGTCGAACAA CGCCGCCTGG 1080GCCGCGTCGG CCGGCCGGCC CGGATCGGTG TCAGGCTGCG GTGAGGTCAC GCTTTCTTCT 1140CCGGATCACC CAGTGCCACT TGATAAGCCG CGGTACAGGA GGCGGCGATG GAACCCAGCA 1200GTCCGGCCCG GTAACCGGTC ATCTCGGTGG CGGCCCGGGC GGCATCCTCG GCCGACTCGC 1260GCAGCGCCTT GGCGACGGCG GTGACGGTCG GCTTGGCGGC CGGTGCCGCG GTGGAACTGG 1320TCGTCGTGGA CGGCGCTGCG CTGGTGGTGG GCGCCTCACC GTCGGTGAGG CGGGTGATCT 1380CATCGGAGAG GGCACGGGCG TGCGCGGTGC GCTCGCCGGC GATCGCGGTG AGGGTGGCCA 1440CCATGTCGGG GGGCAGCGTC CGTCCGGGCG GCGCCGTCGC CGCCTCACCG GCGAGCAGGC 1500TGTCGGCGTT GGCGCGGTCG AACTGGGTCC GCAGGTCGGC GAGATCGGCC GGTGGGGGTG 1560GCGGTGAACA GGCCGTCGTC CCGGCGAGGA GCCCCACTGC CAGGGTGGCT GGGACCGCGG 1620CGATCAACAG GCGGCGCCGG GTCAGGGTGG GTGGGGCGCT CGGCACGCCC ACATCCTGCC 1680ATGTTCGGTT GCGCTGCTCG TTTGGTGATT GGCACGTCGC GCCTGGCGTA TCGTTTGTTA 1740ACCGAACCCG GGTCCCGCCG ACCGGGGAAT GTGTCCGCAC AACTCAAGAT GAGGAGCTCG 1800CCGTGGCATC GGATGACCCG CTGCGGTCTG CGCGATTACC GTCGCGGGAG CAGGTGATCG 1860AGCTCCTCGA CGAAGAGTTC AGCCGGGCGG GCTACGAAGT CGAAGACGTG GTGATCGGCG 1920GTGGCCGTCC GCCGCGGCTC ACCGTGATCG CCGATGCCGA CAACGGCGTC GATCTGGATG 1980CCATTGCCAC CTTGTCGAAG GTGGCCTCGG CGGCCCTGGA TGCCGCCGAA CAGGCCACCG 2040GGGACTACGG CGCTTATGTG CTGGAGGTGA CCTCCCGCGG CGTCGACCGA CCGCTGACCA 2100CCGAGAAGCA CTTCCGTAGG TCCCGTGGCC GCAAGGTCGA GGTCACGCTG GCCGACGGAT 2160CGAGCCTGAC GGGCCGGATC GGGCAGACCG CCGACGGGGT GGTGCACTTC GTCGTCGCTG 2220CGGGCAAGGA TTTCGAGATC CGACCGGTCG ATGTCACCGG AATCACCAAA GCAATTGTGC 2280AAGTTGAATT TTCGCCTCCG AATCGGCGTG AATTGGAATT GTCCGAGCAG TCTGGAAAGG 2340GGGACGACGC ATGAACATCG ACATGGCGGC GCTCCATGCC ATCGAGTCCG ACAAGGGAAT 2400CTCGGTCGAT ATCGTCGTGG ACACCATCAA ATCCGCGTTG CTGACCGCGT ACCGGCACAC 2460CGAGGGCCAC GAGGCCGACG CGCGTATCGA CGTCGACCGC AAGACCGGTG TGGTCAAGGT 2520GATGGCCAGG GAAACCGATG GCGACGGCAA CCTGATCAAC GAATGGGACG ACACCCCAGA 2580GGGATTCGGC CGCATCGCGG CGACCACCGC GCGCCAGGTG ATCCTGCAGC GGCTGCGCGA 2640CGCCGAGAAC GAACGGATGTA CGGCGAATTC 2670