稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610055822.9 (22)申请日 2016.01.27 C12N 15/864(2006.01) (71)申请人 北京市结核病胸部肿瘤研究所 地址 101149 北京市通州区马厂 97 号 申请人 中国科学院苏州生物医学工程技术 研究所 (72)发明人 张宗德 张春 蓝文俊 刘晓玫 潘丽萍 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11369 代理人 史霞 (54) 发明名称 稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细 胞株的制备 (57) 摘要 本发明公开了一种稳定分泌近红外荧光标记 外泌体的乳腺

2、癌细胞株的制备方法， 通过构建一 种融合表达近红外荧光 iRFP682 蛋白和 CD63 蛋 白的质粒载体， 然后用此质粒包装的重组腺相关 病毒 (rAAV) 和辅助病毒以一定比例共感染人乳 腺癌 MDA-MB-231 细胞， 筛选获得能稳定表达近 红外荧光蛋白 iRFP682 标记的外泌体的人乳腺 癌 MDA-MB-231 细胞， 然后采用分步离心法分离提 纯近红外荧光蛋白 iRFP682 标记的外泌体进行鉴 定。本发明最终得到一个可用于乳腺癌肿瘤微环 境体内体外研究的新型生物标志物， 为进一步研 究细胞间物质转移机制提供了有力工具， 同时也 给癌症的诊断和治疗方案提供新的支持和契机。 (5

3、1)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 105624192 A 2016.06.01 CN 105624192 A 1.一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 包 括如下步骤： 1)编码外泌体标记蛋白CD63基因的获得： 从人乳腺癌MDA-MB-231细胞中提取总RNA进行逆转录得到cDNA， 用带XbaI和ClaI酶切 位点， 以及Linker序列的引物进行PCR扩增得到目的基因片段CD63-Linker； 2)重组质粒载体的构建： 步骤1)得到的所述CD63-Linker和

4、质粒骨架pAAV-iRFP682经T4DNA连接酶作用得到重 组质粒载体pAAV-CD63-Linker-iRFP682； 3)重组腺相关病毒的制备： 使用所述重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-iRFP682和辅助质粒体外共转染AAV-293细 胞， 包装重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682； 4)稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备： 使用所述重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682和辅助腺相关病毒共感染人乳 腺癌MDA-MB-231细胞， 通过荧光筛选获得稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的人乳腺癌 MDA-MB-2

5、31细胞株； 5)近红外荧光标记人乳腺癌MDA-MB-231细胞的外泌体提取及鉴定： 采用分步离心法从步骤4)标记成功的MDA-MB-231细胞培养上清液中提取iRFP682标记 的外泌体并进行鉴定。 2.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 所述步骤5)中分步离心法的步骤为： 首先将所述细胞培养上清液在4条件下依次经2000g离心15min、 5000g离心15min及 12000g离心30min去除细胞碎片， 得第一上清液； 然后将所述第一上清液使用孔径不大于0.2 m的膜过滤后， 4、 12000g条件下离心 120min， 得到外泌体粗

6、沉淀； 最后用PBS溶液重悬所述外泌体粗沉淀， 混合均匀后于4、 12000g条件下离心90min， 得到提纯外泌体， 将所述提纯外泌体使用PBS溶液重悬后置于-80条件保存备用。 3.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 所述步骤5)中iRFP682标记的外泌体鉴定的方法为： 使用westernblot鉴定所 述外泌体的膜表面蛋白， 通过透射电镜观察所述外泌体的结构， 以及通过SIM结构光照明超 分辨荧光显微镜观察外泌体的荧光标记。 4.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 所述Linker序

7、列为： ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg。 5.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 步骤3)的所述辅助质粒为pDG质粒。 6.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 所述辅助腺相关病毒为rAAVSVAV2。 7.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其特征在于， 步骤2)所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-iRFP682的摩尔比例为25。 8.如权利要求1所述的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳

8、腺癌细胞株的制备方法， 权利要求书 1/2 页 2 CN 105624192 A 2 其特征在于， 步骤4)所述所述重组腺相关病毒与所述人乳腺癌MDA-MB-231细胞数目的比例 是30006000。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105624192 A 3 稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备 技术领域 0001 本发明涉及生物标记领域。 更具体地说， 本发明涉及一种稳定分泌近红外荧光标 记外泌体的乳腺癌细胞株的制备。 背景技术 0002 1986年， 有学者在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了一种有膜结构的小囊 泡， 被称之为外泌体。 至1996年， 有学者发现EB病毒转化

9、的人B细胞内一些有膜结构的小囊 泡表面可表达主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex， MHC)类分 子， 能激活T细胞， 并与红细胞内外泌体的形成过程和排出途径相似(参见VanNielG, Porto-CarreiroI ,SimoesS ,RaposoG .Exosomes:acommonpathwayfora specializedfunction.JBiochem2006,140:1321)， 自此之后， 人们开始对外泌体展开 广泛的研究。 外泌体是由活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的直径为30 120nm的膜性囊泡(参见Stoo

10、rvogelW ,KleijmeerMJ ,GeuzeHJ ,RaposoG .The biogenesisandfunctionsofexosomes.Traffic2002,3:321330)。 目前的研究方向 主要有干细胞、 免疫、 microRNA和靶向给药。 2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞 囊泡方面贡献突出的科学家， 推动外泌体的研究达到全新的高度。 0003 各种不同种类的细胞、 组织、 器官和系统相互协调、 共同维持着我们复杂机体的正 常运行(参见J.Skog,T.Wrdinger,S.vanRijn,D.H.Meijer,L.Gainche,M.Sena-Este

11、ves, W.T.CurryJr.,B.S.Carter,A.M .Krichevsky ,X .O .Breakefield ,Glioblastoma microvesiclestransportRNAandproteinsthatpromotetumourgrowthand providediagnosticbiomarkers,Nat.CellBiol.2008,10:14701476)。 这与细胞之间 的信息传递是密切相关的， 而细胞之间的信息传递， 最主要是由细胞自己制造和释放的某 些特定化学物质来实现的， 例如外泌体。 当机体处于不正常状态， 例如疾病(癌症)发生时， 就会释放一

12、些信号物质来调节身体机能来适应变化。 这时， 外泌体作为这些信号物质中的 一员， 就起了非常大的作用(参见mericanCancerSociety,GlobalCancerFacts& Figures,2ndEditionAmericanCancerSociety,Atlanta,2011)。 外泌体含有蛋白质， mRNA， miRNA等信号分子， 它们反映分泌细胞的生理状态和功能状态， 甚至还会包含细胞病 态相关的分子信息， 从而提供了丰富的潜在的生物标志物分子源(参见YuS,CaoH,Shen B ,FengJTumor-derivedexosomesincancerprogression

13、andtreatment failure.Oncotarget.2015,7:1018)。 关于外泌体作为生物标志物来研究细胞之间的信 号传递已成为细胞生物学、 分子生物学和医学领域的研究热点之一.细胞信号传递与肿瘤 等多种疾病的发生、 发展和预防直接相关(参见SimonsM,RaposoG,Exosomesvesicular carriersforintercellularcommunication.CurrOpinCellBiol2009,21:575 581)。 因此， 外泌体的研究将在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。 0004 近红外荧光蛋白(Near-infraredfluore

14、scentprotein， iRFP)是绿色荧光蛋白 同源的一类荧光蛋白， 具备绿色荧光蛋白的发光优点(参见MikhailBaloban ,Daria 说明书 1/6 页 4 CN 105624192 A 4 M.Shcherbakova ,VladislavV.Verkhusha ,Two-ColorImagingusingSpectral VariantsofiRFP670andiRFP682Near-InfraredFluorescentProteins,Biophysical Journal,2015,108:624-631)。 但是， 相比于GFP， 它的激发光和发射光波长更长， 位

15、于近红 外光区(650900nm)， 在动物组织中光吸收和光散射较低， 有较高的穿透性， 更适宜于动物 活体组织的深层成像， 是活体成像更为理想的荧光标记分子(参见GrigoryS.Filonov, VladislavV.Verkhusha,ANear-InfraredBiFCReporterforInVivoImagingof Protein-ProteinInteractionsOriginalResearchArticleChemistry&Biology, 2013,20:1078-1086)。 近红外荧光蛋白iRFP682的激发光和发射光波长分别为663nm和 682nm， 是单体荧

16、光蛋白分子， 其发光性质较为稳定， 较长的光谱特点使其在活体动物组织 成像的应用中更具潜力。 0005 由此， 若能将外泌体的独特功能和近红外荧光蛋白在体内体外示踪的优越性结合 起来， 将能为进一步研究细胞间物质转移机制提供有力工具。 发明内容 0006 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷， 并提供至少后面将说明的优 点。 0007 本发明还有一个目的是提供一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞 株的制备方法， 其通过将编码近红外荧光蛋白iRFP682和外泌体CD63蛋白融合表达的基因 整合至乳腺癌细胞基因组中， 从而可获得稳定分泌近红外荧光标记的外泌体的乳腺癌细胞 株， 最终

17、得到一个可用于乳腺癌肿瘤微环境体内体外研究的新型生物标志物， 为进一步研 究细胞间物质转移机制提供了有力工具， 同时也给癌症的诊断和治疗方案提供新的支持和 契机。 0008 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点， 提供了一种稳定分泌近红外荧光标 记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法， 其包括如下步骤： 0009 1)编码外泌体标记蛋白CD63基因的获得： 0010 从人乳腺癌MDA-MB-231细胞中提取总RNA进行逆转录得到cDNA， 用带XbaI和ClaI 酶切位点， 以及Linker序列的引物进行PCR扩增得到目的基因片段CD63-Linker； 0011 2)重组质粒载体的构建： 001

18、2 步骤1)得到的所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-iRFP682经T4DNA连接酶作用得 到重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-iRFP682； 0013 3)重组腺相关病毒的制备： 0014 使用所述重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-iRFP682和辅助质粒体外共转染AAV- 293细胞， 包装重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682； 0015 4)稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备： 0016 使用所述重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682和辅助腺相关病毒共感染 人乳腺癌MDA-MB-23

19、1细胞， 通过荧光筛选获得稳定分泌近红外荧光蛋白标记的外泌体的人 乳腺癌MDA-MB-231细胞株； 0017 5)近红外荧光标记人乳腺癌MDA-MB-231细胞的外泌体提取及鉴定 0018 采用分步离心法从步骤4)标记成功的MDA-MB-231细胞培养上清液中提取iRFP682 说明书 2/6 页 5 CN 105624192 A 5 标记的外泌体并进行鉴定。 0019 优选的是， 其中， 所述步骤5)中分步离心法的步骤为： 0020 首先将所述细胞培养上清液在4条件下依次经2000g离心15min、 5000g离心 15min及12000g离心30min去除细胞碎片， 得第一上清液； 00

20、21 其次将所述第一上清液使用孔径不大于0.2 m的膜过滤后， 于4、 12000g条件下 离心120min， 得到外泌体粗沉淀； 0022 最后用PBS溶液重悬所述外泌体粗沉淀， 混合均匀后在4和12000g条件下离心 90min， 得到提纯外泌体， 将所述提纯外泌体使用PBS溶液重悬后置于-80条件保存备用。 0023 在外泌体的提纯过程中， 外泌体为30100nm的杯状膜结构囊泡， 易受外界压力和 温度影响， 所以无论是提取过程还是解冻使用过程， 都需控制温度在4左右。 解冻需要在 冰上进行。 此外为避免蛋白酶对外泌体的干扰， 冻存前还应加入蛋白酶抑制剂， 4可保存3 周， -80可保存

21、2-3年。 0024 优选的是， 其中， 所述步骤5)中iRFP682标记的外泌体鉴定的方法为： 使用western blot鉴定所述外泌体的膜表面蛋白， 通过透射电镜观察所述外泌体结的构， 以及通过SIM结 构光照明超分辨荧光显微镜观察外泌体的荧光标记。 0025 优选的是， 其中， 所述Linker序列为： ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg， 既能保证近红外荧光蛋白iRFP682与 外泌体表面标志CD63融合稳定的进行表达， 又不会影响两者各自的生物学活性。 0026 优选的是， 其中， 步骤3)的所述辅助质粒为pDG质粒， 其中所

22、述重组质粒载体pAAV- CD63-Linker-iRFP682可提供AAV-293病毒所必须的ITR序列， 辅助质粒pDG可提供AAV-293 重组复制、 包装病毒外壳等所必须的Rep和Cap基因， 从而包装携带重组腺相关病毒rAAV- CD63-Linker-iRFP682。 0027 优选的是， 其中， 所述辅助腺相关病毒为rAAVSVAV2， 以提高外源基因的整合效率。 0028 优选的是， 其中， 步骤2)所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-iRFP682的摩尔比例为 25， 以利于重组质粒载体的形成。 0029 优选的是， 其中， 步骤4)所述所述重组腺相关病毒与所述人乳

23、腺癌MDA-MB-231细 胞数目的比例是30006000， 以保证感染的效率。 0030 本发明至少包括以下有益效果： 0031 本发明制备的基因工程化乳腺癌细胞株能够稳定分泌近红外荧光蛋白iRFP682标 记的外泌体， 并通过分步离心的方法对近红外标记外泌体进行了有效的提纯， 利用外泌体 的独特功能及近红外荧光蛋白在体内体外示踪的优越性， 可用做乳腺癌肿瘤微环境体内体 外研究的新型生物标记物， 为进一步研究细胞间物质转移机制提供了有力工具， 同时也在 癌症的诊断和治疗方案中具有重要的应用价值。 0032 本发明的其它优点、 目标和特征将部分通过下面的说明体现， 部分还将通过对本 发明的研究

24、和实践而为本领域的技术人员所理解。 附图说明 0033 图1为本发明制备得到的稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的SIM 结构光照明超分辨荧光显微成像； 说明书 3/6 页 6 CN 105624192 A 6 0034 图2为本发明提纯后外泌体膜表面标志性蛋白的Westernblot检测图谱； 0035 图3为本发明提纯外泌体的TEM高分辨透射电镜图； 0036 图4为本发明提纯外泌体的SIM结构光照明超分辨荧光显微成像； 0037 图5说明的是标记成功的MDA-MB-231细胞外泌体的分步离心提取过程。 具体实施方式 0038 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技

25、术人员参照说明书文 字能够据以实施。 0039 应当理解， 本文所使用的诸如 “具有” 、“包含” 以及 “包括” 术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。 0040 在本发明的一种实现形式中， 提供了稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细 胞株的制备方法， 其包括如下步骤： 0041 1)外泌体标记蛋白CD63基因的获得 0042 MDA-MB-231细胞贴壁培养在含10胎牛血清的L-15培养基中， 置于37， 5CO2 的饱和湿度培养箱中。 当细胞密度达到80以上时(不超过1107)， PBS清洗两遍， 用胰蛋 白酶消化液(0.25Trypsin， 0.02EDTA)消化23

26、min， 900r/min离心5min， 收集细胞沉 淀， 根据异硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)法提取总RNA， 再进行逆转录， 反应体系： 10RTMix 2 l， 1SuperpuredNTPs(2.5mMeach)2l， Oligo-(dT)152l， QuantReverse Transcriptase1 l， 模板RNA1 l， 加RNase-Free水至20 l。 扩增条件： 37、 60min。 胶回收 cDNA， 以cDNA为模板， 利用基因上下游引物扩增含限制性内切酶XbaIClaI位点以及linker 序列的CD63基因， 胶回收产物， 与pMD-18T载体16连接过夜，

27、 转化TG1感受态菌， 挑阳性单 克隆菌于含氨苄的LB培养基中， 在37恒温摇床(200r/min)上培养16h， 抽提质粒， 经XbaI 和ClaI酶切鉴定后， 送交上海生工生物工程技术有限公司测序比对。 0043 2)重组融合表达质粒载体的构建及鉴定 0044 按照标准的分子克隆方法构建pAAV-CD63-Linker-iRFP682重组质粒。 取鉴定正确 的pMD-18T-CD63质粒， 经Cla 和XbaI双酶切， 胶回收776bp的片段； 活化扩增pAAV-iRFP682 质粒， 转化大肠杆菌SURE2感受态， 涂布氨苄青霉素抗性平板， 挑阳性单克隆菌于氨苄青霉 素抗性的LB培养液中

28、， 37恒温摇床200r/min培养16小时， 抽提质粒备用。 鉴定正确pAAV- iRFP682质粒骨架经Cla和XbaI双酶切， 胶回收5559bp片段； 质粒骨架pAAV-iRFP682 (5559bp)和CD63-Linker(776bp)目的基因片段(摩尔比为1:3)在T4DNA连接酶作用下， 16 连接反应4h， 转化到感受态Sure-2中， 挑取阳性克隆扩增， 提取并纯化质粒， 得到重组质粒， 酶切后进行电泳和测序鉴定， 获得pAAV-CD63-Linker-iRFP682重组质粒。 0045 3)重组腺相关病毒的制备 0046 接种AAV-293细胞在含10FBS的DMEM培养

29、基中贴壁培养， 置于37， 5CO2的培 养箱中， 48小时内让细胞密度达到80， 用PBS清洗两遍细胞表面， 用胰蛋白酶消化液 (0.25Trypsin， 0.02EDTA)消化3min， 900rpm离心5min， 加入适量培养基重悬后， 以1： 3 的比例传代继续培养， 取对数生长期细胞消化传代至15cm培养皿中继续培养， 培养24h细胞 密度达70以上， 用PEI转染试剂共转染pAAV-CD63-Linker-iRFP682重组质粒和pDG质粒， 包装重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682。 采用氯仿沉淀法纯化并浓缩病毒， 荧光 说明书 4/6 页 7 CN 1

30、05624192 A 7 定量PCR测定rAAV-CD63-Linker-iRFP682重组病毒滴度为81010vg/mL。 反应体系： SybrGreenqPCRMasterMix(2)10uL， ForwardPrimer(10mol/L)1uL， Reverseprimer (10mol/L)1uL， Template1uL， 加ddH2O至20uL.扩增条件(三步法)： 94、 5min， 94、 10s， 60、 30s， 72、 30s， 30cycles。 0047 4)rAAV病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞以及荧光筛选 0048 MDA-MB-231细胞贴壁培养在含1

31、0胎牛血清的L-15培养基中， 置于37， 无CO2的 饱和湿度培养箱中.当细胞密度达到80以上时， 进行消化传代， 通过计数以每孔内105个 细胞接种于24孔板， 37培养24h至完全贴壁。 在辅助腺相关病毒rAAVSVAV2的辅助作用下， 以重组腺相关病毒拷贝数/细胞个数为5000的比例感染上述贴壁的MDA-MB-231细胞， 并在 倒置荧光显微镜上检测荧光蛋白的表达。 将单细胞克隆至96孔板， 筛选出稳定表达iRFP682 的MDA-MB-231细胞株。 参照图1， 标记成功的MDA-MB-231细胞膜发近红外荧光， 且外泌体产 生或密集的地方也有近红外荧光。 0049 5)标记成功的M

32、DA-MB-231细胞外泌体的提取 0050 参照图5， 采用分步离心法提取外泌体。 外泌体分步离心提取方法如下： 首先将所 述细胞培养上清液在4条件下依次经2000g离心15min、 5000g离心15min及12000g离心 30min去除细胞碎片， 得第一上清液； 0051 其次将所述第一上清液使用孔径不大于0.2 m的膜过滤后， 在4和12000g条件下 离心120min， 得到外泌体粗沉淀； 0052 最后用1PBS溶液重悬所述外泌体粗沉淀， 混合均匀后在4和12000g条件下离 心90min， 得到提纯外泌体， 将所述提纯外泌体使用1PBS溶液重悬后置于-80条件保存 备用。 00

33、53 6)标记成功的MDA-MB-231细胞外泌体的鉴定 0054 参照图2， 分别取10 g和5 g经步骤5)提纯后的分泌体， 在Westernblot试验中用 兔抗人CD63单克隆抗体检测提纯后外泌体膜表面标志性蛋白， 同时用标记成功的MDA-MB- 231细胞裂解液做阳性对照， 检测出特异的CD63蛋白条带， 其中图中的(a)、 (b)和(c)分别为 所述阳性对照、 10 g和5 g提纯外泌体对应的条带。 0055 参照图3， 通过TEM高分辨透射电镜观察提纯外泌体发现30-150nm大小的圆形囊 泡， 均匀分布在铜网上。 0056 参照图4， 通过SIM结构光照明超分辨荧光显微镜观察提

34、纯外泌体发现提纯后的外 泌体发出强烈的近红外荧光信号。 0057 如上所述， 本发明制备的基因工程化乳腺癌细胞株能够稳定分泌近红外荧光蛋白 iRFP682标记的外泌体， 然后利用westernblot、 TEM高分辨透射电镜和SIM结构光照明超分 辨荧光显微镜对提取近外泌体进行鉴定， 说明分步离心的方法可对近红外标记外泌体进行 有效的分离提纯， 利用外泌体的独特功能及近红外荧光蛋白在体内体外示踪的优越性， 可 用做乳腺癌肿瘤微环境体内体外研究的新型生物标记物， 为进一步研究细胞间物质转移机 制提供了有力工具， 同时也在癌症的诊断和治疗方案中具有重要的应用价值。 0058 这里说明的设备数量和处

35、理规模是用来简化本发明的说明的。 对本发明的稳定分 泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备的应用、 修改和变化对本领域的技术人员 来说是显而易见的。 说明书 5/6 页 8 CN 105624192 A 8 0059 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用。 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改。 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。 说明书 6/6 页 9 CN 105624192 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 105624192 A 10 图3 图4 说明书附图 2/3 页 11 CN 105624192 A 11 图5 说明书附图 3/3 页 12 CN 105624192 A 12