调控番茄抗逆性的转录因子及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是来源于陆地番茄的转录因子及其编码基因与应用。背景技术
病原、干旱、盐碱、低温、冻害、水涝等生物与非生物环境胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响。干旱脱水导致细胞内水分含量以及行为模式发生改变，高盐造成细胞内的渗透胁迫使离子浓度发生改变，低温冻害产生冰晶使细胞受到伤害。提高作物的耐逆性，除了利用传统的育种方法，分子遗传育种已经成为目前科技工作者所关注的领域之一。在逆境胁迫环境下，植物体内通常会发生一系列的生理生化变化。植物先是通过多种途径感受外界环境的变化，并将细胞外的信号转移到细胞内部，经过一系列磷酸化级链式反应将信号传递给转录因子，转录因子再通过其特异性功能氨基酸与目的基因相互作用，启动对逆境胁迫产生应答的目的基因表达，从而提高植物地抗性。已经证实，DREB类某些转录子能接受环境胁迫信号并启动逆境应答基因，提高植物的耐逆性。在植物中，AP2/EREBP功能保守域是DREB类转录因子的特异性结构。
番茄作为一种重要的食用蔬菜植物，弄清其抗病抗逆机理，进而改善其抗病性及耐逆性，具有重要的理论及现实意义。发明内容
本发明的目的是提供具有较强抗逆特性的来源于番茄的转录因子及其编码基因。
本发明所提供的抗逆转录因子名称为LeDREB1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由300个氨基酸残基组成的蛋白质。所述序列2中自氮端到碳端第81-138个氨基酸残基保守结构域是转录因子LeDREB1的AP2/EREBP功能保守域。
抗逆转录因子LeDREB1的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列；
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1782个碱基组成，该基因的读码框为自3’端第108到第1007位碱基，其表达主要受干旱、低温、高盐以及外来脱落酸、乙烯的诱导。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，如pBIN19以及由其衍生而来的pBI101，pBI121和pBI221系列载体(Bevan，1984核酸研究，12：8711-8721)，将本发明所提供的编码转录因子LeDREB1的基因导入植物细胞，可获得对干旱、低温和高盐胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。表达载体pBI121-LeDREB1是利用常规分子生物学手段构建的带有本发明LeDREB1 cDNA的表达载体，它的基因图谱如图1所示。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)以及Ubiquitin启动子等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明LiDREB1基因的表达载体可通过使用Ti(Tumor-induced-癌诱导)质粒、Ri(Root-induced-根诱导)质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种，提高农作物产量具有重要意义。附图说明
图1为LeDREB1表达载体的构建。
图2为LeDREB1基因在大肠杆菌中的体外表达。
图3为Southern杂交分析结果。
图4为不同胁迫条件下Northern杂交检测的LeDREB1基因表达特征。具体实施方式
实施例1、番茄LeDREB1转录因子cDNA的克隆与序列分析
生长10天的番茄幼苗经水洗净后在室温下进行处理。干旱处理是将幼苗置于足够厚度的滤纸上脱水5小时，收集植株于装有液氮的研钵中研磨至精细程度、置于4mol/L异硫氰酸胍中，再用酸性苯酚/氯仿抽提混合物，取上清液，用异丙醇沉淀总RNA，再重复上述步骤一次，最后经75％的乙醇洗涤干燥后将RNA溶于DEPC水中，保存于-80℃(Davis等，分子生物学的基本方法：[Basic Methods in MolecularBiology]，pp.777，APPLETON & LANCE，Norwalk，Connecticut，USA，1994)。通过Promega Technical Manual-PloyATtractmRNA Isolat ion Systems(on the internetat www.promega.com)分离得到ploy(A)+mRNA，经过凝胶回收验证分析，然后通过EcoRI和XhoI两个adaptors将目的mRNA连接到表达载体pB42AD相应的多克隆位点，并转化到大肠杆菌中扩增，所有程序均按说明书中的要求进行。扩增后的文库滴度检测与PCR分析表明，该文库均达到要求。利用酵母单杂交系统筛选番茄幼苗cDNA表达文库分离出一个cDNA克隆，命名为LeDREB1。该基因插入片段为1782bp(序列表中的序列1)，含有900bp的开放阅读框架(108起始-1008终止)，编码300个氨基酸组成的多肽(序列表中的序列2)，在氨基端和羧基端分别含有一个富含碱性氨基酸的核信号定位保守氨基酸序列和一个富含酸性氨基酸的激活域保守氨基酸序列，其5’端为107bp，3’端为765bp。
实施例2、用于转化的融合表达载体的构建。
LeDREB1 cDNA表达载体的构建按常规分子生物学手段进行。将LeDREB1编码区域插入在一个35S启动子后面，包装于含有TMV翻译增强子的pBI121双元表达载体上，得到一个融合表达载体pBI121-LeDREB1，其图谱如图1所示，经酶切鉴定插入片段无误后，转化于农杆菌，再提取质粒经酶切确认成功转化于农杆菌中，该复合体可直接通过转基因技术用于植物，特别是番茄的转化。
实施例3、番茄LeDREB1基因在大场杆菌中的体外表达鉴定
利用一对特异性引物：LeDREB1F：204 5’-AAAAGAATTCGTGGAAGAGACACTA-3’218和LeDREB1R：740 5’-AAAACTCGAGACAATCCCATCCAG-3’727，通过PCR扩增得到一个包含AP2/EREBP结构域的cDNA片段(Size-536bp)，并将该cDNA片段插入到蛋白表达载体pGEX-4T-1中相对应的EcoRI和XhoI位点上，然后转化于大肠杆菌中，经IPTG在大肠杆菌中诱导，SDS-PAGE检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达。而未经诱导的菌株却没有蛋白表达带出现。聚丙烯凝胶电泳谱带如图2所示，图中，M是Marker；1、3是经诱导的菌株；2是未经诱导的菌株。从图中可以看出，经诱导的菌株有蛋白条带出现，未经诱导的菌株没有蛋白条带出现。
实施例4、LeDREB1基因在番茄基因组中的分析。
利用LeDREB1 cDNA作为探针，与经不同限制性内切酶(E-EcoRI，V-EcorV，P-PstI以及X-XhoI)消化后的番茄基因组DNA在65℃条件下进行杂交，并在高严谨度下洗膜(高严谨度的条件是：0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，结果如图3所示，除EcoRI消化基因组DNA呈现微弱两条杂交带外，其它均只出现一条杂交带，表明LeDREB1基因在番茄基因组中是一个单拷贝基因，或者存在着低拷贝的LeDREB1同源体。
实施例5、番茄LeDREB1基因在逆境胁迫条件下的表达特征。
将生长2个星期的番茄幼苗分别置于4℃水、250mM NaCl的水溶液以及100μM脱落酸(ABA)溶液中进行光照培养，干旱处理是将生长2个星期的番茄幼苗经水洗净后置于足以吸干水分的滤纸上在室温下脱水，并分别在1小时、3小时、5小时、7小时、9小时、12小时以及24小时取样，提取总RNA并利用实施例3中的引物进行定量(1μgRNA)RT-PCR扩增目的片段，然后转移到尼龙膜与LeDREB1 cDNA探针进行Northe rn杂交分析，并在高严谨度下洗膜。完全相同的步骤用于LeUbi3分析(LeUbi3：一种番茄中存在的泛蛋白基因)。所用引物为：LeUbi.3Fd-1463 5’-GTGAAAGCCAAGATCCAG GAC-3’1484，LeUbi.3Re-1857 5’-CAATCGCCAGCCTCCTTGTTG-3’1878(394bp)(Hoffman et al，1991，Ubi3：accession number-X58253)，LeUbi3用做外部对照。与LeDREB1 cDNA探针进行Northern杂交分析。结果如图4所示，其中A是干旱处理的结果，B是4℃低温处理的结果，C是250mM NaCl处理的结果，D是脱落酸处理的结果，从图中的结果可以看出，LeDREB1的转录主要受低温和脱落酸ABA诱导，并受盐以及干旱瞬时诱导表达。
序列表<160>2<210>1<211>1782<212>DNA<213>番茄属陆地番茄(Lycopersicon esculentum L.)<400>1ctctacaagc tttttgttaa gagactaaaa aaaacaaaaa aaccttgaag aactcaccaa 60tttgatcaat tcatttatta aaaaaaaaaa cagagaagaa aagagaaatg gctattatgg 120atgaagctgc taatatggtt tgtgtgccgt tggattatag tagaaagagg aaatcaagga 180gtagaaggga cagaacaaaa aatgtggaag agacactagc taaatggaag gagtataatg 240agaaactaga caatgaaggg aaagggaagc cagtgcgtaa agttcctgct aaaggttcaa 300agaaggggtg tatgagaggt aaagggggac cagaaaattg gcggtgtaaa tacagaggtg 360ttagacagag gatatggggt aaatgggttg ctgagattag ggaacctaaa agaggtagta 420ggttatggtt gggtacattt ggtacagcaa ttgaagctgc tttagcatat gatgatgctg 480caagagctat gtatggtcct tgtgcaaggc ttaatttgcc aaattacgcg tgtgattctg 540tttcctgggc aactacatct gcatctgcat ctgcatctga ttgcaccgtt gcttctggtt 600tcggcgaggt atgtccggtt gatggtgctc ttcatgaagc tgacacacca ttgagctcag 660tgaaagacga agggaccgcg atggatattg ttgaacctac gagtattgat gaagatacgc 720ttaagtctgg atgggattgt ctagataaat taaatatgga tgagatgttt gatgtagatg 780agctattggc tatgttagat tctactccag ttttcaccaa ggactacaat tcagatggaa 840agcacaacaa tatggtatca gattcgcaat gtcaggagcc gaatgcagtg gtagatccta 900tgactgttga ctatggcttt gattttctga aaccaggcag gcaagaagat cttaatttca 960gttcggatga ccttgcattc atagacttgg attctgaact tgtcgtttga tagttttcgc 1020agttgaaaga tgcaatgcaa gataacatgt atcgtcattg attgagatat aggacgcgag 1080gaagagaaaa ctcgagatgt tgagtttgga caatgttttc gtatcgttca attttttttt 1140atttcatgtt gggcagcatt ggttgccctt ttcccaggcc agctgattct cgataagttt 1200ttgcatcgaa gattatgcat ttggtgttct ggaggactaa tcttgtacag atctaaccgg 1260cctagtgagt caataattgt tcgttttggt gtgttgatat gacgaataaa gatgtttctg 1320ggattcatag tttgttgtaa agtttgcttg acaattagag gtactgattt ttgtgctttc 1380attggaacaa tgtagaatgc attgacggca tttacagttc attcataact tgaacaataa 1440gtttggcagt gtgtatttgt gttactttgt gaagtattcc caggggattc gccaacgaat 1500gctgtgttgt gtgttcaagt gtttcgagta gatcagagaa gtactggaag cagtggtgct 1560atagtgtttt atgttagccc tcatcgtggt ttggtagatt tgtgtagttc tgttttgcac 1620ttaggctttt ttatctctat cagaagttgt actcaggatg taatagtaga cgttttgaga 1680cgtttcaaaa tgttccagtt catgttcttt accacattgt aattcaataa attctgcggt 1740aatcttaaga tgtggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1782<210>2<211>300<212>PRT<213>番茄属陆地番茄(Lycopersicon esculentum L.)<400>2Met Ala Ile Met Asp Glu Ala Ala Asn Met Val Cys Val Pro Leu
5 10 15Asp Tyr Ser Arg Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Arg Asp Arg Thr
20 25 30Lys Asn Val Glu Glu Thr Leu Ala Lys Trp Lys Glu Tyr Asn Glu
35 40 45Lys Leu Asp Asn Glu Gly Lys Gly Lys Pro Val Arg Lys Val Pro
50 55 60Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Arg Gly Lys Gly Gly Pro
65 70 75Glu Asn Trp Arg Cys Lys Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp
80 85 90Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Lys Arg Gly Ser Arg
95 100 105Leu Trp Leu Gly Thr Phe Gly Thr Ala Ile Glu Ala Ala Leu Ala
110 115 120Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Pro Cys Ala Arg Leu
125 130 135Asn Leu Pro Asn Tyr Ala Cys Asp Ser Val Ser Trp Ala Thr Thr
140 145 150Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Asp Cys Thr Val Ala Ser Gly Phe
155 160 165Gly Glu Val Cys Pro Val Asp Gly Ala Leu His Glu Ala Asp Thr
170 175 180Pro Leu Ser Ser Val Lys Asp Glu Gly Thr Ala Met Asp Ile Val
185 190 195Glu Pro Thr Ser Ile Asp Glu Asp Thr Leu Lys Ser Gly Trp Asp
200 205 210Cys Leu Asp Lys Leu Asn Met Asp Glu Met Phe Asp Val Asp Glu
215 220 225Leu Leu Ala Met Leu Asp Ser Thr Pro Val Phe Thr Lys Asp Tyr
230 235 240Asn Ser Asp Gly Lys His Asn Asn Met Val Ser Asp Ser Gln Cys
245 250 255Gln Glu Pro Asn Ala Val Val Asp Pro Met Thr Val Asp Tyr Gly
260 265 270Phe Asp Phe Leu Lys Pro Gly Arg Gln Glu Asp Leu Asn Phe Ser
275 280 285Ser Asp Asp Leu Ala Phe Ile Asp Leu Asp Ser Glu Leu Val Val
290 295 300