三层包裹型铜团簇比率荧光探针及其制备方法和应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010112251.4 (22)申请日 2020.02.24 (71)申请人 安徽大学 地址 230000 安徽省合肥市蜀山区肥西路3 号 (72)发明人 杜袁鑫韩梦史宏宇 (74)专利代理机构 合肥中谷知识产权代理事务 所(普通合伙) 34146 代理人 洪玲 (51)Int.Cl. C09K 11/02(2006.01) C09K 11/58(2006.01) C09K 11/65(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 三层包裹型铜

2、团簇比率荧光探针及其制备 方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种三层包裹型铜团簇比率荧 光探针及其制备方法和应用， 所述比率荧光探针 包括内标、 二氧化硅和铜纳米团簇， 所述二氧化 硅包裹在内标的外部， 铜纳米团簇包裹在二氧化 硅的外部， 形成内标二氧化硅铜团簇三层包裹 结构。 与现有技术相比， 本发明的探针借助中间 层二氧化硅的保护作用， 提升了内标的稳定性， 使其荧光强度不易受外界干扰。 本发明探针在针 对毒品的荧光检测时， 选择性、 灵敏度、 准确性大 大提高。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 111394090 A 2020.07.10 CN 111394090 A 1.

3、一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针， 其特征在于， 包括内标、 二氧化硅和铜纳米团 簇， 所述二氧化硅包裹在内标的外部， 铜纳米团簇包裹在二氧化硅的外部， 形成内标二氧 化硅铜团簇三层包裹结构的比率荧光探针。 2.根据权利要求1所述的一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针， 其特征在于， 所述铜纳 米团簇通过静电吸引策略包裹在二氧化硅的外部。 3.根据权利要求1所述的一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针， 其特征在于， 所述内标 为碳点， 内部的碳点与外部的铜纳米团簇的发光颜色不同， 其中内部的碳点对毒品没有响 应， 利用外部的铜纳米团簇对待检测毒品的敏感性， 实现对毒品的检测。 4.一种如权利要求1-3

4、任一所述的三层包裹型铜团簇比率荧光探针的制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)制备内标和铜团簇， 并利用与待测毒品特异性结合的抗体对铜团簇进行表面修饰， 获得已修饰抗体的铜团簇； (2)取正硅酸乙酯， 在碱性条件下加入乙醇预水解， 加入步骤(1)的内标溶液， 制备获得 双层包裹结构的内标二氧化硅； (3)将内标二氧化硅与已修饰抗体的铜团簇混合， 制备三层包裹结构的内标二氧化 硅铜团簇， 获得所述比率荧光探针。 5.根据权利要求4所述的一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤(1)中： 内标为发蓝色荧光的碳点， 制备方法包括： 将L-脯氨酸加入超纯水中，

5、 于聚四氟乙烯不 锈钢高压釜中， 在180下反应； 反应结束后自然冷却至室温， 0.45 M微孔滤膜过滤去除大 颗粒和沉淀； 再用5000Da的透析袋透析， 得内标； 铜团簇为发射橙色荧光的铜纳米团簇， 制备方法包括： 将铜盐和含有羧基官能团的表 面配体在超纯水中混合， 用碱性物质调节pH至3-5， 获得混合液， 向混合液中加入不良溶剂， 然后离心， 得到沉淀进行真空干燥， 得铜团簇； 利用与待测毒品特异性结合的抗体对铜团簇进行表面修饰， 获得已修饰抗体的铜团簇 的方法包括： 将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠盐的 水溶液混合， 加入与待测毒品特异性结合的

6、单克隆抗体， 搅拌混匀， 获得备用抗体溶液； 将 铜团簇分散在水中， 获得铜团簇分散液； 将备用抗体溶液与铜团簇分散液混合， 在37下孵 化， 完成铜团簇表面抗体修饰。 6.根据权利要求4所述的一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤(3)中， 将内标二氧化硅与已修饰抗体的铜团簇混合， 同时在反应体系中加入 阳离子聚合物电解质， 通过静电吸引策略将铜团簇与二氧化硅连接在一起。 7.根据权利要求6所述的一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针的制备方法， 其特征在 于， 所述阳离子聚合物电解质选自聚二烯丙基二甲基氯化铵， 聚乙烯亚胺盐酸盐、 聚乙烯吡 啶、 聚乙烯胺中的一种

7、或多种混合物。 8.一种如权利要求1-3任一所述的三层包裹型铜团簇比率荧光探针在检测毒品中的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111394090 A 2 三层包裹型铜团簇比率荧光探针及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于毒品检测技术领域， 尤其涉及一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针及 其制备方法和应用。 背景技术 0002 目前， 在毒品检测领域， 常用的仪器类方法所面临的通病就是操作繁琐、 成本高、 费时费力等。 荧光光谱法检测毒品的优势是操作方便、 成本低、 简单快速、 直观等。 其中， 金 属纳米团簇具有尺寸小、 光稳定性好、 Stokes位移大、 制备条件温和以及无

8、毒无害等优点， 是一种非常有应用前景的荧光传感器。 例如中国专利文献(CN110609024A)公开了一种荧光 增强型双色可视化毒品检测探针及其制备方法， 其中公开了一种能够在单一激发光下发射 不同颜色荧光的两种铜纳米团簇， 通过设计荧光增强型检测模式， 利用该铜纳米团簇能够 实现可视化毒品检测， 具有信噪比高、 检测灵敏度高和可信度强的优点。 0003 然而目前在毒品检测领域中， 利用金属纳米团簇作为荧光探针的， 大多是将其作 为单色荧光传感器， 通过对单一荧光发射波长的强度变化进行测量来实现对目标物的检 测， 这种利用单一荧光信号检测的方法在实际应用过程中， 易受到外部环境的干扰以及肉 眼

9、对荧光颜色变化的观察不明显等问题。 而构建比率型荧光传感器有利于解决这些问题， 还可以提高选择性和灵敏性， 目前在荧光检测领域已逐渐引起了关注。 0004 比率荧光传感器一般情况下由两个及两个以上的不同发射波长的荧光传感器构 成， 当目标检测物加入时， 往往会引起其中一个荧光传感器的荧光强度发生强烈改变， 而对 另一个荧光传感器无明显作用(这个荧光传感器的强度可以作为内标)， 因此根据两个荧光 强度的比值来实现对目标物的检测， 这样的好处不仅提升了选择性、 灵敏性， 并且有利于排 除其它因素的干扰而提高检测的准确度。 0005 目前关于比率荧光传感器的构建是将两种不同发光特性的荧光物质简单混合

10、制 备出来的， 这些传感器的问题还是内标的荧光强度容易受到外界干扰， 导致检测的准确性 不够。 发明内容 0006 本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种三层包裹型铜团簇比率荧光 探针及其制备方法和应用。 0007 本发明通过以下技术方案来实现上述目的： 0008 本发明提供了一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针， 包括内标、 二氧化硅和铜纳 米团簇， 所述二氧化硅包裹在内标的外部， 铜纳米团簇包裹在二氧化硅的外部， 形成内标 二氧化硅铜团簇三层包裹结构的比率荧光探针。 0009 作为本发明进一步的优化方案， 所述铜纳米团簇通过静电吸引策略包裹在二氧化 硅的外部。 0010 作为本发明进一步

11、的优化方案， 所述内标为碳点， 内部的碳点与外部的铜纳米团 说明书 1/5 页 3 CN 111394090 A 3 簇的发光颜色不同， 其中内部的碳点对毒品没有响应， 利用外部的铜纳米团簇对待检测毒 品的敏感性， 实现对毒品的检测。 0011 本发明还提供了上述三层包裹型铜团簇比率荧光探针的制备方法， 包括以下步 骤： 0012 (1)制备内标和铜团簇， 并利用与待测毒品特异性结合的抗体对铜团簇进行表面 修饰， 获得已修饰抗体的铜团簇； 0013 (2)取正硅酸乙酯， 在碱性条件下加入乙醇预水解， 加入步骤(1)的内标溶液， 制备 获得双层包裹结构的内标二氧化硅； 0014 (4)将内标二氧

12、化硅与已修饰抗体的铜团簇混合， 制备三层包裹结构的内标二 氧化硅铜团簇， 获得所述比率荧光探针。 0015 作为本发明进一步的优化方案， 所述步骤(1)中： 0016 内标为一种发蓝色荧光的碳点， 但不限于此， 其制备方法包括： 将L-脯氨酸加入超 纯水中， 于聚四氟乙烯不锈钢高压釜中， 在180下反应； 反应结束后自然冷却至室温， 0.45 M微孔滤膜过滤去除大颗粒和沉淀； 再用5000Da的透析袋透析， 得内标； 0017 铜团簇为一种发射橙色荧光的铜纳米团簇， 但不限于此， 其制备方法包括： 将铜盐 和含有羧基官能团的表面配体在超纯水中混合， 用碱性物质调节pH至3-5， 获得混合液，

13、向 混合液中加入不良溶剂， 然后离心， 得到沉淀进行真空干燥， 得铜团簇； 0018 利用与待测毒品特异性结合的抗体对铜团簇进行表面修饰， 获得已修饰抗体的铜 团簇的方法包括： 将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠 盐的水溶液混合， 加入与待测毒品特异性结合的单克隆抗体， 搅拌混匀， 获得备用抗体溶 液； 将铜团簇分散在水中， 获得铜团簇分散液； 将备用抗体溶液与铜团簇分散液混合， 在37 下孵化， 完成铜团簇表面抗体修饰。 0019 作为本发明进一步的优化方案， 所述步骤(3)中， 将内标二氧化硅与已修饰抗体 的铜团簇混合， 同时在反应体系中加入阳离子聚合

14、物电解质， 使铜团簇表面修饰带正电的 聚合物电解质， 由于二氧化硅表面一般带负电， 两者混合后， 通过静电吸引策略便可将铜团 簇与二氧化硅连接在一起。 0020 作为本发明进一步的优化方案， 所述阳离子聚合物电解质选自聚二烯丙基二甲基 氯化铵， 聚乙烯亚胺盐酸盐、 聚乙烯吡啶、 聚乙烯胺中的一种或多种混合物， 但不限于此。 0021 本发明还提供了上述三层包裹型铜团簇比率荧光探针在检测毒品中的应用。 0022 本发明的有益效果在于： 0023 1)本发明的荧光材料(碳点、 铜团簇、 二氧化硅)价格低廉， 来源丰富； 0024 2)本发明的探针针对毒品的荧光检测时， 相比单一荧光传感模式， 准确

15、度更高， 不 易受干扰， 而且内部的内标本身的稳定性也好， 加之中间层二氧化硅的保护作用， 使得其荧 光强度更稳定， 不易受外界干扰， 这使得整个复合探针的选择性、 灵敏度、 准确性大大提高； 0025 3)本发明利用静电吸引策略， 将二氧化硅中间层与团簇连接， 有效避免因共价键 连接方式导致团簇的荧光性能发射改变， 还能防止因聚集导致的荧光强度下降； 0026 4)本发明还可以通过改变铜纳米团簇的配体， 获得不同荧光发射性能的探针。 说明书 2/5 页 4 CN 111394090 A 4 附图说明 0027 图1为本发明比率荧光探针对氯胺酮的荧光响应图； 0028 图2为本发明比率荧光探针

16、对氯胺酮含量的线性关系图； 0029 图3为铜纳米团簇作为单色荧光探针时对氯胺酮的荧光响应图； 0030 图4为铜纳米团簇作为单色荧光探针时对氯胺酮含量的线性关系图； 0031 图5为无包裹结构的比率荧光探针对氯胺酮的荧光响应图； 0032 图6为无包裹结构的比率荧光探针对氯胺酮含量的线性关系图； 0033 图7为非静电吸引的三层包裹型比率荧光探针对氯胺酮的荧光响应图； 0034 图8为非静电吸引的三层包裹型比率荧光探针对氯胺酮含量的线性关系图。 具体实施方式 0035 实施例1 0036 本实施例提供了一种三层包裹型铜团簇比率荧光探针， 该荧光探针是由中心的碳 点作为内标， 在碳点外包裹二氧

17、化硅作为中间层， 再利用静电吸引策略， 在二氧化硅中间层 外包裹铜团簇， 获得碳点二氧化硅铜团簇三层包裹结构的比率荧光探针。 下面结合具体 实施例对该比率荧光探针的制备方法进行详细阐述， 有必要在此指出的是， 以下具体实施 方式只用于对本申请进行进一步的说明， 不能理解为对本申请保护范围的限制， 该领域的 技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。 0037 1、 材料 0038 本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法， 所用 的试剂等材料， 如无特别说明， 均为市售购买产品。 0039 2、 方法 0040 (1)制备碳点、 铜团簇， 并对铜团

18、簇进行抗体表面修饰 0041 碳点的制备： 碳点的制备目前已有很多报道， 本实施例选择的是一种发蓝色荧光 的碳点， 具体方法为： 取25ml含有1.2g的L-脯氨酸的超纯水溶液， 于聚四氟乙烯不锈钢高压 釜中， 在180下， 反应4h。 反应结束后， 溶液自然冷却至室温， 用0.45uM微孔滤膜对溶液进 行过滤去除较大颗粒和沉淀。 再用5000Da的透析袋进行透析6h， 所得溶液作为碳点， 于4 冰箱储存待用。 0042 铜团簇的制备： 本实施例选择的是一种能够在365nm激发光下发射出中心波长为 600nm的橙色荧光的铜纳米团簇， 具体方法为： 将200-500mmol铜盐和1-25mol含

19、有羧基官能 团的表面配体在6-16mL超纯水中混合， 用碱性物质调节pH至3-5， 获得混合液； 按照混合液 与不良溶剂的体积比为1:25-95， 向混合液中加入不良溶剂， 然后离心， 所得沉淀真空干燥 后， 即获得发射橙色荧光的铜纳米团簇粉末。 0043 备用抗体溶液的制备： 将浓度为0.9-3.8mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐和浓度为1.1-4.3mg/L的N-羟基琥珀酰亚胺钠盐的水溶液， 按体积比1:1进行混 合， 之后根据待检测毒品的种类， 加入待测毒品特异性结合的单克隆抗体， 在37下持续搅 拌0.5-2小时， 获得备用抗体溶液。 在所述备用抗体溶液中抗

20、体浓度范围在50-200 M。 0044 铜团簇表面修饰抗体： 将铜团簇分散在水中， 获得浓度为0.95-3.8mg/mL的分散 液， 然后在备用抗体溶液中按体积比1:1-5加入发射橙色荧光的铜纳米团簇的分散液， 再在 说明书 3/5 页 5 CN 111394090 A 5 37下孵化3-6小时， 即完成铜纳米团簇表面抗体的修饰， 获得修饰后橙光铜纳米团簇的分 散液。 0045 (2)碳点二氧化硅的制备 0046 取50-150ul的质量浓度为25氨水(或其他碱性物质如NaOH代替)、 800ul的超纯 水、 100ul-1000ul TEOS、 8.7ml乙醇， 混合预水解30min， 加

21、入100ul上述碳点， 室温下反应 12-48h。 离心收集产物， 分别用乙醇、 水洗涤， 获得碳点二氧化硅， 将碳点二氧化硅分散在 2ml超纯水中待用。 TEOS的量范围为100ul-1000ul， 与碳点的反应时间为12-48h， 可通过调 节TEOS的量范围及其与碳点的反应时间调节包裹二氧化硅的厚度。 0047 (3)碳点二氧化硅铜团簇的制备 0048 上述碳点二氧化硅取2ml， 加入1mg已修饰抗体的铜团簇， 0.5-3mg阳离子聚合物 电解质， 500转/分钟的情况下， 搅拌反应30min。 其中阳离子聚合物电解质选自聚二烯丙基 二甲基氯化铵、 聚乙烯亚胺盐酸盐、 聚乙烯吡啶、 聚乙

22、烯胺等。 0049 实施例2 0050 本实施例提供了一种用于检测氯胺酮的三层包裹型铜团簇比率荧光探针的制备 方法， 步骤包括： 0051 (1)制备碳点、 铜团簇， 并对铜团簇进行抗体表面修饰 0052 发蓝色荧光的碳点的制备方法， 包括： 取25ml含有1.2g的L-脯氨酸的超纯水溶液， 于聚四氟乙烯不锈钢高压釜中， 在180下， 反应4h。 反应结束后， 溶液自然冷却至室温， 用 0.45uM微孔滤膜对溶液进行过滤去除较大颗粒和沉淀。 再用5000Da的透析袋进行透析6h， 所得溶液作为碳点， 于4冰箱储存待用。 0053 橙色荧光的铜纳米团簇的制备方法： 将360mmol硝酸铜和9mo

23、l谷胱甘肽在8mL超纯 水中混合， 用1.5mol/L的氢氧化钠调节pH至4， 获得混合液； 按照混合液与不良溶剂的体积 比为1:60， 向混合液中加入乙醇， 然后离心， 所得沉淀真空干燥后， 即获得发射橙色荧光的 铜纳米团簇粉末。 0054 备用抗体溶液的制备： 将浓度为1.9mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐和浓度为2.15mg/L的N-羟基琥珀酰亚胺钠盐的水溶液， 按体积比1:1进行混合， 之后 加入氯胺酮单克隆抗体， 在37下持续搅拌1小时， 获得氯胺酮抗体溶液； 在所述氯胺酮抗 体溶液中抗体浓度范围在100 M。 0055 铜团簇表面修饰抗体： 将铜团簇分散

24、在水中， 获得浓度为2mg/mL的分散液， 在氯胺 酮抗体溶液中按体积比1:1加入铜团簇的分散液， 再在37下孵化4小时， 即完成铜纳米团 簇表面抗体的修饰， 获得修饰后橙光铜纳米团簇的分散液。 0056 (2)碳点二氧化硅的制备 0057 取100ul的氨水(质量浓度为25)、 800ul的超纯水、 300ul TEOS、 8.7ml乙醇预水 解30min， 加入100ul的上述碳点， 室温下反应24h。 离心收集产物， 分别用乙醇、 水洗涤， 分散 在2ml超纯水中待用。 0058 (3)碳点二氧化硅铜团簇的制备 0059 上述碳点二氧化硅取2ml， 加入1mg已修饰抗体的铜团簇， 1mg

25、 PDDA(20水溶液， Mw： 100000-200000g/mol)， 500转/分钟的情况下， 搅拌反应30min， 即获得所述三层包裹型 铜团簇比率荧光探针。 说明书 4/5 页 6 CN 111394090 A 6 0060 利用该比率荧光探针对氯胺酮进行检测： 在上述比率荧光探针中， 分别加入不同 浓度(0nM、 10nM、 20nM、 40nM、 60nM、 80nM)的氯胺酮溶液， 在365nm激发光下， 记录荧光发射光 谱， 对460nm和600nm处的荧光发射峰的强度进行数据记录， 以600nm处的荧光发射峰强度与 460nm处的荧光发射峰强度的比值作为纵坐标， 目标待测物

26、的浓度作为横坐标， 做点图， 并 对数据进行线性拟合， 得到标准曲线， 并获得标准浓度换算公式， 结果如图1、 2所示， 为本实 施例制备获得的比率荧光探针对氯胺酮的荧光响应图和对氯胺酮含量的线性关系图。 0061 同时设置对照组： 0062 对照1： 以修饰后橙光铜纳米团簇作为单色荧光探针， 用于检测不同浓度梯度的氯 胺酮溶液， 在365nm激发光下， 记录荧光发射光谱， 对600nm处的荧光发射峰的强度进行数据 记录， 以加入目标待测物时与未加入目标待测物时的600nm处的荧光发射峰强度的比值作 为纵坐标， 目标待测物的浓度作为横坐标， 做点图， 并对数据进行线性拟合， 得到标准曲线， 并

27、获得标准浓度换算公式， 结果如图3、 4所示， 为铜纳米团簇作为单色荧光探针时对氯胺酮 的荧光响应图和对氯胺酮含量的线性关系图； 0063 对照2： 将发蓝色荧光的碳点和修饰后橙光铜纳米团簇混合， 获得无包裹结构的比 率荧光探针， 用于检测不同浓度梯度的氯胺酮溶液， 在365nm激发光下， 记录荧光发射光谱， 对460nm和600nm处的荧光发射峰的强度进行数据记录， 以600nm处的荧光发射峰强度与 460nm处的荧光发射峰强度的比值作为纵坐标， 目标待测物的浓度作为横坐标， 做点图， 并 对数据进行线性拟合， 得到标准曲线， 并获得标准浓度换算公式， 结果如图5、 6所示， 为无包 裹结构

28、的比率荧光探针对氯胺酮的荧光响应图和对氯胺酮含量的线性关系图。 0064 对照3： 在制备碳点二氧化硅铜团簇三层包裹型比率荧光探针时， 不加入阳离子 聚合物电解质， 获得非静电吸引的三层包裹型比率荧光探针， 用于检测不同浓度梯度的氯 胺酮溶液， 在365nm激发光下， 记录荧光发射光谱， 对460nm和600nm处的荧光发射峰的强度 进行数据记录， 以600nm处的荧光发射峰强度与460nm处的荧光发射峰强度的比值作为纵坐 标， 目标待测物的浓度作为横坐标， 做点图， 并对数据进行线性拟合， 得到标准曲线， 并获得 标准浓度换算公式， 结果如图7、 8所示， 为非静电吸引的三层包裹型比率荧光探

29、针对氯胺酮 的荧光响应图和对氯胺酮含量的线性关系图。 0065 结果可以看出， 本发明的探针荧光强度稳定， 对氯胺酮有较高的检测灵敏度， 由图 2、 4、 6、 8中的线性关系的方程可以看出， 不同状态下的铜团簇检测氯胺酮时， 拟合的线性方 程的斜率不同， 其中本发明的比率荧光探针中方程式的斜率为-0.01179， R20.99703， 这 表明当检测同一浓度的氯胺酮时， 本发明的三层包裹型比率荧光探针的荧光强度变化的更 大， 检测的灵敏度更高。 0066 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 111394090 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 111394090 A 8 图3 图4 说明书附图 2/4 页 9 CN 111394090 A 9 图5 图6 说明书附图 3/4 页 10 CN 111394090 A 10 图7 图8 说明书附图 4/4 页 11 CN 111394090 A 11