大豆茎尖转化超声波辅助的外源基因导入方法 技术领域：
本发明涉及一种大豆茎尖转化超声波辅助的外源基因导入方法，是一种利用超声波为辅助手段的外源基因导入大豆，从而改良大豆的遗传性状的的操作方法，属于生物技术和现代农业技术领域。背景技术：
植物基因转化的成功，取决于是否具有良好的受体系统，即是否具有较强的植物再生能力和高频的转化率，(《植物基因工程原理与技术》王关林主编，技术出版社)。目前转基因的方法主要分为两类：1直接法，例如，花粉管通道法，微注射法，电击法，PEG法和基因枪法，2载体法，例如，农杆菌介导法和噬菌体作载体法等。其中农杆菌介导法在植物转基因中占有重要地位。尽管有人先后选用子叶节，幼胚等作为外植体转化获得了成功，但转化效率不高(0.6％)。Bechtold曾用真空渗入技术将农杆菌接种拟南芥植株得到了大量突变体(Bechtold 1993.life sciences 316：1194-99)。但此项技术在大豆上应用未见报导。因而目前存在的主要问题是提高大豆转化效率。发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大豆茎尖转化超声波辅助的外源基因导入方法，使大豆出芽多，再生苗能力强，提高大豆转化率。
为实现这样的目的，本发明在农杆菌介导BT基因对大豆茎尖转化的过程中，采用了超声波辅助方法，大豆种子经萌发、预培养之后，进行农杆菌感染时辅以超声波侵染处理，使种子在一定选择压力超声波的空气化效应过程中，气泡团闭合形成瞬间高压，连续不断的高压象一连串小“爆炸”不断的冲击材料表面，造成许多微损伤，避免了以往用刀割伤口对外植体造成地过度损伤，同时也增加了农杆菌与外植体之间的接触面积，提高农杆菌的感染效率。再经共培养、不定芽培养及转化芽诱导生根，得到转化植株产生的种子。
本发明的方法包括如下具体步骤：
1.取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钠溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗4～5次，然后将种子置于无菌水中浸泡18～24小时，使种子萌发。
2.剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
3.将预培养的茎尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制备好的农杆菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超声波洗器(功率500W，工作频率50kHz)的中央，超声波侵染处理15～20分钟。
4.侵染完毕，将材料取出，用无菌滤纸吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基中避光培养3天。
5.转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
6.转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2～3cm。
7.切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
本发明采用超声波在外植体上制造微小伤口，增加了农杆菌与外植体之间的接触面积，在导入BT基因的过程中起到了很好的效果，与普通农杆菌介导的方法相比，明显提高了农杆菌的感染效率，有效的提高了出芽数量和转化苗的数量。具体实施方式：
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。实施例1
实验品种为东农43，60粒。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5分钟，转入含有饱和次氯酸钠溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗4次，然后将种子置于无菌水中浸泡18小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时，使种子萌发。
将预培养的茎尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制备好的农杆菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超声波洗器(功率500W，工作频率50kHz)的中央，超声波侵染处理20分钟。
侵染完毕，将材料取出，用无菌滤纸吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基中避光培养3天。
转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株东43号34株。实施例2
实验品种为吉林27，60粒。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡1分钟，转入含有饱和次氯酸钠溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗5次，然后将种子置于无菌水中浸泡24小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时，使种子萌发。
将预培养的茎尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制备好的农杆菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超声波洗器(功率500W，工作频率50kHz)的中央，超声波侵染处理15分钟。
侵染完毕，将材料取出，用无菌滤纸吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基中避光培养3天。
转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到3cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株吉林27号36株。实施例3
实验品种为合丰35，60粒。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.7分钟，转入含有饱和次氯酸钠溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗5次，然后将种子置于无菌水中浸泡19小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时，使种子萌发。
将预培养的茎尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制备好的农杆菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超声波洗器(功率500W，工作频率50kHz)的中央，超声波侵染处理18分钟。
侵染完毕，将材料取出，用无菌滤纸吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基中避光培养3天。
转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根18天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株合丰35号37株。
本发明的方法能适合于大豆转各种基因，能快速得到较高频率的大豆转化植株。