一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710810591.2 (22)申请日 2017.09.11 (71)申请人 广东美格基因科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市前海深港合作 区前湾一路1A栋201室 (72)发明人 邝嘉良束文圣叶脉徐卓菲 李猛张传伦 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提 取微生物总DNA的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从生物量低且富含腐殖 质的土壤中提取微生物总DNA的方法。 本发明方 法包括

2、： (1)通过液氮对生物量低且富含腐殖质 的土壤样品进行研磨来裂解其中的微生物细胞； (2)使用DNA提取缓冲液、 蛋白酶K和20SDS在不 同温度水浴下进一步裂解微生物细胞并使蛋白 变性后， 离心； (3)在低温状态下通过异丙醇沉淀 DNA， 得到DNA粗提产物； (4)使用QIAGEN土壤DNA 提取试剂盒纯化步骤(3)所得DNA粗提产物， 得到 微生物总DNA； 其中， DNA提取缓冲液的pH为8.0， 包括0.1MNaH2PO4、 0.1MNa2HPO4、 0.1MEDTA、 0.1MTris-HCl、 1.5MNaCl和1CTAB； 蛋白酶K 的浓度为10mg/mL。 本发明方法可以

3、进行大质量 的土壤DNA高效提取， 且提取得到的DNA的纯度 高、 完整度好， 具有良好的应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 107475249 A 2017.12.15 CN 107475249 A 1.一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其特征在于， 包括 如下步骤： (1)通过液氮对生物量低且富含腐殖质的土壤样品进行研磨来裂解其中的微生物细 胞； (2)使用DNA提取缓冲液、 蛋白酶K和20SDS在不同温度水浴下进一步裂解微生物细胞 并使蛋白变性后， 离心； (3)在低温状态下通过异丙醇沉淀DNA， 得到DNA粗提产物； (4)使用QIAGE

4、N土壤DNA提取试剂盒纯化步骤(3)所得DNA粗提产物， 得到微生物总DNA； 其中， 所述DNA提取缓冲液的pH为8.0， 包括0.1M NaH2PO4、 0.1M Na2HPO4、 0.1M EDTA、 0.1M Tris-HCl、 1.5MNaCl和1CTAB； 所述蛋白酶K的浓度为10mg/mL。 2.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 步骤(1)中， 所述生物量低且富含腐殖质的土壤样品为25g。 3.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 所述步骤(1)共做三次。 4.根据权利

5、要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 步骤(2)中， 所述DNA提取缓冲液和蛋白酶K的水浴温度为37， 水浴时间为 40min。 5.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 步骤(2)中， 所述20SDS的水浴温度为65， 水浴时间为2h。 6.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 步骤(2)中， 所述离心是25下， 6000 x g离心20min。 7.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于，

6、 步骤(3)中， 所述低温为-80。 8.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 步骤(3)中， 加入异丙醇过夜沉淀DNA。 9.根据权利要求1所述从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法， 其 特征在于， 步骤(3)后， 先将异丙醇沉淀的DNA65水浴10min， 再37水浴5min， 使沉淀和共 沉淀的盐分溶解； 然后25下15000 x g离心20min， 去掉上清液， 再经70乙醇洗涤沉淀， 最 后25下15000 x g离心3min去掉乙醇， 得到的沉淀用于步骤(4)。 权利要求书 1/1 页 2 CN 1074752

7、49 A 2 一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的 方法 技术领域 0001 本发明属于基因提取技术领域， 更具体地说， 涉及一种从生物量低且富含腐殖质 的土壤中提取微生物总DNA的方法。 背景技术 0002 土壤是陆生生态系统当中最广泛分布的一种生境类型。 土壤当中含有由大量的微 生物个体所组成的微生物群落， 且这些微生物群落在陆生生态系统的生物地球化学循环中 扮演着非常重要的角色。 解析土壤微生物群落结构与功能及其动态变化， 将有助于了解陆 生生态系统的物质能量流动， 对生态过程的了解具有重要的作用。 目前能培养得到的微生 物仅占总微生物的1不到。 随着分子生物学、 基因

8、组学、 生物信息学的快速发展， 研究者不 再依赖培养手段， 而是利用免培养技术开展微生物的相关研究。 其中， 完整的、 高质量的微 生物总DNA 的获取， 是开展相关工作的首要任务。 0003 然而， 土壤的成分非常复杂， 其中不仅包含多种的盐分(无机元素)还富含大量的 有机成分(如腐殖酸和植物根系分泌物等)。 这些成分不仅抑制DNA 提取过程中所使用的试 剂(如SDS、 蛋白酶K)的作用， 影响DNA的抽提效果， 而且有机成分会吸附DNA， 导致其质量的 下降， 从而影响其后续分子水平的操作。 同时， 部分土壤当中微生物生物量很低， 需要进行 大质量的土壤DNA提取， 然而大质量的土壤提取必

9、然会引入更多的无机和有机污染物， 使得 提取的DNA 纯度急剧下降， 不能满足后续分子实验的需求。 因此， 发明一种既能满足大质量 提取又能有效提高DNA纯度和完整度的微生物总DNA提取方法十分必要。 发明内容 0004 本发明的目的在于： 克服现有方法无法提取大质量的富含腐殖质的土壤微生物 DNA， 且提取的DNA纯度和完整度不理想等问题， 提供一种可以进行大质量的土壤DNA高效提 取， 且提取得到的DNA的纯度高、 完整度好的从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物 总DNA的方法。 0005 为了实现上述发明目的， 本发明提供一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取 微生物总DNA的方法，

10、 其包括如下步骤： 0006 (1)通过液氮对生物量低且富含腐殖质的土壤样品进行研磨来裂解其中的微生物 细胞； 0007 (2)使用DNA提取缓冲液、 蛋白酶K和20SDS在不同温度水浴下进一步裂解微生物 细胞并使蛋白变性后， 离心； 0008 (3)在低温状态下通过异丙醇沉淀DNA， 得到DNA粗提产物； 0009 (4)使用QIAGEN土壤DNA提取试剂盒纯化步骤(3)所得DNA粗提产物， 得到微生物总 DNA； 0010 其中， 所述DNA提取缓冲液的pH为8.0， 包括0.1M NaH2PO4、 0.1M Na2HPO4、 0.1M 说明书 1/4 页 3 CN 107475249 A

11、 3 EDTA、 0.1M Tris-HCl、 1.5MNaCl和1CTAB； 0011 所述蛋白酶K的浓度为10mg/mL。 0012 作为本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 步骤(1)中， 所述生物量低且富含腐殖质的土壤样品为25g， 相较于现有的土 壤DNA提取试剂盒只能提取0.5g土壤样品而言， 本发明方法可提取大质量土壤样品DNA。 0013 作为本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 所述步骤(1)的液氮研磨共做三次， 使微生物细胞充分裂解。 0014 作为本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤

12、中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 步骤(2)中， 所述DNA提取缓冲液和蛋白酶K的水浴温度为37， 水浴时间为 40min。 0015 作为本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 步骤(2)中， 所述离心是25下， 6000 x g离心20min。 0016 作为本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 步骤(3)中， 所述低温为-80。 0017 作为本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 步骤(3)中， 加入异丙醇过夜沉淀DNA。 0018 作为

13、本发明从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法的一种优 选技术方案， 步骤(3)后， 先将异丙醇沉淀的DNA65水浴10min， 再 37水浴5min， 使沉淀 和共沉淀的盐分溶解； 然后25下15000 x g离心20min， 去掉上清液， 再经70乙醇洗涤沉 淀， 最后25下15000 x g离心3min去掉乙醇， 得到的沉淀用于步骤(4)。 0019 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0020 本发明通过液氮研磨的方法可最大程度上覆盖格兰仕阳性和阴性菌， 保证了微生 物群落多样性的保真度， 且可以提取大质量的土壤(一般试剂盒只能提取0.5g土壤)， 从而 获得更高

14、的DNA产量； 然后使用自行研制的DNA提取缓冲液、 蛋白酶K和SDS在不同温度下温 浴， 进一步裂解细胞并使蛋白变性； 相比于试剂盒玻璃珠破碎的方法， 本发明方法能在破碎 细胞的同时保留相对完整的DNA； 最后， 结合DNA提取试剂盒的办法既有效地纯化了DNA也能 相对节省了实验步骤和时间， 有利于大量样品的提取， 具有良好的应用前景。 附图说明 0021 下面结合附图和具体实施方式， 对本发明及有益效果进行详细说明。 0022 图1是实施例和对比例两种方法提取的总DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图， 其中， M为 marker， 1为本发明实施例提取方法提取得到的DNA， 2为对比例试剂盒提取得

15、到的DNA， 每种 使用同一样品做了两次重复。 具体实施方式 0023 为了使本发明的发明目的、 技术方案和有益技术效果更加清晰， 以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。 应当理解的是， 本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释 本发明， 并非为了限定本发明， 实施例的配方、 比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实 质性影响。 说明书 2/4 页 4 CN 107475249 A 4 0024 实施例 0025 以美国阿拉斯加实验样地中获取生物量低且富含腐殖质的土壤为样品进行实验。 0026 A.总DNA初步提取 0027 1.将5g土壤样品称取到无菌研钵中， 加入5g无菌砂。 将液氮添加

16、到研钵中以冷却 研钵和无菌沙。 0028 2.添加更多的液氮以覆盖无菌沙和样品， 并在液氮蒸发后开始研磨。 在研磨时保 持样品处于冷冻状态。 0029 3.重复上述液氮研磨步骤两次。 0030 4.将仍然冷冻的样品转移到无菌的50mL离心管中， 并立即放入-80中冷冻保存 备用。 0031 5.从冷冻箱中取出研磨后的样品。 向每个50mL管中加入16.5mL DNA提取缓冲液和 10 L蛋白酶K。 37水浴40分钟(每10分钟颠倒离心管)。 0032 6.加入1.83mL 20SDS， 65水浴2小时(每20分钟颠倒离心管)。 0033 7. 25， 6000 x g离心20分钟。 0034

17、8.转移9mL上清液至50mL橡胶离心管中。 0035 9.加入5.4mL异丙醇并至于-80中过夜沉淀DNA。 0036 10.从冷冻箱中取出异丙醇沉淀过夜后的样品， 先在65水浴10分钟， 然后在37 水浴5分钟溶解沉淀的样品， 并溶解共沉淀的盐分。 0037 11. 25， 15000 x g离心20分钟。 去掉上清液。 0038 12.用1mL冰冷的70乙醇洗涤沉淀。 轻轻旋转管子让乙醇冲洗管底， 25， 15000 x g离心3分钟。 去掉乙醇。 沉淀用于后续DNA的纯化。 0039 B.总DNA的纯化 0040 1.加入430 lbead solution(溶液储存在含有玻璃珠的管中

18、)以溶解DNA。 65水 浴5-10分钟。 0041 2. 25， 10000 x g离心2分钟。 上清液转移至2mL离心管中。 0042 3.加入250 L Solution C2， 涡旋震荡5秒， 4冰箱放置5分钟。 0043 4. 25， 10000 x g离心1分钟。 转移600 L上清液至2mL离心管中。 0044 5.加入200 L Solution C3， 涡旋震荡5秒， 4冰箱放置5分钟。 0045 6. 25， 10000 x g离心1分钟。 转移750 L上清液至2mL离心管中。 0046 7.加入1.2mL Solution C4， 涡旋震荡5秒。 0047 8.每次转移

19、675 L样品溶液至Spin filter(滤柱)中， 25， 10000 x g离心1分钟， 去掉滤液， 重复3次。 0048 9.加入650 L 100乙醇至Spin filter(滤柱)中， 25， 10000 x g离心30 秒， 去 掉滤液。 0049 10.加入500 L Solution C4至Spin filter(滤柱)中， 25， 10000 x g离心30秒， 去掉滤液， 重复两次。 0050 11. 25， 10000 x g离心2分钟(空甩)， 把滤芯转移至新的2mL离心管中。 0051 12.在滤膜上加入50 L无菌水， 常温静置5分钟。 然后25， 10000 x

20、 g 离心30秒， 收 集DNA样品。 说明书 3/4 页 5 CN 107475249 A 5 0052 对比例 0053 以美国阿拉斯加实验样地中获取生物量低且富含腐殖质的土壤为样品进行实验。 0054 使用MoBio PowerSoil DNA提取试剂盒对样品进行DNA提取， 步骤按照试剂盒说明 书进行。 0055 实施例和对比例所得结果请参见表1和图1。 0056 表1利用NanoDrop对不同提取方法的DNA进行质量和产量(回收总量)检测的结果 0057 DNA提取方法 OD260/OD280OD260/OD230DNA产量( g/g干土) 实施例 1.840.09 1.890.16

21、 2.550.11 对比例 1.580.19 1.210.34 1.070.02 0058 注： 本发明实施例的DNA提取方法利用2g土壤， 而对比例试剂盒方法只使用0.5g土 壤。 0059 OD260/OD230比值可以反映DNA中的某些污染物(如碳水化合物， 多肽， 苯酚)的含量， OD260/OD230比值越高， 污染物含量越少。 通过表1可以看出， 本发明的DNA提取方法获得的总 DNA OD260/OD280更接近1.8(纯DNA的比值)， 表明提取的DNA更为纯净， 质量更高； 而对比例的 比值低于1.6， 表明对比例提取的DNA含有更多的蛋白质污染。 最后， 实施例中DNA的单位干 重土的回收总量更高。 0060 图1主要反映了两种DNA提取方法的片段完整性， 实施例的DNA片段更完整(10K左 右)， 而对比例由于玻璃珠剧烈震荡的原因， 其DNA片段十分破碎且没有主带， 表明本发明的 DNA提取方法能获得更完整的DNA片段。 0061 上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明， 该实施例并非用以限制 本发明的专利范围， 凡未脱离本发明所为的等效实施或变更， 均应包含于本案的专利范围 中。 说明书 4/4 页 6 CN 107475249 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 107475249 A 7