从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法 技术领域
本发明涉及一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法。
背景技术
茶叶是我国重要经济作物和出口创汇产品之一，2000年创汇达4.0亿美元，但长期以来，我国茶叶生产仍以传统的粗加工产品为主，近年来传统茶叶产品供过于求，每年有10万吨左右的低档茶积压，严重阻碍了我国茶产业的发展。
茶叶深加工是茶产业的新领域，有着巨大的增值潜力和市场潜力。随着茶叶研究的不断深入以及和医学研究的交叉和渗透，已经证实茶多糖具有降血糖、增强免疫力、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗血栓等保健功能；茶多酚具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗突变和增强免疫、降血脂等保健功能；茶氨酸具有促进大脑功能与神经的生长、增加肠道有益菌群、降压安神、改善睡眠等保健功能。上述茶叶中的功能成分，因其良好的保健功能和资源优势而越来越被重视。
目前国内有关茶多糖提取纯化方法的专利有CN1344748A、CN1379044A、CN1431226A、CN1176748A。上述四项专利都是采用水或有机溶剂浸泡法提取茶叶中的茶多糖，存在难以同时提出四种功能成分或溶剂用量大、提取时间长、提取率低、有效成份损失大等缺点。
上述专利中涉及茶多糖纯化方面的专利有CN1379044A，该方法是采用水提取、超滤精制的方法生产茶多糖。但该方法仅开发利用了茶叶中一种成分茶多糖，无法充分利用茶叶中其它的有效成分，如茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等，造成了资源的浪费，降低了茶叶深加工的经济效益。
目前国内有关从茶叶中提取分离咖啡碱和茶多酚的专利比较多，但提取分离茶氨酸的专利还没有，如何充分有效地利用茶叶中地有效成分，提高茶叶深加工的经济效益，已经成为急待解决的问题。
针对以上缺点，本发明提出了在微波强化的作用下，一次性从茶叶粉末中提取四种功能成分，采用凝胶柱层析法精制分离高纯度茶多糖、氯仿萃取法分离咖啡碱、乙酸乙酯萃取法分离茶多酚、732阳离子树脂交换法提取茶氨酸的工艺方法，以提高茶叶提取深加工的经济效益。
发明内容
本发明目的是提供一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法。如附图1所示，工艺的步骤如下：
1)茶叶粉末中加入5-20倍的水或有机溶剂水溶液，在微波作用下，20℃-60℃温度范围内，多次重复浸泡提取，每次5-60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加茶多糖沉淀剂，经过滤可得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，利用盐析法除去蛋白，经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖。
2)多糖提取后余液，用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取2-4次，合并氯仿萃余相，然后萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为萃余相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取相并干燥可得到茶多酚。
3)乙酸乙酯萃余相，调整pH值为1-5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1-3BV酸水洗柱后，用氨水洗脱，收集所需部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3-1/2，降温、结晶、干燥可得到茶氨酸。
4)合并收集的氯仿萃取相，经结晶、干燥可得到咖啡碱。
本发明的优点：1)将微波强化作用应用到茶叶有效成分的提取中，存在提取时间短、提取率高、活性物质损失少等优点；2)一次性提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等四种成分；3)将凝胶柱层析应用到茶多糖的精制工艺中，存在分离效果好、茶多糖含量高、不损伤茶多糖的原有结构与活性；4)得到的茶多糖产品，总糖含量≥65.00％，得率≥0.5％；咖啡碱的纯度≥95％，得率≥1.0％；茶多酚的纯度≥80％，得率≥5％；茶氨酸的纯度≥50％。
具体实施方式
如附图1所示，总的工艺流程如下：
1)茶叶粉末中加入5-20倍的水或有机溶剂水溶液，在微波作用下，20℃-60℃温度范围内，多次重复浸泡提取，每次5-60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加茶多糖沉淀剂，经过滤可得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，利用盐析法除去蛋白，经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖。
2)多糖提取后余液，用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取2-4次，合并氯仿萃余相，然后萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为萃余相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取相并干燥可得到茶多酚。
3)乙酸乙酯萃余相，调整pH值为1-5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1-3BV酸水洗柱后，用氨水洗脱，收集所需部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3-1/2，降温、结晶、干燥可得到茶氨酸。
4)合并收集的氯仿萃取相，经结晶、干燥可得到咖啡碱。
在本发明中，所述的茶叶经粉碎为粉末为好，如粉碎到1-100目。
在本发明中，所述的提取中，在茶叶或滤渣中加入水或有机溶剂中，固液重量比为1∶5-20，置于微波作用下，在20℃-60℃温度范围内多次重复提取，每次5-60分钟，滤除残渣，合并滤出液；
在本发明中，所述的茶多糖沉淀剂可以是低分子的醇、酮或壳聚糖。从经济与安全考虑，采用乙醇为适，用量为液体的体积1-5倍。
在本发明中，所述的水建议用去离子水。
在本发明中，所述的蛋白质盐析剂，可以是醋酸锌、硫酸锌、硫酸钠、氯化钠、柠檬酸钠。
在本发明中，经过除蛋白质后的提取液，采用凝胶柱层析精制分离得到茶多糖。所述的凝胶是交联葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，交联葡聚糖凝胶包括Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75，聚丙烯酰胺凝胶包括Bio-Gel P-4、Bio-Gel P-6、Bio-Gel P-10、Bio-Gel P-30。推荐使用SephadexG-25。
在本发明中，采用732阳离子交换精制茶氨酸，只收集高浓度茶氨酸部分的洗脱液，其余含有茶氨酸的洗脱液经浓缩后重新过732阳离子交换柱，以提高茶氨酸的得率。
在本发明中，需要对茶氨酸浓缩液进行降温结晶，一般置于-10℃下过夜就可以析出茶氨酸，结晶后的液体可进行重结晶。
在本发明的方法中，所述的过滤、浓缩、干燥可以是离心分离、过滤分离、真空蒸馏、薄膜蒸馏、冷冻干燥、喷雾干燥。
实施例1
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用5倍的乙醇水溶液，60℃温度下重复浸泡提取4次，每次5分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加食用乙醇，用量为浓缩液体积的2倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌去除蛋白质，多糖溶液经凝胶G75柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到65.00％，得率为0.5％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取4次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的5倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为80％，得率为5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为1，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用3BV酸水洗柱后，用pH＝12的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到-10℃、结晶干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为50％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例2
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用10倍的30％乙醇水溶液，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次20分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加食用乙醇，用量为浓缩液体积的3倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌去除蛋白质，多糖溶液经凝胶G25柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到66.10％，得率为0.51％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的5倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到-10℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为55％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例3
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用15倍的10％乙醇水溶液，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次15分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加食用乙醇，用量为浓缩液体积的5倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌去除蛋白质，多糖溶液经凝胶Bio-Gel P-6柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到67％，得率为0.55％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的3倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用3BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/2，降温到-10℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为53％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为96％，得率为1.6％。
实施例4
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用20倍的去离子水，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次20分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加壳聚糖，用量为1.0％，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加2％硫酸锌除去蛋白，经凝胶Bio-Gel P-10柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到66.10％，得率为0.51％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的2倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为1，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到0℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为50％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例4
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用10倍的30％乙醇水溶液，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次20分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加95％的乙醇，用量为浓缩液体积的3倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌除去蛋白，多糖溶液经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到66.10％，得率为0.51％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的2倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为1，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到0℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为50％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例5
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用20倍的50％乙醇水溶液，20℃温度下重复浸泡提取3次，每次60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加100％的乙醇，用量为浓缩液体积的2倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％硫酸锌除去蛋白，多糖溶液经凝胶G25柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到670％，得率为0.57％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的2倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取4次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为85％，得率为5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用3BV酸水洗柱后，用pH＝12的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到-10℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为52％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。