吡啶并[2，3-D]嘧啶和嘧啶并[4，5-D]嘧啶核苷 本申请要求2000年7月6日提交的美国临时申请号60/216,418的权益，该申请通过引用全部结合到本文中。发明领域
本发明领域为核苷类似物。发明背景
核苷类似物长期被用作治疗癌症和病毒性感染的抗代谢药物。在进入细胞后，许多核苷类似物通过核苷补救途径进行磷酸化，由核苷激酶将其转化为相应的一磷酸，并且随后通过一种激酶使该单磷酸酯磷酸化为二或三磷酸酯。当一种核苷类似物在所述细胞内转化为其三磷酸酯，它可作为DNA或RNA聚合酶的底物并可以结合到DNA或RNA中。结合到核酸复制体或转录体中的某些非天然的核苷类似物可被早期链的终止或修饰的核酸的功能丧失而中断基因表达。另外，某些核苷类似物是十分有效的DNA和RNA聚合酶抑制剂，它们可以显著降低天然核苷能够结合的速率。
而且，核苷类似物还可以以非DNA和/或RNA的合成的方式干扰细胞。例如，一些核苷类似物可引起癌细胞的编程性细胞死亡，或抑制某些非聚合酶的酶。然而在另外的选择性的生物作用中，已知一些核苷类似物可调节免疫系统。核苷类似物的生物作用的典型实例包括5-氟尿苷对胸苷酸合酶的抑制，或2-氯腺苷对腺苷脱氨基酶的抑制。另外的实例包括planocin A对S-腺苷基高半胱氨酸水解酶(hydrolasene)的抑制。
可是，不幸的是，大多数抑制肿瘤生长或病毒感染的已知核苷类似物也意味着威胁正常地哺乳动物细胞，主要是因为此类类似物在正常细胞和病毒或肿瘤细胞之间缺少足够的选择性。因此，还需要提供具有改良的特异性和降低的毒性的核苷类似物的方法和组合物。本发明概述
本发明提供在核苷碱和/或糖部分进行修饰的新的核苷，所述核苷在对肿瘤细胞的细胞毒性方面可以显著地增加选择性和/或降低核苷类似物对正常细胞的毒性。特别设计的核苷包括吡啶并[2，3-d]嘧啶、嘧啶并[4，5-d]嘧啶及其衍生物。设计的化合物的糖部分可进一步包括在C2、C3、C4和/或C5位上的修饰。
更具体地说，本发明提供具有按照式(I)结构的核苷：其中A为O、S、CH2；R2、R2′、R3和R3′独立选自H、F、OH、NH2、CN、N3、CONH2和R，其中R为低级烷基、低级链烯基、低级链炔基或低级酰基，并且任选含有至少一个杂原子和官能团；或R2和R2′一起，或R3和R3′一起选自＝CH2、＝CHR″、＝CR″2、＝NR″，其中R″为H、F、OH、CN、N3、CONH2、低级烷基、低级链烯基、低级链炔基或低级酰基；R4和R5′独立选自H、低级烷基、低级链烯基、低级链炔基或芳烷基，并任选含有至少一个杂原子和一个官能团；R5为H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR)2或P(O)(OR)2，其中R为掩蔽基团；而B选自式(II)、(III)、(IV)和(V)的杂环基团：其中X为H、NH2或OH；Y为H、NH2或卤素；在式(II)和(IV)中的Z1，和在式(III)和(V)中的Z3为O、S、NR″、CHM或CM2；在式(III)和(V)中的Z1，和在式(II)和(IV)中的Z3为N、CH或CM；Z2为N、CH或CM；其中M为F、Cl、Br、OH、SH、NH2、CN、COOR″、C(＝NH)NH2、低级烷基、低级链烯基、低级链炔基、芳烷基或芳基。
在一个特别优选的方面中，所述核苷类似物具有按照式(VI)的结构：
在本发明主题的其它设计方面，所述核苷类似物可以被修饰形成各自的药物前体，并且特别设计的修饰包括在糖部分的C5位上的磷酸化作用或加上膦酸基团、在糖部分上的羟基基团的修饰和在核酸碱(nucleobase)上的氨基基团上的修饰。特别优选在靶室、靶细胞或靶器官中由设计的化合物脱除这些修饰物。
在本发明主题的另外一个方面，抑制肿瘤细胞生长的方法包括将按照式(I)的设计的化合物给予一个系统，优选为哺乳动物，而更优选为人类的步骤。特别设计的肿瘤细胞包括结肠癌细胞、乳腺癌细胞、黑素瘤细胞、神经胶质瘤细胞和前列腺癌细胞。另外设计所述生长抑制包括抑制RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和/或RNA聚合酶III，和/或诱导编程性细胞死亡，所述编程性细胞死亡至少部分由MEK-磷酸化作用触发。图谱简述
图1为描述一种示例性设计的化合物对各种癌细胞的细胞毒性的比较图。
图2为描述示例性设计的化合物抑制各种癌细胞增殖的比较图。
图3为描述示例性设计的化合物在各种癌细胞中的抗-促克隆形成的活性的比较图。
图4A和4B为描述示例性设计的化合物在各种癌细胞中诱导死亡的比较图。
图5为描述示例性设计的化合物抑制K562细胞RNA合成的图。
图6为描述示例性设计的化合物抑制RNA聚合酶I&III的图。
图7为描述示例性设计的化合物抑制RNA聚合酶II的柱图。
图8为描述示例性设计的化合物引起的MEK-ERK磷酸化作用的放射性自显影图。本发明详述
预期化合物
通常设计按照本发明主题的化合物具有按照式(I)的结构：其中A为O、S、CH2；R2、R2′、R3和R3′独立选自H、F、OH、NH2、CN、N3、CONH2和R，其中R为低级烷基、低级链烯基、低级链炔基或低级酰基，并且任选含有至少一个杂原子和官能团；或R2和R2′一起，或R3和R3′一起选自＝CH2、＝CHR″、＝CR″2、＝NR″，其中R″为H、F、OH、CN、N3、CONH2、低级烷基、低级链烯基、低级链炔基或低级酰基；R4和R5′独立选自H、低级烷基、低级链烯基、低级链炔基或芳烷基，并任选含有至少一个杂原子和官能团；R5为H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR)2或P(O)(OR)2，其中R为掩蔽基团；而B选自式(II)、(III)、(IV)和(V)的杂环基团：其中X为H、NH2或OH；Y为H、NH2或卤素；在式(II)和(IV)中的Z1，和在式(III)和(V)中的Z3为O、S、NR″、CHM或CM2；在式(III)和(V)中的Z1，和在式(II)和(IV)中的Z3为N、CH或CM；Z2为N、CH或CM；其中M为F、Cl、Br、OH、SH、NH2、CN、COOR″、C(＝NH)NH2、低级烷基、低级链烯基、低级链炔基、芳烷基或芳基。
在本发明主题的一个优选方面，设计的化合物具有按照式(II)的杂环基团，A为核苷类似物的糖部分中的氧，而更优选在此核苷类似物中X为NH2，Z1为O，而Z2和Z3为CH。同时不限制本发明的主题，还进一步优选在该糖部分R4和R5′为氢，而R5为OH。
另外在本发明主题的特别优选的方面，设计的核苷类似物具有按照式(VI)的结构：
关于设计的化合物的立体化学构型，应该理解，所述糖不需要限制于D-构型，而且也可以为L-构型。类似地，设计适宜的分子可包括一个或多个手性中心，它们可为对映体纯的(即为R-或S-构型)或为外消旋混合物(即为R-和S-构型)。同样，其中取代基(如碱或OH基团)可以定向在α-或β-位，两个位置均被考虑。
而且，应该理解，设计的化合物可以修饰为它们的对应的药物前体。当在此使用时，术语“药物前体”指设计的化合物的任意修饰，(a)改变设计的化合物的分子量和/或(b)改变设计的化合物对靶细胞和非靶细胞的生物有效性。例如，通过设计的化合物的羟基基团与有机酸的酯化作用(从而改变分子量，但是不必要改变对靶细胞的生物有效性)可以制备药物前体。另一方面，设计化合物可以转化为包括环状膦酸酯的药物前体(从而增加对肝细胞的生物有效性)。
此外，应该特别注意到，设计的化合物的药物前体形式在靶器官、靶细胞或靶室(或在任何非靶环境中)可以全部或部分再转化为设计的化合物。再转化可以包括各种机制，而特别设计的机制为酶转化、氧化和/或还原。
也可以应用药物前体以便增加设计的化合物对靶器官、靶细胞或靶室的特异性。例如，设计的化合物可以与胆固醇(或胆固醇衍生物)偶合以便增加设计的化合物在肝-胆循环中的浓度。作为选择，设计的化合物可以偶合在一种化合物上，该化合物在靶细胞上具有相应的受体，从而增加设计化合物在靶细胞上或靶细胞内的浓度。在另一个实例中，设计的化合物可以与一种核易位信号偶合以便增加设计的化合物在细胞核内的浓度。
另外，可以应用药物前体以便减少设计的化合物在非靶器官、非靶细胞或非靶室的聚集。例如，可以修饰设计的化合物，以便当将此类化合物修饰为药物前体时，非靶细胞吸收设计的化合物的速率将显著降低。因此，尤其当设计的化合物对非靶细胞呈现细胞毒性时，可以应用药物前体以便降低设计的化合物在除了靶细胞或靶器官之外的细胞或器官中的细胞毒性。
另外在本发明主题的其它设计方面，适宜的化合物可以与药理学上的活性或非活性部分共价偶合。例如，药理学上的活性部分包括抗肿瘤细胞的药物如抗代谢剂(如喷司他丁TM)、DNA聚合酶抑制剂(如GemzarTM)、RNA聚合酶抑制剂(如ECydTM)、铂衍生物(如ParaplatinTM)、抗雌激素剂(如NolvadexTM)、Taxanes(如TaxotereTM)、GnRH类似物(如LupronTM)、DNA聚合酶抑制剂(如GemzarTM)、拓扑异构酶抑制剂(如HycamptinTM)、双膦酸酯(如ArediaTM)、生长激素释放抑制因子(如SandostatinTM)、干扰素(如IntronATM)、核苷类似物(如利巴韦林TM)，和IMPDH-抑制剂(如噻唑呋林TM)。
药理学上的非活性部分包括生物学的或非生物学的部分。例如，其中的靶特异性是特别需要的，设计的化合物可以与一种抗体、抗体碎片或合成的抗体(如scFv)偶合。在另外的实例中，设计的化合物可以与一种螯合剂偶合(如结合一种放射性核酸金属化合物)。作为选择，特别优选延长血清半衰期或降低免疫原性，设计的化合物可以与惰性的或可生物降解的聚合物(如右旋糖苷、聚乙二醇等)偶合。
至于将设计的化合物与其它部分偶合的方法，认为所有已知的偶合方法是适宜的并且尤其包括共价偶合(具有或不具有单独的接头分子)、氢键合和疏水的/亲水的相互作用。
在本发明主题的另一方面，设计的化合物也可以为它们的各自的盐的形式，其中所述盐可以为一种有机或无机酸或碱的盐(如乙酸盐或吗啉代盐，HCl盐)。在本领域已知有许多药理学上可接受的盐，所有这些已知的盐被认为是适宜与在此提出的相关技术结合使用。
设计的化合物的合成
修饰的呋喃核糖的合成
以下示例性方案显示一些设计的化合物的合成途径。按照一种公开的方法(Jones等，碳水化合物化学的方法(Methods in CarbohydrateChemistry)(Whistler和Moffat编辑)VI卷，315-322页，Academic Press，New York，(1972))制备的化合物1用多种亲核试剂如格利雅试剂处理得到2，使2苯甲酰化或乙酰化，随后用三氟乙酸处理，得到化合物4。在硫酸的存在下，进行苯甲酰化，随后用乙酸酐/乙酸处理，得到化合物6，使用化合物6与吡啶并[2，3-d]嘧啶或嘧啶并[4，5-d]嘧啶碱缩合。6aR＝Me 6bR=乙炔基 6cR=乙烯基 6dR＝烯丙基将化合物2a(5(R)-C-甲基衍生物)转化为磺酸酯7，使磺酸酯7进行亲核取代得到构型上转化的化合物8。使该异亚丙基去保护和接着乙酰化得到四乙酸酯9。
在氢氧化钠水溶液中用甲醛处理化合物1得到4’-羟基甲基衍生物10，选择性地保护化合物10得到化合物11。
随后用DMT保护并除去TBS得到化合物13，化合物13可转化为多种取代物。使该4-C-取代的衍生物进行与5-C-取代的呋喃核糖类似的转化，可转化为化合物17，化合物17可用于与核苷碱缩合。aR＝甲基 bR＝乙烯基 cR＝乙基 dR＝HOCH2将化合物13转化为18，使化合物18进行维悌希(Wittig)反应得到19。19经钯氢化得到20。将化合物13转化为4-C-苯氧基硫代羰氧基甲基衍生物21，使21与三(三甲基甲硅烷基)硅烷(9.0ml，29mmol)反应，然后与1，l，-偶氮二(环己基腈)反应得到22。其中设计的化合物含有在C4′或C5′位上没有修饰的糖部分(如L-呋喃核糖，2′-羟基-2′-乙炔基-L-呋喃核糖)，按照本领域熟知的方法进行相应的保护的糖部分(以D-或L-构型)的缩合。
修饰的吡啶并嘧啶核苷的合成
由甲硅烷基化的吡啶并[2，3-d]嘧啶碱与适当保护的，修饰的呋喃核糖缩合制备5′-取代的核苷类似物。以下方案显示4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶25的合成。按照报道的方法(Archive der Pharmazie 1985，318，481-486)制备的化合物23与氯三甲基硅烷和碘化钠在乙腈中回流得到24，使24与乙酸甲脒在回流下反应得到化合物25。
以下方案显示吡啶并[2，3-d]嘧啶25与修饰的呋喃核糖6和17的缩合。用双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺处理化合物25得到甲硅烷基化的吡啶并嘧啶，使该化合物与6或17反应得到26或28。除去苯甲酰基分别得到吡啶并[2，3-d]嘧啶核苷27和29。R＝甲基，乙基，乙烯基，丙基，烯丙基，羟基甲基
其它糖-修饰的吡啶并嘧啶或嘧啶并嘧啶核苷可以通过核苷碱和修饰的糖的缩合或通过核苷的修饰进行制备。例如，通过类似于对2′-脱氧腺苷所描述的方法，将4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶核糖核苷(27或29R＝H)转化为2′-脱氧衍生物30，并通过缩合制备4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶木糖苷34。
通过Vorbrüggen反应使4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶与各种1-O-乙酰化戊糖缩合。所述核苷经进一步衍生化提供另外一类吡啶并[2，3-d]嘧啶核苷。
修饰的嘧啶并嘧啶核苷的合成
由甲硅烷基化的嘧啶并[4，5-d]嘧啶碱与适当保护的、修饰的呋喃核糖缩合制备5′-取代的核苷类似物。按照基本类似于上述合成方法的方案合成嘧啶并[4，5-d]嘧啶核苷。
根据用于将糖部分偶合到吡啶并[2，3-d]嘧啶或嘧啶并[4，5-d]嘧啶碱上的缩合反应的反应条件，可以将对应的核苷类似物连接在所述碱的N1或N8原子上。在任何情况下，所述碱的糖基化位置通过X-射线晶体结构确定。
设计的化合物的用途
通常应该认识到，设计的化合物可以用于对给予设计的化合物呈正反应的系统的任何处理或治疗。可是，特别优选所设计的化合物可用于抗肿瘤治疗和抗病毒治疗(作为一种直接的抗病毒化合物和/或间接的抗病毒化合物)，以及用于调节免疫系统的治疗。
抗肿瘤的治疗
一般预期按照本发明主题的化合物可以用作抗肿瘤剂，它们可直接或间接抑制肿瘤细胞或细胞群的生长、侵入和/或扩散。特别设计的一种治疗肿瘤疾病患者的方法包括以抑制肿瘤细胞生长的有效剂量的设计的化合物给予患者的步骤，并且特别优选的化合物为按照式(VI，见上文)的化合物。设计的剂量在0.01-100mg/kg之间的范围内，而更优选在5-50mg/kg之间。然而，也设计了可供选择的剂量、途径、时间进度表和制剂，并且适宜的其它给药方法描述如下。同时设计的化合物的用途不限于一种具体的肿瘤细胞或肿瘤疾病，特别提及的肿瘤细胞包括结肠癌细胞、乳癌细胞、黑素瘤细胞、神经胶质瘤细胞，和前列腺癌细胞。
抗病毒治疗
通常考虑到按照本发明主题的化合物在病毒感染中可以用作直接和/或间接的抗病毒剂。特别设计了一种治疗病毒感染患者的方法，该方法包括以抑制病毒传播(即包围宿主细胞的过程，其中一种或一种以上的病毒引起宿主细胞产生一种或多种病毒复制体，其中术语“产生”指核苷酸合成、蛋白质处理和蛋白质装配)的有效剂量的设计的化合物给予患者的步骤，并且其中组合物包含至少一种所设计的化合物。设计的剂量在0.1-100mg/kg之间的范围内，更优选在5-50mg/kg之间。然而，也设计了可供选择的剂量、途径、时间进度表和制剂，并且适宜的其它给药方法描述如下。同时设计的化合物的用途不限于在一种具体的病毒感染中的具体病毒。特别提及的病毒感染为HIV感染、HCV感染、HBV感染、RSV感染、流感病毒感染和副流感病毒感染。
免疫调节
通常考虑到按照本发明主题的化合物可用作免疫调节化合物，并且特别设计了此类化合物可用于调节免疫活性细胞(即T-细胞)对攻击的1型反应和2型反应之间的平衡。更具体地说，设计了按照本发明主题的化合物相对于2型反应可以增加1型反应(通过增加1型反应或通过降低2型反应)，可是，也设计了本发明主题的化合物相对于1型反应而言可以增加2型反应(通过增加2型反应或通过减少1型反应)。另外还设计了按照本发明主题的化合物的用途，应该理解，设计的化合物以抑制1型和2型反应的有效浓度也可以用作免疫抑制剂。
设计的化合物的给药方法
关于设计的化合物的给药方法，应该理解，可以在任意适宜的方案下以任意适宜的药用制剂给予所述化合物。可是，一般优选口服给予设计的化合物。在本发明主题的另一方面，应该理解，各种可供选择的给药方法也是适宜的，并且还应该进一步认识到，一种特别的给药方法通常取决于设计的化合物的化学稳定性、生物利用度、剂量、制剂和/或所需要的药代动力学/药效学性质。因此，适宜的给药方法将包括口服给药(如片剂、糖浆剂等)、局部传递(如软膏剂、喷雾剂、乳膏等)、胃肠外体系传递(如吸入)和直接或间接传递到血流中(如静脉或肌内注射等)。
因此，设计的化合物的制剂可以在很大程度上变化。例如，所述药物或药物组合物呈现足够的稳定性，以便通过胃肠道系统而没有不需要的化学修饰或酶修饰，口服制剂可以包括糖浆剂、片剂、胶囊剂(gel caps)、散剂等。另一方面，设计的化合物经过胃肠道进入血流的吸收或通过是一个问题，适宜的制剂特别包括可注射的溶液或悬浮液(如约7.2-7.5的pH的缓冲生理盐水溶液)。
关于设计的化合物的剂量，应该理解，各种剂量是适当的，典型的设计剂量在0.1mg/kg到几个100mg/kg的范围内，甚至更多。例如，当设计的化合物以相对低的速率排泄或代谢，或需要长期的治疗时，典型的剂量在0.5mg-10mg/kg之间的范围内。另一方面，当设计的药物的生物利用度相对低，或当代谢作用的转化相对快时，典型的剂量将在10mg-100mg/kg之间的范围内。
关于设计的化合物的剂量，应该理解，至少按照本发明主题的一些化合物在体内可以被磷酸化。因此，尤其是当需要瞬间生物利用度时，可以减少以磷酸化形式给予设计的化合物的剂量。
给药的时间表可以在很大程度上变化，并且设计的时间表包括在整个治疗过程中的单一剂量、在整个治疗过程中每日多个单一剂量、每日多个剂量和至少部分治疗过程持久给药(如持续输注、植入渗透泵等)。通常优选适宜的时间表持续恒定地传递设计的化合物，脉冲传递(即至少一次首次剂量给药后，随后以比首次剂量较低的剂量多次给药)，这也是适宜的。关于治疗持续时间，可以认为，适宜的持续时间可以在单次给药和数天、数周、数年，甚至更长的时间之间变化。例如，当设计的化合物用于细胞培养时，单次给药，或相对短时间的给药可能是足够的。另一方面，当给予设计的化合物治疗一种急性期疾病时，适宜的治疗持续时间可以在几天和几周之间。类似地，通过给予设计的化合物治疗慢性疾病，延长给药一年或多年可能是适宜的。
在本发明主题的另一个选择的方面，设计的化合物可以与其它的药用活性物质联合以有助于治疗各种疾病，特别是肿瘤疾病。其它的药用活性物质可以分开给药或一起给药，并且当分开给药时，可以以任意的顺序同时或分别给药。具体地说，其它的预期的药用活性物质包括通常用作癌症治疗的化疗剂的药物和免疫调节的物质。例如，化疗剂包括抗代谢剂(如喷司他丁TM)、DNA聚合酶抑制剂(如GemzarTM)、RNA聚合酶抑制剂(如ECydTM)、铂衍生物(如ParaplatinTM)、抗雌激素剂(如NolvadexTM)、Taxanes(如TaxotereTM)、GnRH类似物(如LupronTM)、DNA聚合酶抑制剂(如GemzarTM)、拓扑异构酶抑制剂(如HycamptinTM)、双膦酸酯(如ArediaTM)、生长激素释放抑制因子(如SandostatinTM)、核苷类似物(如利巴韦林TM)，和IMPDH-抑制剂(如噻唑呋林TM)。设计的免疫调节物质包括细胞因子(如干扰素α和γ、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10和IL12)，细胞分裂素(如激动素)和趋化因子(如MIP-1)。实施例
以下实施例提供示例性合成、体外/体内实验，并且打算阐述本发明但不限制本发明。
合成
制备2，3-O-异亚丙基-5(R，S)-C-乙炔基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖
在氩气下，于-42℃，向搅拌的4-C，5-O-二脱氢-2，3-O-异亚丙基-β-D-甲基呋喃核糖苷(Jones等，碳水化合物化学的方法第1卷，315-322页(1972)，4.00g，19.78mmol)的无水THF(20ml)溶液中滴加入溴化乙炔基镁(0.5M在THF中，80ml，40mmol)。加完后，将产生的混合物缓慢地温热到0℃(～90分钟)。通过加冰(50g/水(50ml淬灭该反应并搅拌该混合物30分钟。在用10％乙酸水溶液中和后，用乙酸乙酯提取该混合物两次。干燥合并的有机层(Na2SO4)并浓缩。在硅胶上层析(乙酸乙酯-己烷1∶4)得到3.48g标题化合物(R/S比率1∶1)，为一种白色固体。类似地，制备以下化合物：从4-C，5-O-二脱氢-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖和溴化甲基镁制备1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖；从4-C，5-O-二脱氢-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖和溴化乙烯基镁制备2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖；从4-C，5-O-二脱氢-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖和溴化烯丙基镁制备5(R)-C-烯丙基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖。
制备5-O-乙酰基-1-O，5(S)-C-二甲基-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖
在0℃下，向搅拌的1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖(7.24g，33.17mmol)的无水吡啶(50ml)溶液中加入甲磺酰氯(3.1ml，39.92mmol)。在室温下搅拌产生的混合物1小时，冷却到0℃，加水(1.0ml)淬灭并在室温下搅拌30分钟。蒸发溶剂并将残余物溶解于乙酸乙酯中，用盐水洗涤三次，干燥(Na2SO4)并浓缩。经硅胶层析(30％EtOAc在已烷中)得到8.62g甲基化物，为一种无色的浆状物。
在氩气下，于125℃，加热1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-异亚丙基-5-O-甲磺酰基-β-D-呋喃核糖(8.62g，29.1mmol)和NaOAc(无水，3.5g，42.5mmol)在无水DMF(350ml)中的搅拌悬浮液4天。蒸发溶剂并使该残余物在硅胶上层析(25％EtOAc在已烷中)得到4.0g标题化合物，为一种白色固体。
制备5-脱氧-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖
在10℃下，向搅拌的2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(14.2g，70.0mmol)的无水吡啶(250ml)溶液中分批加入(30分钟以上)对甲苯磺酰氯(19.1g，100mmol)。在室温下搅拌产生的混合物18小时，冷却到0℃，加水(5.0ml)淬灭，并在室温下搅拌30分钟。蒸发溶剂。将该残余物溶解于乙酸乙酯中，用盐水洗涤三次，干燥(Na2SO4)并浓缩至干。经硅胶层析(乙酸乙酯-己烷1∶3)得到24.1g甲苯磺酸酯，为一种白色固体。
向LiAlH4(4.58 g，120.5mmol)在无水乙醚(120ml)中的搅拌悬浮液中加入在乙醚-甲苯(2.5∶1，140ml)中的所述甲苯磺酸酯(13.1g，36.55mmol)。回流所产生的混合物22小时，冷却到室温，用乙酸乙酯(25ml)稀释，加水(5.0ml)淬灭。蒸发该溶剂。将该残余物溶解于乙酸乙酯，用盐水洗涤三次，干燥(Na2SO4)并浓缩至干。经硅胶层析(乙酸乙酯-己烷1∶3)得到3.58g标题化合物，为一种无色液体。
制备5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲酰基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖
在0℃下，向搅拌的5(R)-C-烯丙基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(4.49g，18.38mmol)的无水吡啶(40ml)溶液中加入苯甲酰氯(2.7ml，23.0mmol)。在室温下搅拌产生的混合物18小时，用冰冷却，加水(1ml)淬灭，并在室温下搅拌30分钟。蒸发该溶剂。将该残余物溶解于乙酸乙酯中，用盐水洗涤三次，干燥(Na2SO4)并浓缩。经硅胶层析(在己烷中的12％乙酸乙酯)得到6.26g5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲酰基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖，为一种无色的浆状物。
在0℃下，搅拌5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲酰基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.2g，17.8mmol)在TFA-H2O(9∶1)混合物中的溶液90分钟并在0℃浓缩至干。将该残余物溶解于甲醇-甲苯混合物(20ml，1∶1)中并浓缩至干。在硅胶上层析(乙酸乙酯-己烷1∶1)得到3.70g标题化合物，为一种白色固体。类似地，制备以下化合物：从5-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖制备5-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(R/S比率1∶1)；从5-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖制备5-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖；从2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖制备5-O-苯甲酰基-1-O-甲基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖。
制备1-O-乙酰基-5(R)-C-烯丙基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-D-呋喃核糖
在0℃下，向搅拌的5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲酰基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(3.60mg，11.68mmol)的无水吡啶(80ml)溶液中加入苯甲酰氯(3.0ml，25.84mmol)。在室温下搅拌产生的混合物18小时，用冰冷却，加水(1ml)淬灭，在室温下搅拌30分钟。浓缩该混合物，用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤三次，干燥(Na2SO4)并浓缩至干。在硅胶上层析(在己烷中的15％乙酸乙酯)得到5.3g标题化合物，为一种无色的浆状物。
在0℃下，向5(R)-C-烯丙基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(4.0g，7.74mmol)在乙酸(14ml)和乙酸酐(1.75ml，18.36mmol)中的搅拌溶液中加入浓硫酸(200ul，3.79mmol在4.0ml乙酸中)。在室温下搅拌产生的混合物20小时，冷却到0℃，用冷乙酸乙酯稀释，用水、稀NaHCO3，然后用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。在硅胶上层析(乙酸乙酯-己烷1∶4)得到2.82g标题化合物(α/β比率1∶2)，一种无色的泡沫状物。类似地，制备以下化合物：从5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-甲基呋喃核糖苷制备1-O-乙酰基-5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖(R/S比率1∶1和α/β比率1∶2)；从4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-甲基呋喃核糖苷制备1-O-乙酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-D-呋喃核糖(α/β比率1∶3)；从1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖制备5(R)-C-甲基-1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖；从5-O-乙酰基-1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖制备5(S)-C-甲基-1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖；从5-O-乙酰基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖制备5-脱氧-1，2，3-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖；从1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖。
制备1-O-甲基-5-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖
在0℃下，向搅拌的4-C，5-O-二脱氢-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖1(20.22g，100mmol)的二噁烷(380ml)溶液中滴加入甲醛(37％溶液，76ml)，然后加入2M NaOH(188ml)。在室温下搅拌该产生的混合物20小时，冷却到0℃，中和(10％乙酸)，浓缩(～50％)并用二氯甲烷提取两次。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩至干。在硅胶上层析(在氯仿中的4％甲醇)得到20.2g 1-O-甲基-5-O-苯甲酰基-2，3-O-异亚丙基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖，为一种白色固体。
在0℃下，搅拌1-O-甲基-5-O-苯甲酰基-2，3-O-异亚丙基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖(2.0g，4.5mmol)在9∶1(v/v)的三氟乙酸和水的混合物(11ml)中的溶液2小时并蒸发至干。将该残余物溶解于甲醇中并蒸发(3次)，然后溶解于吡啶中并蒸发。使该残余物经硅胶层析[在二氯甲烷中的甲醇(0-0.5％)]得到1.7g标题化合物，为一种油状物。
制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖
向1-O-甲基-5-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖(1.7g，4.2mmol)的吡啶(14ml)溶液中加入苯甲酰氯(1.2ml，10mmol)。在25℃下，搅拌该反应混合物16小时并加入甲醇(5ml)。蒸发溶剂并将该残余物溶解于乙酸乙酯(20ml)和水(10ml)中。有机层经硫酸钠干燥，过滤，蒸发滤液至干。使该残余物进行硅胶层析[在二氯甲烷中的甲醇(0-0.5％)]得到2.4g1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖，为一种白色固体。
在0℃下，将硫酸(97％，75ml)加入到1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-(苯甲酰氧基甲基)-β-D-呋喃核糖(1.7g，2.8mmol)在乙酸(6.7ml)和乙酸酐(0.67ml)的混合物中的溶液中。在25℃下，搅拌该反应混合物15小时并用乙酸乙酯(50ml)和水(10ml)稀释。用盐水(3次)、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤该溶液，经硫酸钠干燥，过滤，蒸发该滤液至干。使该残余物经硅胶层析[在二氯甲烷中的乙醇(0-2％)]得到1.4g标题化合物，为一种白色固体。
制备4-C-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖
在0℃下，将4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(6.0g，18mmol)的吡啶(18ml)溶液加入到搅拌的4-C-羟基甲基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(3.5g，15mmol)的吡啶(60ml)溶液中。在室温下搅拌该反应混合物18小时，冷却到0℃。加入甲醇(6ml)，并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯和盐水，并用盐水洗涤有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。使该残余物进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(20-25％)]得到6.2g标题化合物，为一种白色固体。
制备2，3，5-三-O-苯甲酰基-1-O-甲基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖
在0℃下，将苯甲酰氯(1.5ml，13mmol)的吡啶(6ml)溶液加入到搅拌的4-C-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.2g，12mmoD的吡啶(52ml)溶液中。于室温下搅拌反应混合物15小时，然后冷却0℃。加入甲醇(5ml)，并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯和盐水，用盐水洗涤有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。使该残余物与甲苯共蒸发并溶解于80％的乙酸水溶液(174ml)中。在室温下搅拌该反应混合物2小时，然后在减压下蒸发该溶剂。将该残余物进行硅胶层析[在氯仿中的甲醇(1-2％)]以便移去大多数杂质，并将获得的白色泡沫状物溶解于乙腈(174ml)中。在0℃下搅拌该溶剂，然后加入N，N-二甲基氨基吡啶(4.3g，35mmol)和苯氧基硫代碳酰氯(2.4ml，17mmol)。在室温下再搅拌该反应混合物2小时并蒸发溶剂。用二氯甲烷和水溶解该残余物，并且用0.5 N盐酸溶液，然后用水，最后用盐水洗涤所产生的有机提取液。经硫酸钠干燥、过滤并在减压下蒸发滤液。用甲苯溶解该残余物并加入三(三甲基甲硅烷基)硅烷(9.0ml，29mmol)和1，1′-偶氮双(环己腈)(0.71g，2.9mmol)。在100℃下搅拌该反应混合物15小时，然后冷却至室温并在减压下蒸发溶剂。将该残余物进行硅胶层析[在二氯甲烷中的甲醇(1-2％)]以便移去大多数杂质，并将获得的油状物溶解于-15℃的三氟乙酸水溶液(90％v/v，21ml)中。在-10℃搅拌该反应混合物1小时，然后在高真空和低温下蒸发溶剂。使该残余物与甲醇共蒸发并经硅胶层析[在二氯甲烷中的甲醇(0-3％)]以便移去大多数杂质。用吡啶(18ml)溶解获得的油状物并在0℃搅拌该溶液。加入苯甲酰氯(14ml，12mmol)并在室温下搅拌该反应混合物16小时，然后冷却到0℃。加入甲醇并在减压下蒸发溶剂。将乙酸乙酯、己烷和盐水加入到该残余物中，用硫酸钠干燥所产生的有机提取液，过滤并蒸发滤液至干。使该残余物进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(25％)]得到1.8g(32％，6步)标题化合物，为一种浆状物。
制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖
在0℃下，将浓硫酸(97％，99ml)加入到2，3，5-三-O-苯甲酰基-1-O-甲基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1.8g，3.6mmol)在乙酸(9.0ml)和乙酸酐(0.9ml)的混合物中的溶液中。在25℃搅拌该反应混合物16小时并用乙酸乙酯(50ml)和盐水(10ml)稀释。用盐水(3次)，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发滤液至干。用乙酸乙酯和己烷(1∶4，v/v)的混合物溶解该残余物并且该标题化合物的b端基异构体立即结晶。过滤该白色的晶体得到1.1g(56％)的为纯的b端基异构体形式的标题化合物。使滤液进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(20％)]得到0.6g(32％)的标题化合物，为一种油状物(3∶1的a/b端基异构体混合物)。
制备5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-羟基甲基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖
在0℃、搅拌下，将叔丁基二甲基甲硅烷基氯(3.4g，23mmol)的吡啶(16ml)溶液加入到4-C-羟基甲基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(4.5g，19mmol)的吡啶(80ml)溶液中。然后在室温下搅拌该反应混合物24小时，然后冷却至0℃。加入水(5ml)并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯和盐水，用盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发滤液至干。将该残余物溶解于吡啶中并在0℃搅拌该溶液。加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(8.4g，25mmol)，并在室温下搅拌该反应混合物16小时，然后冷却至0℃。加入甲醇(10ml)并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯、己烷和盐水，并用0.5N盐酸溶液，然后用盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发滤液至干。将该残余物溶解于四氢呋喃(57ml)中并加入氟化四丁基铵溶液(TBAF，在四氢呋喃中的1M溶液，23ml)。在室温下24小时后，加入0.2当量的TBAF并搅拌该混合物另外的36小时。蒸发溶剂并使该残余物进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(50％)]得到6.6g(65％，3步)的标题化合物，为一种白色固体。
制备5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-4-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖
在5℃、搅拌下，将三氟乙酸(0.49ml，6.4mmol)和吡啶(1.6ml，19mmol)的二甲基亚砜(11ml)溶液加入到5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-羟基甲基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.9g，13mmol)和N，N′-二环己基碳化二亚胺(6.6g，32mmol)在甲苯(26ml)和二甲基亚砜(66ml)的混合物中的溶液中。然后在室温下搅拌该反应混合物8小时，然后冷却至0℃。加入乙酸乙酯(80ml)和草酸(1.8g，19mmol)的甲醇(10ml)溶液，并在室温下搅拌该反应混合物15小时。过滤沉淀并用己烷和乙酸乙酯的1∶1混合物洗涤。用盐水、饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤滤液，再用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发滤液至干。使该残余物进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(25％)]得到6.1g(89％)的5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-甲酰基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖，为一种白色固体。
在室温、搅拌下，将五氧化钠(2.5g，22mmol)的苯(34ml)溶液加入到溴化甲基鏻(8.8g，25mmol)在乙醚中的悬浮液中。在室温下搅拌该混合物6小时，并加入5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-甲酰基-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.0g，11mmol)的乙醚(30ml)溶液。在室温下搅拌产生的混合物18小时，然后冷却至0℃。加入盐水(100ml)，随后加入乙酸乙酯(300ml)。用盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发滤液至干。使该残余物进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(25％)]得到5.9g(99％)的标题化合物，为一种白色固体。
制备5-O-苯甲酰基-4-C-乙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖
将载于活性炭上的钯(10％Pd，50％水，508mg)加入到5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2，3-O-异亚丙基-1-O-甲基-4-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖(5.0g，9.4mmol)的甲醇(254ml)溶液中。在6小时期间、在5βsi的氢气下，振摇该烧瓶并过滤催化剂，用甲醇洗涤。蒸发溶剂，将该残余物与吡啶共蒸发。然后将其溶解于吡啶(75ml)中并在0℃下搅拌。加入苯甲酰氯(1.2ml，10mmol)，在室温下搅拌该反应混合物15小时，然后冷却至0℃。加入甲醇(5ml)，并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯、己烷和盐水，用盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。将该残余物与甲苯共蒸发并将其溶解于-15℃的三氟乙酸的水溶液(90％v/v，57ml)中。于-10℃搅拌该反应混合物2小时，然后在高真空和低温下蒸发该溶剂。将该残余物与甲醇共蒸发，形成白色的沉淀。通过过滤移去该沉淀并且将含有该标题化合物的滤液蒸发至干，并溶解于乙酸乙酯、己烷和盐水中。用饱和的碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发该滤液至干。使该残余物进行硅胶层析[在己烷中的乙酸乙酯(33％)]得到1.8g(63％，3步)的标题化合物，为一种油状物。
制备1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖
在0℃、搅拌下，将苯甲酰氯(1.5ml，13mmol)加入到5-O-苯甲酰基-4-C-乙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖的吡啶(41ml)溶液中，并字室温下搅拌该反应混合物18小时，然后冷却至0℃。加入甲醇(5ml)，并在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯、己烷和盐水，用0.5N盐酸溶液，然后用盐水洗涤有机提取液，经硫酸钠干燥、过滤并蒸发至干。将该残余物与甲苯共蒸发并将其溶解于乙酸(14ml)和乙酸酐(1.5ml)的混合物中。在5℃下，加入用乙酸(1ml)稀释的硫酸(97％，165ml)。在25℃下搅拌该反应混合物4小时并用乙酸乙酯(50ml)和盐水(10ml)稀释。用盐水(3次)、饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并将滤液蒸发至干。使该残余物进行硅胶层析[在二氯甲烷中的乙酸乙酯(0-3％)]得到2.9g(92％)的标题化合物，为一种油状物(2∶1的b/a端基异构体混合物)。
制备4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶
将三甲基甲硅烷基氯(7.6ml，60mmol)加入到2-氨基-3-氰基-4-甲氧基-吡啶(Archiv der Pharmazie 1985，318，481-486；7.5g，50mmol)和碘化钠(7.50g，50mmol)在乙腈(225ml)中的搅拌悬浮液中。在回流下加热产生的混合物24小时。过滤沉淀并用乙酸乙酯洗涤，得到10.4g呈褐色的粉末(2-氨基-3-氰基-4-氧代-吡啶)。在减压下干燥该粉末，并将其悬浮在2-乙氧基乙醇(300ml)中。加入乙酸甲脒(31.2g，300mmol)，并在回流温度下加热该悬浮液2天，然后过滤。将该获得的灰色残余物溶解于2∶1沸腾的乙酸和水的混合物中并加入木炭。过滤该黑色的悬浮液并蒸发该滤液至干，得到一种白色固体，将该固体悬浮在热的碳酸氢钠饱和水溶液中。过滤该悬浮液得到4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶(2.0g)，为一种白色固体。
制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶
将4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶(0.23g，1.4mmol)悬浮在1，2-二氯乙烷(20ml)中并在55℃搅拌该混合物。加入BSA(0.87ml，3.5mmol)，在回流温度下搅拌该反应混合物90分钟，然后冷却到40℃。将在1，2-二氯乙烷(3ml)中的1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖(0.60g，1.2mmol)和TMSOTf(0.42ml，2.3mmol)加入到该澄清的溶液中，并在100℃搅拌该混合物48小时。将该混合物冷却到室温并加入饱和的碳酸氢钠水溶液。用乙酸乙酯(100ml)稀释该混合物并用盐水洗涤该有机提取液，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发滤液至干。使该残余物进行硅胶层析[在二氯甲烷中的丙酮(15-25％)]得到0.30g(41％)标题化合物(为一种白色固体)和0.14g(19％)4-氨基-5-氧代-1-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶(一种白色固体)。类似地，制备以下化合物：由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体；由4-氨基-5-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶和1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖制备4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶，为一种白色的固体。
制备4-氨基-5-氧代-8-(4-C-羟基甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶
在25℃下，在一个密封的烧瓶中搅拌4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-苯甲酰氧基甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶(0.82g，1.1mmol)的甲醇氨(在0℃饱和)溶液15小时。蒸发溶剂，并使该残余物进行硅胶层析[在二氯甲烷中的甲醇(30％)]得到0.36g(41％)标题化合物，一种白色固体。类似地，制备以下化合物：从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(β-L-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶；从4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲酰基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(4-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶。
制备4-氨基-5-氧代-8-(5(R，S)-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶
将载于活性炭上的钯(10％Pd，200mg加入到4-氨基-5-氧代-8-(5-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶(0.14g，0.45mmol)的甲醇(50ml)溶液中。在2小时期间，在3psi的氢气下振摇该烧瓶，过滤催化剂并用甲醇洗涤。蒸发该溶剂，并使该残余物进行硅胶层析[在二氯甲烷中的甲醇(10％)]得到0.12g标题化合物，为一种白色固体。类似地，制备以下化合物：从4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶制备4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶。
制备4-氨基-5-氧代-8-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶
在室温下搅拌4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶(1.8g，6.20mmol)和1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷(2.15ml，6.73mmol)在无水吡啶(25ml)中的反应混合物20小时并用冰冷却。加入水(0.5ml)，并在环境温度下搅拌该混合物30分钟并浓缩。将该残余物溶解于乙酸乙酯中，用稀的碳酸氢钠洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。在硅胶上层析(EtOAc-己烷3∶2)得到2.0g的4-氨基-5-氧代-8-[3，5-O-(1，1，3，3-四异丙基二甲硅烷氧基)-β-D-呋喃核糖基]吡啶并[2，3-d]嘧啶。
向4-氨基-5-氧代-8-[3，5-O-(1，1，3，3-四异丙基二甲硅烷氧基)-β-D-呋喃核糖基]吡啶并[2，3-d]嘧啶(650mg，1.21mmol)和DMAP(295mg，2.42mmol)的乙腈(10ml)溶液中加入氯硫代甲酸苯酯(185ml，1.33mmol)。在室温下搅拌该混合物2小时并浓缩至干。将该残余物溶解于氯仿中，用水洗涤，干燥(硫酸钠)并浓缩。在真空下干燥该残余物30分钟，然后溶解于甲苯(10ml)中。加入1，1′-偶氮二(环己腈)(74mg，0.30mmol)，向产生的溶液中鼓泡通入氩气30分钟。加入三(三甲基甲硅烷基)硅烷(0.56ml，1.82mmol)并在80℃搅拌该产生的混合物2小时，然后在105℃过夜。蒸发溶剂并将残余物溶解于THF(5ml)中。加入TBAF(在THF中1.0M，2.5ml)，在室温下放置该产生的溶液2小时并浓缩。在硅胶上层析(在二氯甲烷中的10％MeOH)得到240mg的标题化合物。
体外/体内实验
除非另外说明，用4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶进行以下实验。
测定EC50
用各种浓度的4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶孵育癌细胞至少24小时并测定EC50。表1给出4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶在nM浓度时的体外活性。肿瘤类型细胞系 EC50[nM]乳腺MCF7，NCI/ADR-RES，MDA-MB-435，BT-549，T-47D 18前列腺PC-3，DU-145 19肾786-0，A498，ACHN，CAKI-1，RXF393，UO-31 44卵巢IGROV1，OVCAR-3，OVCAR-4，OVCAR-5，SK-OV-3 21黑素瘤LOX IM VI，MALME-3M，M14，SK-MEL-2，SK-MEL-28，ACC-257，UACC-62 30 CNSSF-268，SF-295，SF-593，SNB-19，SNB-75，U251 125结肠SW-620，KM12，HT29，HCT-15，CHCT-116，HCC-2998，COLO-205 16肺NCI-H522，NCI-H460，NCI-H322M，NCI-H23，HOP-92，HOP-62，EKVX，A549 68白血病SR，RPMI 8226，MOLT-4，K-562，HL-60，CCRF-CEM 34肝PLC/PRF5，Hep3B，Huh7 288胰腺PaCa-2，PANC-1 188
设计的化合物，尤其是4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶的较高功效在一系列的实验中得到进一步的反映，在所述实验中与商业上可获得的细胞抑制剂比较了对各种癌细胞系的细胞毒性和增殖的抑制。实验结果显示于图1和2中。
设计的化合物的抗-促克隆发生(clonogenic)的活性
为了测定设计的化合物在各种癌细胞中的抗-促克隆形成的活性而进行了实验。这些实验的结果显示于图3，清楚地指出设计的化合物呈现显著的抗-促克隆形成活性，尤其是在黑素瘤B16和140细胞、白血病细胞(K562，M)，和结肠HT-29细胞中。再有，使用4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶作为代表性的设计的化合物并与Ecyd和Gemzar进行比较。
诱导编程性细胞死亡
为了测定设计的化合物怎样与癌细胞相互作用，将NB4细胞(白血病的)和前列腺81(前列腺癌细胞)细胞与4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶、Ecyd和Gemzar一起孵育，并通过组蛋白-DNA ELISA监测编程性细胞死亡。该结果显示于图4A和4B中，并且提示设计的化合物以剂量依赖方式诱导编程性细胞死亡。
抑制RNA合成
在K562细胞中用H3-尿苷结合以下描述的普通方案监测RNA合成。图5显示示例性的设计的化合物(此处由4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶代表)在各时间段和各种浓度下对RNA合成的抑制。
抑制RNA聚合酶I、II和III
为了进一步研究设计的化合物(此处也由4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶代表)对取决于RNA聚合酶I、II和III的RNA合成的影响，而进行了实验。这些实验的结果示于图6和7中，并且该结果提示设计的化合物可以抑制28S和18S rRNA的加工，可是，不能显著抑制RNA聚合酶III。该实验进一步表明设计的化合物以浓度依赖方式抑制依赖于RNA聚合酶II的RNA合成。
MEK-ERK磷酸化
最近已经证明[Wang等，JBC275：39435-43(2000)；Pavlovic等，Eur.Cytokine Netw 2：267-74(2000)]可以通过MEK-ERK信号转导途径诱导编程性细胞死亡。为了研究通过设计的化合物激活MEK-ERK信号转导途径的可能性，进行了一个实验。图8为一个放射自显影图，显示了由设计的化合物(由4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶并[2，3-d]嘧啶代表)在NB4白血病细胞中引起的MEK和ERK的磷酸化作用，但是没有Raf的磷酸化作用。这个实验和其它的实验提示设计的化合物提高MEK的磷酸化作用(这与Ecyd和Gemzar形成对比)，可是，它们没有提高Raf的磷酸化作用。因此，预期按照本发明主题的化合物可以通过激活MEK诱导编程性细胞死亡(它可以通过MEK-ERK途径的抑制剂而阻止)。
设计的化合物的代谢物
许多实验(未显示数据)提示设计的化合物在(肿瘤)细胞内磷酸化，并且该产物包括单、双和三磷酸化的形式(如通过LC-MS检测)。进一步预测所述代谢物可具有显著的(或甚至增加的)生物活性。
因此，已经公开了吡啶并[2，3-d]嘧啶和嘧啶并[4，5-d]嘧啶核苷的具体实施方案和中请。可是，显而易见，对于本领域的技术人员而言，除了那些已经描述的修饰之外，还可能有更多的修饰而不违背本发明的概念。因此，本发明的主题除了所附的权利要求之外不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有的术语应该用与上下文一致的最广泛的可能方式进行解释。具体地说，术语“包扩”和“包含”应该解释为指元素、成分或在一种非唯一的方式中的步骤，表明所涉及的元素、成分或步骤可以存在或利用，或与其它没有特别提及的元素、成分或步骤联合。