一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方法及试剂盒.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610261306.1 (22)申请日 2016.04.25 (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山 武汉大学 (72)发明人 秦银辉庞代文张志凌吴玲玲 夏和顺漆楚波 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 42222 代理人 常海涛 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方 法及试剂盒 (57)摘要

2、本发明公开了一种基于免疫磁球的淋巴结 转移癌诊断方法及试剂盒。 本发明方法基于的免 疫磁球为修饰有抗上皮粘附分子抗体的磁性纳 米球。 将免疫磁珠投入到穿刺标本中孵育5 10min， 再通过磁分选、 洗涤、 涂片和染色等步骤 即实现了对转移癌细胞的灵敏检测和可视化诊 断。 本发明方法捕获效率高、 特异性好， 对癌细胞 形态影响小， 总诊断准确率高达99.1%。 本发明实 现了对淋巴结反应性增生、 恶性淋巴瘤和转移癌 的区别诊断， 磁分选后的细胞涂片可直接用于瑞 氏染色、 免疫细胞化学、 免疫组织化学和原位荧 光杂交等鉴定， 这将成为转移癌诊断的有力手 段， 具有重要的医学意义。 权利要求书1页

3、说明书12页 附图6页 CN 105779393 A 2016.07.20 CN 105779393 A 1.一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法， 其特征在于包括如下步骤： 将 免疫磁球加入到转移癌病人的淋巴结穿刺物中， 2037孵育510min， 磁分选并用1 PBS洗涤获得癌细胞； 所述的免疫磁球为修饰了抗上皮粘附分子抗体的磁性纳米球； 所述的磁性纳米球为表面组装了5层磁性纳米粒子的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球， 其 粒径为429nm。 2.一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌的诊断方法， 其特征在于包括如下步骤： 将免疫 磁球加入到含有转移癌病人淋巴结穿刺物的1PBS溶液中， 2037

4、孵育510min， 磁分 选并用1PBS洗涤2次， 然后将浊液分散于10 L1PBS中， 用移液枪滴加到粘附载玻片上 疏水笔划定的区域内， 并均匀铺展开来， 将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理， 然后用瑞氏 染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察做出诊断。 3.一种收集淋巴结转移癌细胞的试剂盒， 其特征在于： 包含免疫磁球、 PBS和磁力架。 4.权利要求3所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于包括如下步骤： 将转移癌病人的淋 巴结穿刺物分散于1PBS中， 加入免疫磁球2037孵育510min， 然后用磁力架进行磁 分选并用1PBS缓冲溶液洗涤， 获得癌细胞。 5.一种淋巴结转移癌的诊断试剂盒

5、， 其特征在于： 包含免疫磁球、 PBS、 磁力架、 粘附载 玻片、 瑞氏染色试剂。 6.权利要求5所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于包括如下步骤： 将转移癌病人的淋 巴结穿刺物分散于1mL1PBS中， 加入免疫磁球2037孵育510min， 然后用磁力架进 行磁分选并用1PBS洗涤， 最后分散于10 L1PBS中， 用移液枪滴加到载玻片疏水笔划定 的区域内， 并均匀铺展开来， 将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理， 然后用瑞氏染色试剂对 细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105779393 A 2 一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方法及试剂盒 技术领域 0

6、001 本发明属于纳米材料及医学领域， 具体涉及一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊 断方法及试剂盒。 背景技术 0002 磁性、 生物靶向功能纳米微球已经实现了对核酸、 病毒、 细菌、 蛋白分子和肿瘤细 胞的检测， 并得到广泛报道和生物医学领域的应用。 Xie等人(Fluorescent-magnetic dual-encodednanospheres:apromisingtoolforfast-simultaneous-addressable high-throughputanalysis， Nanotechnology， 2012， 23(3)， 第035602页)首次用层层组装 法实现了微

7、纳球的磁性、 荧光和生物靶向三重编码。 Wen等人(Quick-ResponseMagnetic NanospheresforRapid ,EfficientCaptureandSensitiveDetectionof CirculatingTumorCells， Acs.Nano.， 2014， 8(1),第941-949页)用简便的、 高效可控的层 层组装策略构建了一种磁性纳米微球， 这种纳米尺寸的微球磁响应迅速， 1min内可以被商 品化的磁力架全部吸引， 此外， 磁性纳米微球还具备良好的单分散性， 在血液中不会发生团 聚和沉淀， 以单分散态100被回收。 偶联了EpCAM抗体的磁球通过

8、抗原抗体的作用成功的 捕获了全血中极少的肿瘤细胞， 孵育5min捕获率达到94， 磁分选后的肿瘤细胞仍保持较 高的活性， 可养活率为90.5， 可以用来再培养、 RT-PCR、 ICC鉴定等分析。 将这种磁性纳米 微球应用于癌症患者全血中CTCs的检测， 成功的检测到了低至1个循环肿瘤细胞， 显示了较 高的灵敏度和良好的重现性。 作为一种肿瘤细胞富集和检测工具， 磁性纳米微球拥有广阔 的应用前景。 0003 恶性肿瘤由于其侵袭和转移的特性严重威胁着人类的生命安全， 而癌症早期恶性 肿瘤细胞主要通过淋巴道转移， 所以细针淋巴结穿刺(FNA)检查成为临床上区分反应性增 生、 恶性淋巴瘤或转移性癌的

9、重要手段之一。 因为FNA是一种微小的活检， 因此也有人称它 为ABC(aspirationbiopsycyology)， 即针吸活检细胞学， 不仅能观察单个细胞的形态， 更 能观察细胞团内细胞的排列和生长方式， 它提供了远比脱落细胞学为多的信息。 据此不仅 能判断肿瘤性疾病， 也能诊断非肿瘤性疾病； 不仅能断定肿瘤的良、 恶性， 还能判断其组织 学类型， 为做出类似病例组织学的诊断提供了可能性。 这也是目前FNA诊断的基本趋势。 Zhang等人(颈部淋巴结细针穿刺细胞学检查的临床应用(Applicationoffine-needle aspitationcytologyincervicall

10、ymphnodes)， 肿瘤防治杂志(ChinJCancerPrev Treat)， 2005,12(23)， 第1775-1778页)对931例颈部肿大淋巴结的细针穿刺诊断进行， 回顾 性分析发现FNA检查的敏感度仅为82.5， 其中对转移癌的诊断敏感度为92.6， 总准确率 为95.7。 从这一结果看来针吸细胞学检查虽然是一种可靠、 准确率较高的淋巴结病理诊 断方法， 但是仍然存在读片依赖医生主观判断、 穿刺标本有限以及对不典型细胞难以区分 诊断等因素造成假阴性率和假阳性率过高等问题亟待解决。 发明内容 说明书 1/12 页 3 CN 105779393 A 3 0004 本发明的目的在于

11、提供一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法。 基于 该收集方法， 本发明的另一目的在于提供一种快速、 准确诊断淋巴结转移癌的方法， 以提高 穿刺细胞学诊断淋巴结转移癌的准确率。 本发明的目的还在于提供可以实现上述方法的试 剂盒。 0005 本发明的目的通过下述技术方案实现： 0006 一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法， 包括如下步骤： 将免疫磁球 (IMNs)加入到转移癌病人的淋巴结穿刺物中， 2037轻摇孵育510min， 磁分选并用1 PBS洗涤获得癌细胞。 所述的免疫磁球为修饰了抗上皮粘附分子(EpCAM)抗体的磁性纳米 球； 所述的磁性纳米球为表面组装了5层磁性纳米粒

12、子的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球， 其 粒径为429nm。 0007 一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌的诊断方法， 包括如下步骤： 将免疫磁球加入 到含有转移癌病人淋巴结穿刺物的1PBS溶液中， 2037轻摇孵育510min， 磁分选并 用1PBS洗涤2次， 然后将浊液分散于10 L1PBS中， 用移液枪滴加到粘附载玻片上疏水 笔划定的区域内(1.5cm1.5cm)， 并均匀铺展开来， 将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理， 然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察快速做出诊断。 0008 一种收集淋巴结转移癌细胞的试剂盒， 包含上述免疫磁球、 PBS和磁力架。 该试剂 盒的使用方法包括如

13、下步骤： 将转移癌病人的淋巴结穿刺物分散于1PBS中， 加入免疫磁 球2037轻摇孵育510min， 然后用磁力架进行磁分选并用1PBS缓冲溶液洗涤， 获得 癌细胞。 0009 一种淋巴结转移癌的诊断试剂盒， 包含上述免疫磁球、 PBS、 磁力架、 粘附载玻片、 瑞氏染色试剂。 0010 上述试剂盒的使用方法包括如下步骤： 将转移癌病人的淋巴结穿刺物分散于1mL 1PBS中， 加入免疫磁球2037轻摇孵育510min， 然后用磁力架进行磁分选并用1 PBS洗涤， 最后分散于10 L1PBS中， 用移液枪滴加到载玻片疏水笔划定的区域内(1.5cm 1.5cm)， 并均匀铺展开来， 将细胞涂片置于

14、钨灯下进行干片处理， 然后用瑞氏染色试剂对 细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。 0011 上述试剂盒还包含离心管、 移液枪等。 0012 本发明具有如下有益效果： 0013 (1)本发明方法通过免疫磁分选的方法可实现特异性捕获穿刺物中的转移癌细胞 (上皮来源)， 无需进行磁球释放， 涂在玻片上便于后续的一系列观察和鉴定， 包括瑞氏染色 观察癌细胞形态、 免疫细胞化学鉴定、 免疫组织化学鉴定以及荧光原位杂交技术的分子水 平鉴定。 0014 (2)本发明方法可实现极少量淋巴结穿刺物中稀少癌细胞的检测， 操作简便、 省 时， 对标本的损失较少， 灵敏度高。 诊断结果一目了然， 便于观察。 0015

15、(3)本发明方法解决了仅从细胞形态上难以区别诊断反应性增生、 恶性淋巴瘤和 转移性癌的问题， 提高了诊断的敏感度、 特异度和诊断准确度。 且磁分选过程对癌细胞形态 和细胞环境影响较小， 仍能保留其病理学特征判据。 附图说明 说明书 2/12 页 4 CN 105779393 A 4 0016 图1为免疫磁球(IMNs)用于淋巴结穿刺物中癌细胞的检测示意图， 其涂片可进行 瑞氏染色、 细胞免疫化学(ICC)、 免疫组织化学(IHC)、 荧光原位杂交(FISH)等鉴定。 0017 图2为磁性纳米球的表征结果。 其中， (a)为磁性纳米球的透射电镜(TEM)图； (b)为 磁力架在不同吸引时间下对磁

16、性纳米球的捕获效率； (c)为磁性纳米球的水合粒径柱状图； (d)为室温保存12个月后磁性纳米球的水合粒径柱状图。 0018 图3为抗体筛选结果。 其中， (a)为三种蛋白pCK、 E-Cad和EpCAM在乳腺癌MCF-7细胞 膜上的表达水平； (b)为EpCAM在乳腺癌MCF-7、 淋巴细胞JurkatT和肝癌LM9细胞膜上的表 达水平； 左边是明场20倍镜下， 右边为荧场20倍镜下。 0019 图4为MNs的吸光度、 FITC-labeledmouseIgG的荧光强度对其浓度的标准曲线。 其中， (a)为MNs在600nm处吸光度对其浓度(不同稀释倍数)的标准曲线； (b)为FITC- l

17、abeledmouseIgG的荧光强度对其浓度的标准曲线(加入与IMNs等量的MNs以扣除背景影 响)。 0020 图5为不同情况下IMNs对细胞的捕获效率。 其中， (a)为不同浓度下IMNs对MCF-7细 胞的捕获效率； (b)为不同孵育时间下IMNs对MCF-7细胞的捕获效率； (c)为IMNs对MCF-7细 胞、 IMNs对JurkatT细胞以及MNs对MCF-7细胞的捕获效率。 0021 图6为IMNs对混合细胞体系中低浓度癌细胞的捕获效率及磁分选前后细胞的荧场 对比图。 (a)为IMNs对含少量MCF-7细胞(MCF-7细胞浓度为5、 50、 100、 500和1000个/mL，

18、JurkatT细胞1105个/mL)的混合体系中癌细胞的捕获效率； (b)为MCF-7:JurkatT1: 100混合体系免疫磁分选前和(c)为免疫磁分选后的免疫荧光图。 其中Hoechst33342核染 料染细胞核， FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体鉴定MCF-7细胞， 藻红蛋白(PE)标记的抗白细 胞共同抗原(CD45)抗体鉴定JurkatT细胞。 0022 图7为免疫细胞化学(ICC)鉴定结果。 (a)为MCF-7:JurkatT1:100混合体系免疫 磁分选前和(b)为免疫磁分选后的三色免疫荧光图及叠加图。 从左到右分别为Hoechst 33342核染料、 FITC标记的抗角蛋白

19、(CK19)抗体、 藻红蛋白(PE)标记的抗白细胞共同抗原 (CD45)抗体。 0023 图8为不同孵育时间对癌细胞形态的影响。 (a)为10倍镜下瑞氏染色观察不同孵育 时间下癌细胞的形态； (b)为不同孵育时间对转移性鳞癌、 腺癌和未分化癌细胞形态的影 响。 0024 图9为四种干片方法对癌细胞形态的影响。 (a-1)自然风干(a-2)热风吹干(a-3)钨 灯烤干(a-4)37烘箱烘干； (b)为不同干片方法对转移性鳞癌、 腺癌和未分化癌细胞形态 的影响。 0025 图10为磁分选诊断淋巴结转移癌的实验流程图。 0026 图11为阴性对照和阳性对照实验结果。 (a)为同一转移癌病人穿刺物(左

20、)IMNs磁 分选细胞涂片和(右)MNs磁分选细胞涂片； (b)为同一转移癌病人淋巴结穿刺物(左)直接涂 片和(右)磁分选后涂片效果， 其中绿色箭头所指为红细胞， 红色箭头所指为上皮细胞， 黑色 箭头所指为纤维细胞。 (瑞氏染色， 20倍镜下) 0027 图12为免疫微球对不同类型转移癌细胞的捕获。 (a-1， a-2)为转移性鳞癌磁分选 细胞涂片， (a-3， a-4)为转移性腺癌磁分选细胞涂片； (b)为淋巴结转移癌， 怀疑淋巴瘤， 直 接涂片(左)和磁分选涂片(右)。 瑞氏染色， 20倍镜下。 说明书 3/12 页 5 CN 105779393 A 5 0028 图13为三种类型转移癌病

21、人淋巴结穿刺物磁分选细胞涂片的瑞氏染色和ICC鉴定 结果(a)转移性鳞癌； (b)转移性腺癌； (c)未分化癌。 具体实施方式 0029 以下实施例仅用于进一步说明本发明， 但不应理解为本发明的实施只局限于这些 说明。 对于本发明所属技术领域的技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做 出若干推演或替换。 0030 实施例1快速诊断淋巴结转移癌 0031 将免疫磁球(IMNs)用于淋巴结穿刺细胞中癌细胞的检测示意图如图1所示， 通过 免疫磁分选的方法可实现特异性捕获穿刺物中的转移癌细胞(上皮来源)， 无需进行磁球释 放， 涂在玻片上便于后续的一系列观察和鉴定， 包括瑞氏染色观察癌细

22、胞形态、 免疫细胞化 学鉴定、 免疫组织化学鉴定以及荧光原位杂交技术的分子水平鉴定。 0032 下面对以乳腺癌细胞MCF-7为细胞模型建立方法， 利用磁性纳米可靠诊断淋巴结 转移癌进行详细说明。 0033 一、 方法 0034 1、 磁性纳米球(MNs)的制备 0035 磁性纳米球是通过层层组装法在苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球表面层层组装磁性 纳米颗粒nano-F2O3得到。 具体步骤为： (1)采用无乳聚合法制备得到苯乙烯-丙烯酰胺共 聚纳米球， 并依次通过酰肼化、 丁二酸酐化在纳米球表面修饰上羧基， 得到表面带有羧基的 苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球(Pst-AAm-COOH)。 (2)取1mL

23、表面带有羧基的苯乙烯-丙烯酰胺 共聚纳米球， 依次向其中加入25mgEDC和15mgNHS活化(EDC和NHS分别用200 L0.01M pH7.2的PBS溶解)， 然后将其加入到1mLPEI(MW： 25K， 溶于0.01MpH7.2的PBS， 浓度： 0.2g/ mL)， 于37摇床反应过夜， 在纳米球表面组装一层PEI。 (3)将步骤(2)所得产物用0.5M NaCl溶液离心洗涤4次(16000rpm20min)， 再依次用超纯水离心洗涤6次(除去未反应的 PEI)、 无水乙醇离心洗涤6次(12000rpm15min)， 然后用800 L正己醇超声分散均匀。 与此 同时， 取400 L磁

24、性纳米粒子nano-F2O3用无水乙醇沉淀后也用800 L正己醇超声分散均 匀， 加入到纳米球中混合摇匀， 置于摇床上室温反应2h。 (4)将步骤(3)所得产物离心去上 清， 并用正己烷洗涤除去未组装上的磁性纳米粒子， 然后分别用无水乙醇洗涤3次、 超纯水 洗涤1次， 加入1.6mLPEI溶液(MW： 750K， 溶于0.01MpH7.2的PBS， 浓度： 10mg/mL)超声分散 均匀置于摇床上室温反应2h， 组装第二层PEI。 (5)将步骤(4)所得产物离心去上清， 用超纯 水离心洗涤3次， 除去未反应的PEI。 重复步骤(3)、 (4)进行多层组装， 通过改变组装磁性纳 米颗粒的层数，

25、可以得到具有不同磁响应的磁性纳米球。 6)将组装了5层磁性纳米粒子的纳 米球用无水乙醇洗涤三次， 分散于4mLPVP-k30溶液中(用无水乙醇配制， 浓度： 20mg/mL)， 置于摇床上室温反应24h。 (7)向步骤(6)所得产物中加入95 L氨水(29.8wt)和125 L TEOS溶液(用无水乙醇配制， 10vol)， 室温下继续摇床反应12h。 (8)取步骤(7)所得产物约 10 L， 离心洗涤后分散于1mL超纯水中， 用动态光散射仪测其zeta电势， 当zeta电势变为- 25mV左右时， 继续下一步反应(若电势没有达到-25mV， 则需再次加入TEOS溶液， 继续反应， 直到电势达

26、标)。 加入125 LAPTES溶液(用无水乙醇配制， 10vol)， 继续在摇床上反应 12h， 测定样品的zeta电位， 当zeta电位变为25mV左右时， 即可终止反应(若电位没有达到 说明书 4/12 页 6 CN 105779393 A 6 25mV， 则需再次加入APTES溶液， 继续反应， 直到电位达标)。 (9)将步骤(8)所得产物用无水 乙醇离心洗涤3次。 然后可进行以下两种处理： a.用超纯水洗涤3次后， 分散到1mL超纯水中， 即得表面为氨基的功能纳米球， 存放待用； b.将表面为氨基的功能纳米球分散到3mLDMF 中， 再加入1mL溶解0.08g丁二酸酐的DMF， 置于

27、摇床上， 室温下反应3h， 测定样品的zeta电 位， 当电位达到-30mV左右时即可终止反应， 将样品用乙醇离心洗涤3次， 超纯水离心洗涤3 次， 即得表面为羧基的功能纳米球(即磁性纳米球， 粒径429nm)， 分散于1mL超纯水中存放待 用。 0036 2、 抗体筛选 0037 上皮粘附分子(EpCAM)、 广谱角蛋白(pan-CK)、 E-钙粘蛋白均在癌细胞的细胞膜上 有不同程度的表达， 本实验以乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型， 通过免疫荧光实验考察这三种 抗原在MCF-7细胞细胞膜上的表达情况， 筛选出在癌细胞膜上表达量高的抗原相应的抗体。 具体实验过程为： (1)取上述抗原相应的抗体

28、(均为小鼠来源)2 L(1:200稀释)加入到400 LMCF-7细胞悬液中(分散于0.5的BSA， 浓度1105个/mL)， 置于37培养箱中孵育30min， 用1PBS洗去未结合上的多余抗体(洗四次)。 (2)将上述细胞重悬于400 L0.5的BSA中， 加入2 L染料标记的鼠源二抗(1:200稀释)， 置于37培养箱孵育30min， 用1PBS洗去未结 合上的多余二抗(洗五次)。 (3)设计三组对照实验： a.将相同浓度的MCF-7细胞相同条件下 直接和染料标记的二抗孵育； b.将相同浓度的MCF-7细胞加4的多聚甲醛固定10min， 加 Triton-X100通透10min后按上述步骤

29、(1)、 (2)操作加一抗和二抗孵育； c.将相同浓度的 MCF-7细胞加4的多聚甲醛固定10min， 加Triton-X100通透10min后仅加染料标记的二抗 孵育。 整个过程需在避光的条件下进行， 然后在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光强度。 0038 3、 磁性纳米球的生物功能化及表面抗体有效结合位点数目的定量 0039 利用EDC/NHS活化法将抗EpCAM抗体修饰到磁性纳米球表面。 具体步骤为： (1)取大 约100 L(29mg/mL)上述制备的磁性纳米球(MNs)， 用0.01MpH6.8PBS洗涤两次后分散到 200 L0.01MpH6.8的PBS中； (2)称取4mgEDC和

30、2mgNHS各用100 L0.01MpH6.8PBS溶 解， 然后立即加入到前面分散有磁性纳米球的PBS中(先加EDC， 后加NHS)； (3)室温下轻摇反 应25min后， 通过磁分离用0.01MpH7.2的PBS将磁性纳米球洗涤一次， 然后分散到1mL 0.01MpH7.2的PBS中， 加入约20 L抗EpCAM抗体(1mg/mL)， 反应4h以上； (4)用0.01MpH 7.2PBS洗涤五次除去未反应的抗体， 制得免疫磁球(IMNs)， 存于4冰箱待用。 0040 以修饰了抗EpCAM抗体的免疫磁球(IMNs)为研究对象， 计算该免疫磁球表面抗体 的有效结合位点的数目。 具体实验过程为

31、： (1)首先测定一定量IMNs和染料标记的二抗充分 结合后的荧光强度， 具体为： 取10 LIMNs和10 LFITC-mouseIgG(0.5mg/mL)混合在1 PBS中37摇床反应1h； 然后用1PBS洗涤8次以上， 分散到400 L1PBS中， 测定其荧光强 度， 同时取一部分上述样品稀释5倍后， 测定其在600nm处的吸光度， 用于计算IMNs的浓度； (2)与此同时， 将已知浓度的MNs按下列稀释比进行稀释： 0.001、 0.002、 0.004、 0.006、 0.008、 0.010， 然后测定这些溶液在600nm处的吸光度并绘制吸光度-浓度标准曲线； (3)结 合样品在该

32、波长处的吸收值计算出免疫磁球的浓度； (4)最后， 在与(1)中IMNs相同浓度的 MNs存在下测定并绘制当FITC-mouseIgG稀释浓度为0、 0.33、 0.67、 1.0、 1.33、 1.67 g/mL时 荧光强度对其浓度的标准曲线， 结合前面测得的样品的荧光强度， 计算出每个免疫磁球 (IMNs)上有效结合位点的数目。 说明书 5/12 页 7 CN 105779393 A 7 0041 其中， 由于组装法合成过程中球的损失很少， 即可将组装前聚合物球的浓度作为 MNs的浓度， 组装前聚合物球的浓度采用密度法进行测定， 由于一定的合成条件下不同批次 的纳米球的粒径和密度都比较接近

33、， 通过下面的公式计算由公式1和2可以看出， 密度项对 纳米球浓度的测定结果影响较小。 所以在相同的合成条件下， 用动态光散射粒径仪测得 Pst AAm球的水合粒径d， 对于每批纳米球只需要通过烘干称重得到纳米球的质量体积浓度 Cm/V， 即可以通过密度法算出纳米球的准确个数质量浓度CN/m和个数体积浓度CN/V。 0042 CN/m0.001/4/3 (d/2)3 1 0043 CN/V0.001/4/3 (d/2)3 Cm/V2 0044 4、 免疫磁球浓度及孵育时间对癌细胞捕获效率的影响 0045 首先确定IMNs的用量并评估其特异性： 取0.10mg、 0.19mg、 0.29mg、

34、0.38mg的IMNs 分别加入1mLMCF-7细胞悬浮液中(MCF-7细胞分散于1mL1PBS中， 浓度为1.0105/mL)， 37条件下轻摇孵育20min， 磁分选并用1PBS洗涤3次以上， 收集上清液和细胞磁球浊液 并用血细胞计数板对其中的MCF-7细胞进行计数， 计算捕获率。 0046 接下来研究不同孵育时间下IMNs对MCF-7细胞的捕获效率： 将0.29mg的IMNs分别 加入到5等份MCF-7细胞中(MCF-7细胞分散于1mL1PBS中， 浓度为1.0105个/mL)， 分别 在37条件下轻摇孵育5min、 10min、 15min、 20min、 25min， 分别收集上清液

35、和细胞磁球浊液 并用血细胞计数板对其中的MCF-7细胞进行计数， 计算捕获率。 0047 接下来设计两个对照实验研究IMNs对癌细胞捕获的特异性， 具体为： (1)将0.29mg 的IMNs加入到1mLJurkatT细胞悬浮液中(JurkatT细胞分散于1mL1PBS中， 浓度为1.0 106个/mL)， 在37条件下轻摇孵育20min。 按照前面的步骤进行操作并计算捕获效率； (2)将未修饰抗体的MNs加入到上述MCF-7细胞悬浮液中(MCF-7细胞分散于1mL1PBS中， 浓度为1.0105个/mL)。 按照前面的步骤进行操作并计算捕获效率。 0048 其中， 捕获率浊液中细胞个数/(浊液

36、中细胞个数+清液中细胞个数)。 0049 5、 IMNs对混合体系中低浓度的癌细胞的检测 0050 用IMNs捕获混合细胞体系中低浓度的肿瘤细胞。 将不同量用Hoechst33342染核 的MCF-7细胞分别加入JurkatT浓度为106个/mL的1PBS溶液中， 使MCF-7细胞的浓度约为 5、 50、 100、 500、 1000个/mL。 向以上体系中， 加入一定量的IMNs， 37下轻摇避光孵育20min， 磁分选并洗涤， 将清液和浊液分别收集于细胞培养皿中， 通过荧光显微镜对其中的MCF-7细 胞进行计数并计算捕获效率。 0051 6、 对捕获癌细胞的免疫细胞化学鉴定 0052 将M

37、CF-7细胞加入1PBS、 105个/mLJurkatT细胞悬液中， 使MCF-7细胞的浓度约 为103个/mL制得模拟临床穿刺细胞标本， 向其中加入IMNs， 37下轻摇孵育5min； 磁分选并 用1PBS洗涤一次， 加入4多聚甲醛溶液重悬捕获的细胞并在37下孵育10min， 将细胞 固定； 磁分选后加入0.1Triton-X100溶液重悬细胞并在37下孵育10min， 将细胞进行 通透处理； 磁分选后加入30 g/mLHoechst33342溶液重悬细胞， 再加入FITC标记的抗CK19 抗体、 PE标记的抗CD45抗体， 在37下避光孵育30min， 进行免疫细胞化学染色； 磁分选并用

38、1PBS洗涤5次， 最后将细胞重悬于100 L1PBS中并将其置于PDMS小室中， 用磁铁将捕获 的细胞吸引至小室底部， 通过倒置荧光显微镜对细胞进行观察鉴定并计数。 0053 7、 IMNs对病人淋巴结穿刺物中转移癌细胞的检测 说明书 6/12 页 8 CN 105779393 A 8 0054 (1)反应条件的优化 0055 对于临床病理医生来说， 细胞的形态学特征是做出病理诊断的参考要素之一， 所 以磁分选后使癌细胞保持良好的细胞形态显得尤为重要。 而且从不同病人身上取得的癌细 胞和培养的癌细胞形态和性质都有所差异， 因此以实际转移癌病人的癌细胞标本为研究对 象， 考察孵育时间对癌细胞形

39、态的影响， 具体实验过程为： 对转移癌病人肿大的淋巴结进行 细针穿刺， 将所得穿刺物分散于4mL1PBS中， 吹匀并均分成4等份； 分别向上述标本悬液 中加入一定量等量的IMNs， 室温条件下分别轻摇孵育5min、 10min、 15min、 20min， 磁分选并 用1PBS洗涤2次； 然后将浊液分散于10 L1PBS中， 用移液枪吸取并滴加到载玻片划定 区域内(1.5cm1.5cm)， 小心均匀铺展开来， 将玻片用钨灯烘干后， 用瑞氏染色试剂对细胞 涂片进行染色并在显微镜下观察。 考虑到不同病人细胞标本之间本身就存在差异性， 分别 考察孵育时间对淋巴结转移癌的三种常见癌细胞： 鳞癌、 腺癌

40、、 未分化癌的细胞形态的影 响。 0056 接下来考察不同干片方法对癌细胞形态的影响， 具体实验过程为： 对转移癌病人 肿大的淋巴结进行细针穿刺， 将所得穿刺物分散于4mL1PBS中， 吹匀并均分成4等份； 分 别向上述标本悬液中加入一定量等量的IMNs， 室温条件下轻摇孵育10min， 磁分选并用1 PBS洗涤2次； 然后将浊液分散于10 L1PBS中,用移液枪吸取并滴加到载玻片划定区域 内， 小心均匀铺展开来； 将四张细胞涂片分别用自然风干、 热风吹干、 钨灯烤干和37烘箱 烘干四种方法进行干片处理， 然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观 察。 同样考虑到不同病人细胞标本之间

41、本身存在的差异性， 分别考察不同干片方式对淋巴 结转移癌的三种常见癌细胞： 鳞癌、 腺癌、 未分化癌的细胞形态的影响。 0057 8、 实际穿刺细胞标本中转移癌的检测和染色鉴定 0058 分别对转移性鳞癌和转移性腺癌病人肿大的淋巴结肿块进行细针穿刺， 将所得穿 刺物分散于1mL1PBS中， 吹匀加入20 LIMNs， 室温条件下轻摇孵育10min， 磁分选并用1 PBS洗涤2次， 然后将浊液分散于10 L1PBS中， 用移液枪滴加到载玻片疏水笔划定的区 域内(1.5cm1.5cm)， 并均匀铺展开来， 将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理， 然后用瑞氏 染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。

42、 0059 其中具体涂片及瑞氏染色步骤如下： 0060 1)将磁分选后的细胞和磁球滴加到玻片划定的区域内， 用枪头均匀推开， 将玻片 放入37烘箱烘干或用钨灯烤干(约3min)； 0061 2)滴加0.5mL刘A试剂， 使其均匀分散到涂片区域约一分钟； 0062 3)在刘A试剂上覆盖滴加1mL刘B试剂， 使其均匀分散到涂片区域约一分钟； 0063 4)流水冲去刘A刘B试剂， 即可在显微镜下观察。 0064 免疫细胞化学鉴定： 将干片后的细胞涂片滴加200 L4多聚甲醛溶液完全覆盖 标本区域， 室温固定10min； 小心吸去标本区上的固定液， 然后滴加200 L0.1Triton-X 100溶液

43、完全覆盖标本区域， 室温通透10min； 小心吸去标本去的通透试剂， 然后用200 L 0.2BSA洗涤标本区域2次， 每次一分钟； 吸弃标本区上的0.2BSA， 将配制好的抗体试液 (将FITC标记的鼠二抗1:100稀释、 PE标记的抗CD45抗体1:100稀释、 Hoechst33342染料1: 1000稀释分散于200 L0.2BSA)加至标本区， 室温避光孵育1h， 为了防止标本区干片， 使 用湿盒并避光保存； 最后使用0.2BSA洗标本区5次以上， 吸尽残留液体， 直接在倒置荧光 说明书 7/12 页 9 CN 105779393 A 9 显微镜下观察。 如要长期保存则盖上盖玻片，

44、轻轻按压并吸去周围液体， 置于2-8环境下 避光保存。 0065 二、 结果 0066 1、 磁性纳米球的表征 0067 成功制备了组装5层磁性纳米粒子的MNs， 通过透射电镜表征(图2a)可以看出， MMs 粒径均一， 从水合粒径柱状分布图(图2c)可以看出， MNs平均粒径约为429nm， 与其电镜图相 吻合， 且具备良好的单分散性。 通过测定放置12个月以后MNs的水合粒径(如图2d所示)， 发 现其粒径基本不变、 单分散性良好， 说明MNs的性质十分稳定， 可以在室温下长期保存。 0068 测定组装5层磁性纳米粒子的MNs的磁响应速率， 通过计算用磁力(Invitrogen， 1232

45、0D， 磁力架表面的磁场强度为32525mT)吸引不同时间下MNs的捕获效率来评价其磁 响应速率： 将MNs悬液置于磁力架上， 吸引不同的时间(0s、 30s、 60s、 90s、 120s、 180s)后将清 液取出， 测定MNs原液和清液在600nm处的吸收值。 研究已证明MNs悬液在600nm处的吸收值 正比于其浓度， 所以可以通过以下公式计算出不同时刻下MNs的捕获效率 0069 t(1-At/A0)1003 0070 其中， At为用磁力架吸引MNs不同时间后所得清液在600nm处的吸收值， A0为MNs原 液在600nm处的吸收值。 由图2b可以看出， 随着磁力架吸引时间的增长，

46、MNs越来越多的被吸 引过来， 1min就有90以上的MNs被吸引， 可见其磁响应速度极快。 0071 2、 抗体筛选 0072 淋巴结转移癌多为上皮来源的恶性肿瘤细胞， 因此需构建一种对上皮来源癌细胞 有较高捕获效率且高特异性的免疫磁球。 以人乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型， 考察广谱的角 蛋白(pan-CK)、 E型钙粘蛋白(E-Cad)以及上皮粘附分子(EpCAM)三种癌细胞膜蛋白的表达 水平， 通过图3所示的免疫荧光实验， 即一抗和癌细胞膜上的相应抗原结合， 然后一抗再特 异性结合染料标记的二抗， 由二抗所标记染料的荧光强度即可推测癌细胞膜上相应抗原的 表达情况。 由实验结果(图3a)

47、可以看出， 三种上皮性肿瘤标志物中只有EpCAM在MCF-7细胞 膜上有较高的表达， 而pCK和E-Cad呈低表达或不表达。 接着考察了EpCMA在上皮性肿瘤细胞 MCF-7和两种间叶性细胞JurkatT、 LM9膜上的表达情况， 由图3b可以看出EpCAM在肝癌LM9 细胞和淋巴细胞JurkatT两种间叶细胞的细胞膜上呈不表达或低表达， 证明了选抗EpCAM 抗体作为淋巴结转移癌细胞的捕获抗体具有较高的特异性。 基于此后续通过EDC/NHS活化 法将抗EpCAM抗体修饰到MNs表面， 构建对淋巴结转移癌细胞有高特异性和高捕获效率的免 疫磁性纳米微球(IMNs)。 0073 3、 IMNs表面

48、抗体有效结合位点数目的定量 0074 免疫磁球表面抗体的有效结合位点数目作为评价磁球性能的一个重要参数， 对理 论上考察和探索磁球浓度与捕获效率的关系可提供重要参考。 利用免疫磁球表面修饰的一 抗和染料标记的二抗特异性结合的原理， 测定IMNs表面抗体的有效结合位点数目。 从实验 结果来看： 如图4(a)所示， 测得MNs在600nm吸光度对其浓度的标准曲线， 和一定量IMNs在 600nm处的吸光度， 即可计算得到IMNs的个数体积浓度为2.711011个/mL(MNs取苯乙烯-丙 烯酰胺聚合物球的个数体积浓度1.651012个/mL)。 如图4(b)所示， 通过测定FITC-labeled

49、 mouseIgG稀释浓度分别为0、 0.33、 0.67、 1.0、 1.33、 1.67 g/mL(加入与IMNs等量的MNs以扣 除磁球的影响)时荧光强度对其浓度的标准曲线， 同样条件下再测定IMNs和FITC-labeled 说明书 8/12 页 10 CN 105779393 A 10 mouseIgG(0.5mg/mL)孵育后的荧光强度， 两者进行对照即可计算出IMNs上结合二抗的浓 度， 再根据前面所计算的IMNs的个数体积浓度， 计算得到40 LIMNs表面二抗浓度为0.692 g/mL， 查得鼠IgG的分子量约为150KD， 计算IMNs表面活性位点数目NNIMNs/NIgG102。 0075 4、 IMNs对乳腺癌MCF-7细胞的捕获能力 0076 EpCAM表达于上皮组织来源细胞的细胞膜上， 在很多上皮癌组织中表达水平明显 升高。 而淋巴结的正常细胞源于间叶组织， 不表达EpCAM， 所以可以用偶联了抗EpCAM抗体的 IMNs特异性捕获淋巴结转移癌细胞。 为了保证IMNs可以高效地捕获目标细胞， 需要优化 IMNs的用量， 研究IMNs在不同浓度下对MCF-7细胞细胞的捕获能力。 由图5(a)可以看出， 当 IMNs的浓度 0.29mg/mL时， 捕获效率均