1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710547858.3 (22)申请日 2017.07.06 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 王凯娟董凯艳王轩智高甚方 王凯红闫雅丽张叶尹晶晶 (74)专利代理机构 郑州铭晟知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 41134 代理人 郭丽娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因 rs579501多态性的方法 (5
2、7)摘要 本发明公开了用BanII鉴定人胃癌ZNF33B- 2:1基因rs579501多态性的方法， 包括以下步骤： 提供待测人基因组DNA； 提供扩增人LNCRNA- ZNF33B-2:1基因多态性rs579501位点附近序列 的上游引物和下游引物， 以所述待测人基因组 DNA为模板， 进行PCR扩增反应， 获取扩增产物； 使 用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切， 获取 相应的酶切产物； 对酶切产物进行电泳， 以判定 人LNCRNA-ZNF33B-2:1基因多态性rs579501位点 的各基因型。 本发明提供了一种操作简单、 成本 低、 适 用范围 广泛的 检 测人胃 癌易感基因 LNCR
3、NA-ZNF33B-2:1多态性rs579501的方法。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图4页 CN 107365837 A 2017.11.21 CN 107365837 A 1.用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因rs579501多态性的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： （a） 提供待测人基因组DNA； （b） 提供扩增人LNCRNA-ZNF33B-2:1基因rs579501位点附近序列的上游引物和下游引 物， 以步骤 （a） 所述待测人基因组DNA为模板， 利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应， 获取扩增产物； （c） 使用限制性内切酶BanII对步骤 （
4、b） 所得扩增产物进行酶切， 获取相应的酶切产物； （d） 将步骤 （c） 所得酶切产物采用3%的琼脂糖凝胶进行电泳， 以判定LNCRNA-ZNF33B-2: 1基因多态性rs579501位点的各基因型； 其中， 所述上游引物其3 末端倒数第一位碱基与多态rs579501碱基相邻一个碱基， 倒 数第三位碱基为错配碱基G， 以便在扩增产物中与多态C等位基因形成GRGCYC结构。 2.根据权利要求1所述的用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因rs579501多态性的方法， 其特征在于， 步骤 （b） 所述上游引物序列： 5 -CCTCAGTTTGGGAATTCAGTG-3 ， 下游引物序列
5、： 5 -AAGCAAGCAGGCGAAGAA-3 。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107365837 A 2 用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因rs579501多态性的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因 rs579501多态性的方法。 0002 背景技术 0003 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)， 是指DNA序列中单个 核苷酸变异， 包括碱基替代、 插入或缺失而引起的基因多态性。 SNP在人类基因组分布广泛， DNA序列编码区SNP可以调控蛋白质
6、的结构的形成过程进一步对其功能产生影响， 同时SNP 可影响剪切产生不同的转录本。 较常见的单核苷酸多态性位点的检测方法包括聚合酶链式 反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)， 等位基因特异扩增发 （AS-PCR） ， Taqman探针 技术和测序等方法。 0004 PCR-RFLP分析技术是在PCR技术基础上发展起来的， 是一种快速、 简便、 准确的检 测SNP基因型的经典方法。 其原理是： 限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp)， 并在特异位点进行切割的酶类。 酶切位点的特异性意味着对特定等位基因的完全消化会产 生同样的片段序列。 发生点突变时， 如果DNA碱基
7、置换正好发生在某种限制性内切酶识别位 点上， 使得酶切位点增加或消失， 从而产生不同大小和数目的酶切片段。 利用这一酶切性质 的改变， PCR特意扩增包含剪辑置换的DNA片段， 经限制酶切割， 再利用琼脂糖凝胶电泳分离 酶切产物， 比较产物的片段带型即可是否有SNP的产生。 该方法的优点在于快速简单， 终点 判断准确。 但其主要缺点在于待测多态位点需要与某一酶切位点相关， 因此酶的选择具有 局限性， 并不是所有的SNP位点有相应的酶切位点， 且部分内切酶价格昂贵， 实验成本高。 等 位基因扩增法(AS-PCR) 则不需要限制性内切酶和连接酶。 由于PCR反应过程中的引物延伸 是从3 端开始的，
8、 如果这个碱基能与模板互补， 则引物能不间断延伸， PCR正常进行， 得到特 定长度扩增带， 反之则不能延伸， 所以只要将突变或正常等位基因所不同的那个碱基安排 在3 最末端， 用含某一突变序列的引物进行PCR， 通过鉴定是否有特异性扩增带来判定有无 突变。 这种方法的主要优点是快速， 不依赖连接片段的限制酶位点。 但其缺点是错配延分辨 率低， 点突变检出率不稳定。 Taqman荧光探针法是一种新型高效准确的基因分型方法， 其优 点是检测灵敏度高， 分型准确。 但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤， 成本较高。 0005 LNC-ZNF33B-2:1(Long Non-Protein Codin
9、g RNA, Zinc Finger33B-2:1)属于长 链非编码RNA， 位于人类染色体10。 目前尚未发现LNC-ZNF33B-2:1及rs579501与疾病关联的 文献报道， 目前， 高通量芯片及测序技术为发现和筛选疾病相关差异表达的lncRNA提供了 有力的工具， 基于中国人群的全基因组关联研究 （Genome-wide Association Study, GWAS） 也证实lncRNA基因遗传变异与胃癌肿瘤易感性存在显著关联， LNC-ZNF33B-2:1是在 GEO数据库中基于中国人群的胃癌相关芯片数据 （GSE50710,GSE53137， GSE58828） 中筛选出 来的
10、差异表达的胃癌相关lncRNA. LNCRNA-ZNF33B-2:1基因 rs579501位点多态性在人群中存在三种基因型： CC型 （人基 说明书 1/8 页 3 CN 107365837 A 3 因组rs579501多态位点的两个等位基因碱基均为C） ， AC型 （人基因组rs579501多态位点的 两个等位基因碱基分别为A和C） 和AA型 （人基因组rs579501多态位点的两个等位基因碱基 均为 A） （美国 国 立 卫 生 研究院 国 立医 学图 书 馆生 物 信息技 术中 心 ， h t t p:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov） 。 0006 目前人LNCRNA-
11、ZNF33B-2:1基因多态rs579501的鉴定常采用PCR-RFLP方法。 但是 目前鉴定人LINCRNA-ZNF33B-2:1基因多态rs579501时常使用的限制性内切酶价格较高 （关 于部分内切酶的参考价格可参考后面的表1） ， 实验成本高， 难以在实验室中普及使用。 0007 因此， 本领域存在对操作简单， 成本低， 适用范围广的新型检测SNP方法的需求。 发明内容 0008 为了克服现有技术中存在的缺陷， 本发明提供一种操作简单、 成本低、 适用范围广 泛的用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因rs579501多态性的方法。 0009 为实现上述目的， 本发明所采用的技术
12、方案具体如下： 用BanII鉴定人胃癌ZNF33B-2:1基因rs579501多态性的方法， 包括以下步骤： （a） 提供待测人基因组DNA； （b） 提供扩增人LNCRNA-ZNF33B-2:1基因rs579501位点附近序列的上游引物和下游引 物， 以步骤 （a） 所述待测人基因组DNA为模板， 利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应， 获取扩增产物； （c） 使用限制性内切酶BanII对步骤 （b） 所得扩增产物进行酶切， 获取相应的酶切产物； （d） 将步骤 （c） 所得酶切产物采用3%的琼脂糖凝胶进行电泳， 以判定LNCRNA-ZNF33B-2: 1基因多态性rs579501位点的
13、各基因型； 其中， 所述上游引物其3 末端倒数第一位碱基与多态rs579501碱基相邻一个碱基， 倒 数第三位碱基为错配碱基G， 以便在扩增产物中与多态C等位基因形成GRGCYC结构。 0010 优选的， 步骤 （b） 中所述上游引物序列： 5 -CCTCAGTTTGGGAATTCAGTG-3 ， 下游引物 序列： 5 -AAGCAAGCAGGCGAAGAA-3 。 0011 本发明题目中的ZNF33B-2:1基因， 即为本发明内容中提到的LNCRNA-ZNF33B-2:1 基因。 0012 本发明的有益效果是： 本发明针对使用CRS-PCR鉴定LNCRNA-ZNF33B-2:1rs57950
14、1多态性， 对传统PCR-RFLP法 进行改进， 采用创造酶切位点法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)， 利用引物碱 基错配技术设计检测LNCRNA-ZNF33B-2:1多态性rs579501， 由于这种方法应用了引物3 端 错配技术， PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作， 因此在实际运用中具有 很大的灵活性， 且检测方法简单易行， 是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的较好方法， 并且克服了传统PCR-RFLP法内切酶选择余地小， 价格昂贵， 实验成本高等缺点； 本发明的技 术关键点为设计出LINCRNA-ZNF339多态性rs57950
15、1的上下游引物， 上游引物序列： 5 - CCTCAGTTTGGGAATTCAGTG-3 ， 下游引物序列： 5 -AAGCAAGCAGGCGAAGAA-3 以及限制性内切 酶BanII的使用； 总之， 本发明建立的LNCRNA-ZNF33B-2:1多态性rs579501基因分型方法简 单、 快速、 安全、 准确、 灵敏度高。 本发明提供了一种操作简单、 成本低、 适用范围广泛的检测 人胃癌易感基因LNCRNA-ZNF33B-2:1多态性rs579501的方法， 提供此方便、 快捷的检测人胃 说明书 2/8 页 4 CN 107365837 A 4 癌易感基因LNCRNA-ZNF33B-2:1
16、多态性rs579501的方法有望预测胃癌的易感性， 可用于临 床的早期诊断。 附图说明 0013 图1是PCR扩增反应程序； 图2是LNCRNA-ZNF33B-2:1rs579501位点的电泳图谱； 图3是LNCRNA-ZNF33B-2:1rs579501位点AA基因型测序图谱(反向测序)； 图4是LNCRNA-ZNF33B-2:1 rs579501位点AC基因型测序图谱(反向测序)； 图5是LNCRNA-ZNF33B-2:1 rs579501位点CC基因型测序图谱(反向测序)。 具体实施方式 0014 下面结合附图与实施例进一步说明本发明的技术方案。 0015 本发明的方法可以通过引物上的错
17、配碱基将SNP附近的序列改变为可被预先确定 的限制性内切酶识别的序列。 因此， 可以克服传统的PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂贵 内切酶的缺陷， 进而大大降低了检测SNP的成本。 具体而言： 由于在该上游引物序列中倒数 第一位碱基为错配碱基G(该碱基在人LNCRNA-ZNF33B-2:1基因序列中的相应位置为A） ， 因 此错配后PCR产物中多态附近序列由GTAAGCCC更改为GTGAGCCC。 因此扩增产物中C等位基因 片段可被识别GRGCYC序列的限制性内切酶识别 （即C等位基因片段可被内切酶切开） ； 进而， 可以根据片段切开情况来判断多态基因型。 更具体地， 经序列分析可知， 基
18、因原始序列中A/ C多态可由表1中前两种内切酶识别。 如通过碱基错配PCR将多态性位点前面第五位碱基A改 变为G， 则该多态为C等位基因经PCR扩增后包含GAGCCC序列可被识别GRGCYC序列的限制性 内切酶BanII识别， 而A等位基因不能切开。 0016 经序列分析发现， 检测该A/C多态的方法可使用表1中的三种酶， 其中表中前两种 酶价格昂贵， 且酶切效果不理想。 在采用创造酶切位点法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR) 对上游引物序列中倒数第一位碱基错配为G后， PCR产物中多态附近序列生 成GTGAGCCC序列， 从而可被限制性内切酶BanI
19、I识别。 由于识别特定位点的限制性内切酶 BanII适用范围广， 价钱较为经济， 进而降低了检测SNP的成本。 因此， 综合考虑简单操作性 与经济实用性， 限制性内切酶BanII是不二选择。 0017 表1中提供的限制性内切酶的价格从NEB公司 （http:/www.neb-） ， 限制性 内切酶的选择从WatCut限制性内切酶分析软件上获取 （http:/watcut.uwaterloo.ca/） ， 以此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。 0018 表1 几种限制性内切酶识别序列及其价格 内切酶识别序列价格 Van91ICCAN4NTGG目前无售 Sau96IGGNCC619元/100
20、0U Bsp1286IGDGCHC639元/500U BanIIGRGCYC669元/2000U ApoIRAATTY719元/1000U 在本发明的实施方案中， 上游引物和下游引物的设计采用Primer6.0软件进行， 设计的 说明书 3/8 页 5 CN 107365837 A 5 原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、 特异度以及扩增效率的影响。 按照碱基互补配对的 原则设计引物， 引物长度一般在1530碱基之间， 过长或短均会造成特异性差， 过长还会导 致其延伸温度大于74， 不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 引物GC含量在40%60%之间， Tm值 最好接近72， GC含量过高或过
21、低都不利于引发反应。 碱基要随机分布， 引物自身及引物之 间不应存在互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。 引物5 端和中间 G值应该相对较高， 而3 端G值较低。 扩增产物的单链不能形成二级结构。 引物应具有特 异性， 引物设计完成以后， 应对其进行BLAST检测， 以确保其与其它基因不具有互补性。 0019 最终上游引物由选自下列的核苷酸序列构成： CCTCAGTTTGGGAATTCAGTG。 下游引物 由选自下列的核苷酸序列构成： AAGCAAGCAGGCGAAGAA。 0020 上游引物和下游引物的设计主要考虑引物对PCR扩增的灵敏度、 特异度和扩增效 率的影响。 通
22、常按照碱基互补配对原则设计引物， 引物与模板的序列要紧密互补。 引物长度 为15-30bp， 过短或过长可导致特异性差， 过长亦会导致其延伸温度大于74而不利于PCR 反应。 下游引物在其3，末端倒数第三位含有错配碱基T， 以便在扩增产物中与多态C等位基 因形成GTGAGCCC结构， 从而可以被BanII内切酶识别。 扩增产物总长度为264bp.扩增产物如 下： CCTCAGTTTGGGAATTCAGTGAGCCMAATATTGTATCCTTATTATTAGTTATATAGAACTATGCCTTAGACTTT GTTAGAAACTTCTGCTTCAGCTTGACTGACTCATTTTCCATT
23、TCTGGTTGTACAAAATGAACTGACACTTTAATGCT GTGGCCACCTTTAAATAAAGTACAATGTGACAAAAAAATACAAATGTTTTCAGAGATAAATGCATTCTTTGACATCT GAGGTTACAGCAAATCTATTCTTCGCCTGCTTGCTT 下划线部分分别为上游引物和下游引物， 第26位bpM代表A/C多态即SNP位点rs579501。 第21位bp为错配后的碱基G(原为碱基A)。 该长为264bp的扩增产物经限制性内切酶BanII酶 切后可产生264bp， 239bp （该片段上游序列相比下游序列由于BanII酶切产生的粘性末端增
24、加3个单链碱基） ， 25bp （该片段上游序列相比下游序列由于BanII酶切产生的粘性末端减少 3个单链碱基） 共三种片段类型。 基因型判定结果： AA野生基因型， 长为264bp一条带； AC杂合 基因型， 长为25bp， 239bp及264bp三条带； CC突变基因型， 25bp及239bp两条带。 0021 凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳， 琼脂糖 ( Agarose ) 是 一种线性多糖聚合物， 系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。 当琼脂糖溶液加热到沸点后 冷却凝固便会形成良好的电泳介质， 其密度是由琼脂糖的浓度决定的， 可用于DNA片段的电 泳。 聚丙烯酰胺凝胶主要
25、有两种方式： 一是用于分离和纯化双链 DNA片段的非变性聚丙烯 酰胺凝胶， 二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。 但综合考虑实用性、 便利性以及经济性， 使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。 在本发明中， 引物扩增条件 如图1所示， 目的扩增产物使用限制性内切酶BanII3U水浴锅中酶切6-14h。 酶切产物采用3% 的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳， 在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型， 杂 合基因型以及突变纯合基因型。 0022 在本发明的具体实施方案中， 本发明检测人胃癌LNCRNA-ZNF33B-2:1基因多态 rs579501的具体步骤如下： （l） 提取待
26、测人基因组DNA模板， 所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因 组模板。 0023 （2） PCR扩增基因组DNA， 对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增， 获得含多态附近序 列的PCR产物。 说明书 4/8 页 6 CN 107365837 A 6 0024 （3） 对PCR扩增产物用限制性内切酶BanII进行酶切反应， 得到酶切产物； （4） 酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳， 在紫外灯照射下根据不同的条带判断 野生纯合基因型， 杂合基因型以及突变纯合基因型。 0025 下面对上述各个主要步骤进行详细描述： （1） 引物设计与合成 碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获
27、取， 在CHIP网站上进行核对， 确定LNCRNA- ZNF33B-2:1多态位点碱基变异数据. 含LNCRNA-ZNF33B-2:1rs579501的部分基因序列如下： CCAAGGTGGCAGCGCTGAGCTGACCACGCCACGGACCATAGAGTGGGAGCCTTTCCTGCCCCCTTAACCGCAG CTAACATCAAAAGCACTGGTATGGGCTGTCTAACTGGAACCTGAGTTGGTCTTTGTAATTACGATTCTTTTGGGTTT ATTTTGCCAGTTCATTATCCACCCCCCTGAAATCAGGCCTCCCAAATTTAGCAGGTGCTGGG
28、GAGGACCCCAGGGAG TGGCTTGTGGGGGCTAGCTGGTGAAACTACCCTTTCCTTTCTGTTCTATGAGTGTGATGGTGTTTGAGAAATATGGG GCTATGGTTCAGGCGCACTTCACATGTGCAAAGATGGAGAAAGCACTCACCTGCACATTTAGGCTCAGAATATTGAT TGAAACATTTTGAAATATCAAAAATAAAATGTTATTTTTAAAGTTTCTCTGAGATTTCGCTTAAGTTTTGGTAGATA TTCTTAAATTTTAGTGACCTCAGTTTGGGAATTCAGTGAGCCMAATATTG
29、TATCCTTATTATTAGTTATATAGAACT ATGCCTTAGACTTTGTTAGAAACTTCTGCTTCAGCTTGACTGACTCATTTTCCATTTCTGGTTGTACAAAATGAACT GACACTTTAATGCTGTGGCCACCTTTAAATAAAGTACAATGTGACAAAAAAATACAAATGTTTTCAGAGATAAATGC ATTCTTTGACATCTGAGGTTACAGCAAATCTATTCTTCGCCTGCTTGCTTGTTCAGAGTTGTAATATTTGCTTTGGT GTAGAGCTGAAGACACAAATTGGTAACCAGTGGAATTA
30、TATGGCCTCAGACTTATTTATTCTCATCATTTGTTTCGC TCATATGCAAATTTATTCTGTACCAGGAAATGTCAATTTAATTATATTCTACAGTACACAGTGAATCATGTAAAGTT AGTCAAGTTGTAAATACGCTAGAACCATATAAGCTCACAAAAATATATCAGCGCATGATGGGTAAGTGACCTTCCCC TGAG 基因序列的第501个碱基M代表了A/C多态， 即为rs579501的多态性位点。 根据rs579501 的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计出的最优） 上下游引物
31、如 下； 上游引物序列： 5 -CCTCAGTTTGGGAATTCAGTG-3 下游引物序列： 5 -AAGCAAGCAGGCGAAGAA-3 。 0026 其中上游引物序列中倒数第一位碱基为错配碱基G （该碱基在人LNCRNA-ZNF33B- 2:1基因序列中的相应位置为A） ， 因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTAAGCCC或 GTAAGCCA更改为GTGAGCCC或GTGAGCCA (其中第八个碱基A/C多态位点， 第三个碱基G为错配 碱基)。 因此扩增产物中C等位基因片段可被识别GRGCYC序列的限制性内切酶BanII识别 （即 C等位基因片段可被内切酶切开） 。 进而， 可以根
32、据片段切开情况来判断多态基因型。 0027 按照上游引物序列和下游引物序列合成引物， 引物的合成可以采用本领域通用的 方法 （如固相合成法） ， 亦可委托生物公司合成并检测上游和下游引物。 0028 （2） 制备PCR扩增体系： 2Taq PCR Mix7.5 l， 双蒸水5.9 l， 上游引物0.3 l下游 引物0.3 l以及模板DNA1.0 l， 充分混匀后即得15.0 lPCR扩增反应体系； 按照第一阶段： 94 变性5min， 第二阶段共包括35个循环三个步骤， 首先94变性30s， 56.1退火45s， 最后 72延伸45s， 第三阶段： 72延伸5min， 最终4储存以备用， 即得
33、长为264bp的PCR扩增产 物。 扩增后的产物序列为： 说明书 5/8 页 7 CN 107365837 A 7 CCTCAGTTTGGGAATTCAGTGAGCCMAATATTGTATCCTTATTATTAGTTATATAGAACTATGCCTTAGACTT TGTTAGAAACTTCTGCTTCAGCTTGACTGACTCATTTTCCATTTCTGGTTGTACAAAATGAACTGACACTTTAATGC TGTGGCCACCTTTAAATAAAGTACAATGTGACAAAAAAATACAAATGTTTTCAGAGATAAATGCATTCTTTGACATC TGAGGTTACAGC
34、AAATCTATTCTTCGCCTGCTTGCTT 下划线部分分别为上游引物和下游引物， 第26位bpM代表A/C多态即SNP位点rs579501。 第21位bp为错配后的碱基G(原为碱基A)。 0029 （3） 酶切体系： PCR反应产物5 l， 限制性内切酶0.5 l， Buffer1.0 l以及无核酸酶 纯水8.5 l共计15 l酶切体系， 于水浴锅中37酶切6-14h， 即得酶切产物。 综合考虑经济实 用性以及简单操作性最终选择BanII进行酶切鉴定。 0030 （4） 琼脂糖凝胶电泳， 确定基因多态性： 将酶切产物用3%的琼脂糖凝胶在4-10V/cm 的条件下， 电泳20-40min
35、， 至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。 对于不同的基因 型， rs579501位点不同基因型展现出不同的条带 （见图2） ， AA野生基因型， 长为264bp一条 带； AC杂合基因型， 长为264bp， 239bp及25bp三条带； CC突变基因型， 239bp及25bp两条带。 各 基因型均经测序以进一步鉴定， 测序结果 （见图3-5） 显示与现有技术测得的结果完全相同。 0031 下面是实施本发明的若干实施例： 实施例1.人外周血全血标本测定人LNCRNA-ZNF33B-2:1 rs579501多态性 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 仪器： BCD-228CH冰箱 （新飞电
36、器） ， HH-2数显恒温水浴锅 （华峰仪器） ， SmartGe凝胶成像 仪 （北京赛智创业） ， GT9612梯度PCR仪 （百泰克生物） ， WD900SL23-2 型号微波炉 （格兰仕电 器） ， DG-300C 型电泳仪 （鼎国昌盛生物） 等。 0032 试剂： NEP004-1 DNA提取试剂盒 （鼎国昌盛生物） ， 50 bp DNA Ladder （莱风生物） ， 2Taq PCR Mix （莱风生物） ， BanII （Thermo） ， 琼脂糖 （SIGMA） 等。 0033 1.2 引物设计 在NCBI的dbSNP数据库中， 查找LNCRNA-ZNF33B-2:1rs57
37、9501的核苷酸序列， 在引物设 计软件PrimerPremier6.0中， 设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计， 根 据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物， 其中上游引物序列中倒数第一位碱基为错配 碱基G （该碱基在人LNCRNA-ZNF33B-2:1基因序列中的相应位置为A） ， 因此错配后PCR产物中 多态附近序列由GTAAGCCC或GTAAGCCA更改为GTGAGCCC或GTGAGCCA (其中第八个碱基A/C多 态位点， 第三个碱基G为错配碱基)。 因此扩增产物中C等位基因片段可被识别GAGCCC序列的 限制性内切酶BanII识别 （即C等位基因片段可被内切酶切开）
38、 。 再将此引物与Pubmed中的 Blast序列比对功能 （http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 进行引物比对， 最终确 定的上下游引物为上游引物序列： 5 -CCTCAGTTTGGGAATTCAGTG-3 ， 下游引物序列： 5 - AAGCAAGCAGGCGAAGAA -3 。 0034 1.3限制性内切酶的选择 根据dbSNP中rs579501前六后八个位点的碱基序列， 用WatCut在线限制性内切酶分析 软件， 在线搜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息， 综合考虑其酶切特异性及经 济适用性选择最佳的限制性内切酶BanII。 0035 1
39、.4从人全血中提取待测样本的基因组DNA 说明书 6/8 页 8 CN 107365837 A 8 严格按照离心柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取人基因组DNA。 0036 l） 在1.5 ml离心管中加入300 l人血细胞后， 再加入900 l细胞裂解液混和均 匀， 在冰上放置10 min后， 在离心机中12000 rpm离心1 min， 弃上清， 再次加入900 l细胞 裂解液， 用枪吹起沉淀并混匀后， 重复上述步骤； 2） 向沉淀物中加入600 l solution B溶液， 用移液枪轻轻吹起沉淀后， 加入10 l蛋 白酶K混匀， 在70 C水浴锅中放置10 min后， 12000 rpm
40、离心5 min。 0037 3） 将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中， 再向新的离心管中加入500 l 无水乙醇， 期间可能会出现絮状沉淀物， 该絮状物即为DNA； 4） 将混匀的液体转入离心柱中 （若一次转不完， 可分次转入） ， 室温静置2 min， 再12000 rpm离心1 min， 弃废液； 5） 加入700 l已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液， 室温静置2 min， 12000 rpm离心1 min， 弃废液； 6） 加入700 l 已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液， 室温静置2 min， 12000 rpm离心1 min， 弃废液； 7）
41、 加入500 l solution D漂洗液， 12000 rpm离心1 min， 弃废液； 8） 再次离心2 min， 将离心柱置于新的编过号的离心管中， 敞口放入37 C恒温箱内10 min直至无明显乙醇味； 9） 在硅基质膜中央加入已经预热到65 C的solution E 100 l， 室温放置5 min， 12000 rpm离心1 min， 重复上述步骤一次， 终离心后的液体即为提取出的基因组DNA； 10） 吸取2l提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度计测定其浓度和纯 度。 0038 2结果 2.1 PCR扩增 （1） 根据提取人基因组DNA的浓度，
42、将研究对象的DNA进行稀释， 使终浓度为20 g/l。 0039 （2） PCR扩增体系为2Taq PCR Mix 7.5 l、 上游引物和下游引物各0.3 l、 模板 DNA 1.0 l， 最后用双蒸水补充总体积至15 l。 0040 （3） PCR反应条件： 第一个阶段为预变性阶段， 94/5 min； 第二个阶段包括3个步 骤共35个循环， 依次设置为94/35 s、 58退火时间45 s、 72/30s； 第三个阶段72/5 min。 0041 2.2酶切反应 酶切体系为PCR扩增产物5 l、 限制性内切酶0.5 l、 Buffer 1.0 l， 最后用双蒸水补 充总体积至15 l。
43、混匀后置于水浴锅中37水浴4-16小时。 0042 2.3基因型的判定 表2 rs579501位点基因型判定 说明书 7/8 页 9 CN 107365837 A 9 实施例2. 人胃癌组织标本测定人LNCRNA-ZNF33B-2:1rs579501多态性 与实施例1的步骤基本相同， 只是采用下面的方法从胃癌组织标本中提取DNA作为待测 DNA。 0043 使用手术切除胃癌组织， 酚-氯仿法提取胃癌组织基因组DNA作为待测DNA。 0044 1） 将胃癌组织块解冻， 用生理盐水洗去血污， 剪取0.1g左右的组织碾磨， 加入1ml 的灭菌水， 颠倒混匀， 10000转离心10min， 弃上清。
44、管底应该有沉淀。 重复两次 2） 加入200ul的DNA裂解液， 5ul的蛋白酶K混匀， 55过夜消化。 0045 3） 消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液 （1:1） ， 剧烈震荡， 使其变成奶咖色。 12000转离心10 min。 0046 4） 取上清， 注意不要洗到中间介质以及下层液体。 加入等体积的氯仿， 颠倒混匀。 12000转离心10 min。 0047 5） 取上清， 注意不要洗到中间介质以及下层液体。 加入10分之一的醋酸钠以及2.5 倍的无水乙醇， 颠倒混匀。 0048 6） 12000转离心10 min。 弃上清。 0049 7） 加入1ml 70%乙醇， 使其白色沉淀悬
45、浮， 颠倒混匀数次。 12000转离心10 min。 0050 8） 弃上清， 然后室温开盖静置分钟使其乙醇挥发干净。 9） 加入灭菌水溶解DNA， 一般加入50ul灭菌水溶解 10） -20 C保存， 即得胃癌组织基因组DNA 结果： 将酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳20-40min， 至紫外灯下能分清明显的条带并 拍照鉴定。 对于不同的基因型， rs579501位点不同基因型展现出不同的条带 （见图2） ， AA野 生基因型， 长为264bp两条带； AC杂合基因型， 长为264bp， 239bp及25bp三条带； CC突变基因 型， 239bp及25bp两条带。 各基因型均经测序以进一步
46、鉴定， 测序结果 （见图3-5） 显示与现有 技术测得的结果完全相同。 0051 以上所述， 仅为本发明最佳实施方式， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明 披露的技术范围内， 可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的 保护范围内。 说明书 8/8 页 10 CN 107365837 A 10 SEQUENCE LISTING 郑州大学 用BanII鉴定人胃癌LNCRNA-ZNF33B-2:1基因rs579501多态性的方法 2017 2 PatentIn version 3.3 1 21 DNA 上游引物序列 1 cctcagtttg ggaattcagt g 21 2 18 DNA 下游引物序列 2 aagcaagcag gcgaagaa 18 序列表 1/1 页 11 CN 107365837 A 11 图1 图2 说明书附图 1/4 页 12 CN 107365837 A 12 图3 说明书附图 2/4 页 13 CN 107365837 A 13 图4 说明书附图 3/4 页 14 CN 107365837 A 14 图5 说明书附图 4/4 页 15 CN 107365837 A 15
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