一株巨大芽孢杆菌及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611008089.1 (22)申请日 2016.11.16 (83)生物保藏信息 CGMCC No.13045 2016.09.26 (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街镇 大学城学园路2号福州大学新区 (72)发明人 倪莉赵惠茹刘志彬张雯 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊陈彩芳 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A23K 10/30(2016.01) A23K 1

2、0/12(2016.01) C12R 1/11(2006.01) (54)发明名称 一株巨大芽孢杆菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株巨大芽孢杆菌及其应用， 涉 及 一 株 巨 大 芽 孢 杆 菌（B a c i l l u s . megaterium） FZU-BM1601， 该菌株由中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏 编号为： CGMCCNo.13045， 保藏日期为2016年09 月26日。 该巨大芽孢杆菌可用于制备蛎菜发酵饲 料添加剂， 方法为蛎菜脱盐、 粉碎、 均质后， 经巨 大芽孢杆菌发酵， 产生大量对养殖动物有益的寡 糖等小分子特效代谢产物， 提高饲

3、料的生物活 性。 本发明制得的蛎菜发酵饲料添加剂， 适用于 添加到鸡、 猪等动物饲料中， 具有提高动物免疫 力、 维持养殖动物体内微生物平衡、 促进生长等 作用， 可以满足市场多样性需求。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106479933 A 2017.03.08 CN 106479933 A 1.一株巨大芽孢杆菌菌株， 其特征在于： 所述菌株为巨大芽孢杆菌 （Bacillus . megaterium） FZU-BM1601， 并于2016年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 保藏编号为： CGMCC No.13045。 2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌

4、株在制备蛎菜发酵饲料添加剂中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述蛎菜发酵饲料添加剂的制备方法为： 1） 取权利要求1所述的巨大芽孢杆菌FZU-BM1601活化后， 以接种量15的比例接种 到蛎菜发酵培养基中， 发酵培养得到发酵液； 其中， 所述发酵培养基中菌体浓度109 1010CFU mL-1； 2） 将1） 所得发酵完全的发酵液放入培养箱干燥， 温度控制在3540， 时间1524小 时， 干燥完成的物料水份控制在1012 wt.%。 4.根据权利要求3所述应用， 其特征在于： 步骤1） 所述蛎菜发酵培养基的制备方法如 下： a） 蛎菜原料， 按重量份数比取1份蛎菜和

5、10份淡水， 将蛎菜放入淡水中浸泡0.5-1小时 后， 过滤， 重复浸泡和过滤2-3次， 干燥至含水量不高于10， 粉碎至6080目； b） 取步骤a） 所得蛎菜粉25wt.、 硫酸镁0.010.02wt.、 磷酸二氢钾0.02 0.05wt.、 氯化钙0.01wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数之和为百分之百， 混合均 质， 经121灭菌20分钟。 5.根据权利要求3 所述应用， 其特征在于， 步骤1） 中所述发酵条件为： 发酵温度25 37， 转速150200r min-1， 发酵4896h。 6.根据权利要求3所述应用， 其特征在于： 巨大芽孢杆菌FZU-BM1601 活化的培养基

6、为： 酵母提取物0.5wt.%、 蛋白胨1 wt.%、 NaCl 1 wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数之和 为百分之百， 经121灭菌20分钟。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106479933 A 2 一株巨大芽孢杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于饲料添加剂技术领域， 具体涉及一株巨大芽孢杆菌及其应用。 背景技术 0002 蛎菜(Ulva conglobata kjellm)属绿藻门石莼目石莼科植物， 俗名猪母菜， 主要 生长在中潮带和高潮带的岩石上或小石沼中。 在我国野生藻类中资源丰富， 广泛分布于西 太平洋沿海， 是福建沿海绿藻中生物量最大的经济海藻。 蛎菜中含有

7、丰富的优质蛋白， 其中 氨基酸种类齐全， 7种必需氨基酸含量达15.47%， 是营养价值极高的食物氨基酸来源； 蛎菜 中还含有丰富的维生素、 矿物质， 以及大量的多糖类成分， 其多糖组分中含鼠李糖、 木糖、 半 乳糖、 糖醛酸和硫酸酯等， 种类齐全， 在民间长期作为食、 药用。 在福建沿海， 蛎菜也常用作 家禽的配合饲料， 可以有效改善饲料品质。 0003 目前， 蛎菜在动物饲料中的应用方式主要是原藻粉碎或提取生长素等营养成分。 然而原藻含有大量纤维素， 养殖动物难于消化， 而且植物蛋白与动物蛋白氨基酸组成差异 较大， 因此， 简单粉碎混合添加利用率低。 加酸、 加碱等化学提取法常常导致海藻内

8、源物质 的活性被破坏， 营养成分受到损失； 另外， 因提取工艺必须加入的一些化学物质可能造成残 留， 影响饲料及养殖产品的食用安全性。 生物发酵法是微生物以海藻作为养分进行代谢， 将构成海藻的大分子物质降解成小分子、 水溶性物质。 由于发酵条件较为温和， 从而最大限 度地保留了海藻中的生物活性物质和营养成分， 因此生物发酵法是相对有效的海藻利用方 式， 具有广阔的应用前景。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一株巨大芽孢杆菌及其应用， 利用福建沿海生物量最大的绿 藻蛎菜， 针对目前蛎菜在动物饲料应用中的不足， 利用筛选到的一株可降解蛎菜多糖的芽 孢杆菌发酵制备饲料添加剂， 经过粉碎均质处理

9、之后， 蛎菜原料中的营养成分可被充分释 放更易于微生物的利用和降解， 极大地提高了蛎菜饲料的品质。 0005 为了达到上述目的， 采用以下技术方案： 一株巨大芽孢杆菌菌株， 所述菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)FZU- BM1601， 并于2016年09月26日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保 藏编号为： CGMCC No.13045， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 0006 本发明涉及一种蛎菜发酵饲料添加剂的制备方法， 包括如下步骤： （1） 取权利要求1所述的巨大芽孢杆菌FZU-BM1601， 以接种量15的比例接种到蛎菜 发酵培

10、养基中进行发酵； 其中， 所述种子培养基中菌体浓度1091010CFUmL-1； （2） 将 （1） 所得发酵完全的产品放入培养箱干燥， 温度控制在3540， 时间1524 小 时， 干燥完成的物料水份控制在1012 wt.%； 步骤 （1） 所述蛎菜发酵培养基的制备方法如下： a） 蛎菜原料， 按重量份数比取1份蛎菜和10份淡水， 将蛎菜放入淡水中浸泡0.5-1小时 说明书 1/4 页 3 CN 106479933 A 3 后， 过滤， 重复浸泡和过滤2-3次， 干燥至含水量不高于10， 粉碎至6080目； b） 取步骤a） 所得蛎菜粉25wt.、 硫酸镁0.010.02wt.、 磷酸二氢钾

11、0.02 0.05wt.、 氯化钙0.01wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数之和为百分之百， 混合均 质， 经121灭菌20分钟。 0007 步骤 （1） 中所述发酵条件为： 发酵温度2537， 转速150200rmin-1， 发酵48 96h。 0008 将巨大芽孢杆菌FZU-BM1601 经活化获得种子培养基； 活化菌种的培养基： 酵母提 取物0.5wt.%、 蛋白胨1 wt.%、 NaCl 1 wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数之和为百分 之百， 经121灭菌20分钟。 0009 制得的蛎菜发酵产物中寡糖终含量10mgg-1； 所述蛎菜固体发酵产物中的有效 活菌数108C

12、FUg-1。 0010 与现有技术相比， 本发明的优势和积极效果为： 本发明从蛎菜表面筛选得到可以 高效降解蛎菜多糖的巨大芽孢杆菌FZU-BM1601， 此菌株含有丰富的糖苷酶活性和蛋白酶活 性， 能有效对海藻进行发酵， 产生高浓度有利于动物生长的小分子蛎菜糖类物质。 均质处理 过的蛎菜细粉提升了营养物质的释放， 再经菌株发酵后， 极大增强了蛎菜发酵产物的营养 功效。 具体实施方式 0011 下面结合实施例对本发明作详细说明， 但本发明的保护范围不仅限于此。 0012 实施例1 菌株筛选过程如下： 从福清海域采集蛎菜， 用海水漂洗净藻体表面的泥沙， 放入盛有50ml无菌生理盐水的 锥形瓶中，

13、200r/min震荡15min使均匀， 梯度稀释后涂布到以蛎菜多糖为唯一碳源的选择性 培养基进行初筛， 30培养一定时间， 挑选单菌落划线分离纯化34次， 获得24株可降解蛎 菜多糖的菌株。 将所得菌株分别接种到蛎菜多糖发酵培养基进行复筛， 采用DNS测定酶活的 方法筛选获得高产蛎菜多糖降解酶的菌株,该菌株酶活达到0.288U/mL。 0013 复筛过程中酶活力的测定方法为： 接一环初筛得到的保存在斜面上的菌， 到装有 50 ml液体培养基的250 ml三角瓶中， 30， 180 r/min培养48 h后， 取上清测定浒苔多糖酶 活力。 在10 mL比色管中加入1 ml5 （w/v） 的蛎菜多

14、糖， 35水浴预热5min。 加入1ml酶液混 匀， 在35下恒温反应30 min， 以灭活的酶液加底物为空白对照组。 还原糖的测定则采用 DNS （3, 5二硝基水杨酸） 法。 反应结束后加入1 ml DNS摇匀终止反应， 沸水浴5min后流水 冷却， 定容至10 ml， OD520测吸光度。 用不同浓度的葡萄糖与DNS试剂反应， 测量520 nm处吸 光值。 酶活定义:在35， pH 6.0的条件下每min降解蛎菜多糖产生1 mol还原糖(以葡萄糖 计)所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。 0014 经鉴定， 该菌株呈革兰氏阳性， 光学显微镜下呈杆状， 初步鉴定为杆菌； 在蛎菜多 糖选

15、择性培养基表面的菌落粗糙， 有隆起， 边缘齐整， 米白色， 不透明， 干燥； 好氧， 最佳生长 温度为30， 最适生长pH 为7.07.5， 最适生长温度2535； 乙酰甲基甲醇试验 （VP） 实 验呈阳性， 甲基红 （MR） 试验呈阴性， 可降解蛎菜多糖。 0015 利用16S 通用引物对该菌株进行PCR 扩增得到16SrDNA 序列， 将所得结果在 说明书 2/4 页 4 CN 106479933 A 4 genbank 进行同源序列比对， 该菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的基因组 99相似， 由此可以确定该菌株属于巨大芽孢杆菌属， 并命名为巨大芽孢杆菌FZU

16、-BM1601。 0016 实施例2 所述蛎菜发酵饲料添加剂的制备方法为： 1） 取巨大芽孢杆菌FZU-BM1601活化后， 以接种量3的比例接种到蛎菜发酵培养基中， 发酵培养得到发酵液； 其中， 所述发酵培养基中菌体浓度109CFUmL-1； 2） 将1） 所得发酵完全的发酵液放入培养箱干燥， 温度控制在37， 时间20小时， 干燥完 成的物料水份控制在11wt.%； 步骤1） 所述蛎菜发酵培养基的制备方法如下： a） 蛎菜原料， 按重量份数比取1份蛎菜和10份淡水， 将蛎菜放入淡水中浸泡0.5小时后， 过滤， 重复浸泡和过滤2次， 干燥至含水量为10， 粉碎至70目； b） 取步骤a） 所

17、得蛎菜粉4wt.、 硫酸镁0.01wt.、 磷酸二氢钾0.03wt.、 氯化钙 0.01wt.， 其余百分数为蒸馏水， 各成分质量百分数为百分之百， 混合均质， 经121灭菌 20分钟。 0017 步骤1） 中所述发酵条件为： 发酵温度30， 转速200r min-1， 发酵64h。 0018 巨大芽孢杆菌FZU-BM1601 活化的培养基为： 酵母提取物0.5wt.%、 蛋白胨1 wt.%、 NaCl 1 wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数为百分之百， 经121灭菌20分钟。 0019 经上述步骤， 制得的所述蛎菜发酵产物中寡糖终含量为10.72mgg-1； 所述蛎菜固 体发酵产物中

18、的有效活菌数为4.5108CFUg-1。 0020 实施例3： 所述蛎菜发酵饲料添加剂的制备方法为： 1） 取所述的巨大芽孢杆菌FZU-BM1601活化后， 以接种量1的比例接种到蛎菜发酵培 养基中， 发酵培养得到发酵液； 其中， 所述发酵培养基中菌体浓度1010CFU mL-1； 2） 将1） 所得发酵完全的发酵液放入培养箱干燥， 温度控制在35， 时间15小时， 干燥完 成的物料水份控制在10 wt.%。 0021 步骤1） 所述蛎菜发酵培养基的制备方法如下： a） 蛎菜原料， 按重量份数比取1份蛎菜和10份淡水， 将蛎菜放入淡水中浸泡0.5小时后， 过滤， 重复浸泡和过滤3次， 干燥至含

19、水量不高于10， 粉碎至60目； b） 取步骤a） 所得蛎菜粉2wt.、 硫酸镁0.01wt.、 磷酸二氢钾0.02wt.、 氯化钙 0.01wt.， 其余百分数为蒸馏水， 各成分质量百分数为百分之百， 混合均质， 经121灭菌 20分钟。 0022 步骤1） 中所述发酵条件为： 发酵温度25， 转速150r min-1， 发酵48h。 0023 巨大芽孢杆菌FZU-BM1601 活化的培养基为： 酵母提取物0.5wt.%、 蛋白胨1 wt.%、 NaCl 1 wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数之和为百分之百， 经121灭菌20分钟。 0024 经上述步骤， 制得的所述蛎菜液体发酵产物

20、中寡糖终含量为12.24mgg-1； 所述蛎 菜固体发酵产物中的有效活菌数为6.5108CFUg-1。 0025 实施例4： 所述蛎菜发酵饲料添加剂的制备方法为： 1） 取所述的巨大芽孢杆菌FZU-BM1601活化后， 以接种量5的比例接种到蛎菜发酵培 说明书 3/4 页 5 CN 106479933 A 5 养基中， 发酵培养得到发酵液； 其中， 所述发酵培养基中菌体浓度1010CFU mL-1； 2） 将1） 所得发酵完全的发酵液放入培养箱干燥， 温度控制在40， 时间24小时， 干燥完 成的物料水份控制在12 wt.%； 步骤1） 所述蛎菜发酵培养基的制备方法如下： a） 蛎菜原料， 按

21、重量份数比取1份蛎菜和10份淡水， 将蛎菜放入淡水中浸泡1小时后， 过 滤， 重复浸泡和过滤3次， 干燥至含水量不高于10， 粉碎至80目； b） 取步骤a） 所得蛎菜粉5wt.、 硫酸镁0.02wt.、 磷酸二氢钾0.05wt.、 氯化钙 0.01wt.， 其余百分数为蒸馏水， 各成分质量百分数为百分之百， 混合均质， 经121灭菌 20分钟。 0026 步骤1） 中所述发酵条件为： 发酵温度37， 转速200rmin-1， 发酵96h。 0027 巨大芽孢杆菌FZU-BM1601 活化的培养基为： 酵母提取物0.5wt.%、 蛋白胨1 wt.%、 NaCl 1 wt.， 其余为蒸馏水， 各成分质量百分数之和为百分之百， 经121灭菌20分钟。 0028 经上述步骤， 制得的所述蛎菜液体发酵产物中寡糖终含量为15.56mgg-1； 所述蛎 菜固体发酵产物中的有效活菌数为7.8108CFUg-1。 说明书 4/4 页 6 CN 106479933 A 6