苯丙咪唑抗性基因在毛壳菌中的应用 技术领域：本发明涉及一种苯丙咪唑抗性基因在毛壳菌中的应用。
背景技术：在植物病害生物防治领域中微生物所发挥的作用越来越大了。在国外，美国成功的将Bt毒素基因转移到假单胞细菌(Pf)中，构件出转基因工程细菌；澳大利亚科学家用生物技术手段，将放线土壤杆菌(K84)改良成具有持久效力的K1026菌株。在国内，利用现代基因工程技术建立了苏云金芽胞杆菌(Bt)、荧光假单胞菌(Pf)，枯草芽孢杆菌(Bs)等细菌的遗传转化体系，创造出一套适合我国国情的菌株分离筛选、基因鉴定、克隆等研究方法，并在真菌的生物改良上取得了重大突破。微生物农药的研究与生产逐渐成为生物防治的支柱产业。而在微生物农药的研发过程中，其技术轨迹由最早的大规模的野生菌株的筛选，发展到采用物理及化学方法定向诱变技术，进而利用选择压力的调节来达到筛选理想菌株方法的使用。但由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，严重地限制了它们广泛应用。为了克服杀菌剂与生物防治菌使用之间的矛盾，人们试图采用基因工程手段改造微生物菌株，使其既具有防病害能力，又能够提高对化学杀菌剂的抗性，使生物防治与化学防治的综合体系得以建立。
发明内容：本发明地目的是提供一种苯丙咪唑抗性基因在毛壳菌中的应用，用原生质体转化技术，利用酵母的微管蛋白的突变基因，成功的建立起多菌灵抗性基因在木霉、毛壳菌中的转化体系，攻克了木霉和毛壳菌对化学农药非常敏感这一重大难题，使综合防治思想的真正实现成为可能。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
苯丙咪唑抗性基因在毛壳菌中的应用。实现应用的主要内容：
1.球毛壳(Chaetominm globosum)由本实验室分离保存。质粒pBR129含有多菌灵抗性基因(Ben)，来自美国斯坦福大学，与E.coli DH5a(大肠杆菌)中扩增和保存。
2.菌体的培养：PDA固体培养基和PD液体培养基分别用于球毛壳的孢子培养和菌丝培养。
PDA固体培养基组成：马铃薯 200g
蔗糖或葡萄糖 20g
琼脂 15-20g
水 1000ml
Ph 自然
PD液体培养基组成：PDA中去除琼脂
把马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖琼脂，融化后加水至1000ml。1.05千克/平方厘米，121.3℃灭菌20分钟。
培养条件：37℃温浴3天
3.毛壳菌转化前对多菌灵敏感性测定：将毛壳菌分别培养在含多菌灵浓度为0，0.05，0.15，0.25，0.35，0.5μg/ml的培养基中，测定对其菌丝生长的抑制(处理菌落半径/对照菌落半径)，结果表明，这些毛壳菌在0.5μg/ml多菌灵的浓度下均不能生长。
4.感受态原生质体的制备：
经DM(1.2mol/L山梨醇，10mol/L Tris缓冲液Ph＝7)清洗，
将在PD液体培养基中培养的木霉菌丝经5,000r/min离心5min，弃上清收集沉淀。将沉淀悬浮于含0.8％Novozym酶234的DM中，室温震荡作用3h，经纱布过滤除去细胞碎片，在经5,000r/min离心5min，沉淀用DM液和TM液(1.0mol/L山梨醇，10mmol/LTris，pH＝7.5，20mmol/L caCl2)转化液各洗涤一次，然后将沉淀悬浮于TM转化液中。
5.转化：在200μlTM原生质体(2×106)液中加入100μl含50μg的pBR129质粒的TE(Tris EDTA乙二胺四乙酸)，置冰浴中作用10min，再加入1mlPEG聚乙二醇(4000)TM液，在室温作用10min，然后再加入4ml RM(1.2mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，pH＝7.5，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4，0，3％NaNO3)液进行稀释，按每分2×106原生质体的数量，混合于10ml溶化的RA(1.2mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，pH7.5，0.1％K2HPO4，0.3％NaNO3，0.7％琼脂)中，在平皿中27C下分别培养16，18，24h。
6.筛选：分别培养16，18，24h后，在平皿中加入10ml含多菌灵(江阴农药厂生产的可湿性粉剂)(10μg/ml)的RA，在27C下继续培养，转化时不加质粒的对照组处理无菌落出现，加入质粒的处理出现了抗多菌灵的球毛壳菌株，继代培养发现，这些菌株可在高于0.5μg/ml的多菌灵处理下正常生长，挑选出成活的菌株打孔取样作进一步生物测定。
7.转化子生物测定：将转化子在含0，50，500，1000，1500，2000μg/ml多菌灵处理条件下培养，测定转化子对多菌灵的抗性水平，结果显示，将多菌灵抗性基因转化到毛壳菌中，使之能够在2000μg/ml多菌灵处理条件下正常生长，而原菌株在0.5μg/ml多菌灵浓度下即不能生长，抗药性比原来增加4000倍。同时，将转化子在不含多菌灵的培养基上培养十代(培养条件同步骤2)，然后分别再在含有0，50，500，1000，1500，2000μg/ml多菌灵处理条件下培养，检验转化子的抗药稳定性，结果显示，抗药性稳定不变。本发明的优点在于：
1.该菌株整合了来自酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)β-微观蛋白的突变基因，突变位点为241位的精氨酸变成组氨酸，这一变异使其具有更强的抗药性；
2.对多菌灵敏感性降低：实验证明，转化前菌株在0.5μg/mg的多菌灵液体处理下抑制率为100％，转化后可以在2000μg/mg的多菌灵处理条件下正常生长，抗药性增加4000倍；这种抗药性的增强效果是十分显著的，其机理是改变了多菌灵对真菌的作用位点，使多菌灵不能作用于真菌，从而克服了真菌对多菌灵药物的敏感性，使化学防治与生物防治综合防治体系的建立成为可能，从而达到更理想的防治病害的效果；
3.实验证明，该基因工程菌株在非选择压力下连续培养十代，抗药稳定性不变，转化率为6-7个转化子/μgDNA；该性状说明其目的基因表达非常稳定，不需要反复进行基因转化，有利于应用这一菌株于植物病害的综合防治的实践中；
4.与原菌在培养条件相同的情况下，该菌株生长速度快，菌丝粗大，子囊壳黑色，与原菌株呈现出不同的生长状况。这一特性缩短了育菌周期，使其产业化更加方便、容易。实施例1：苯丙咪唑抗性基因在毛壳菌中的应用。其菌种、培养过程、得到培养物的稳定性等见发明内容部分。