一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710078834.8 (22)申请日 2017.02.14 (71)申请人 云南农业大学 地址 650000 云南省昆明市北郊黑龙潭云 南农业大学 (72)发明人 罗琼杨静王春梅刘林 王云锋张娅玲 (74)专利代理机构 成都环泰知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 51242 代理人 邓瑞 (51)Int.Cl. C12N 1/36(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54

2、)发明名称 一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种抑制侵染水稻PCD途径相 关基因上调的方法， 采用弱酸处理稻瘟菌效应蛋 白基因过表达菌株孢子； 用悬浮液喷雾接种水稻 叶片； 于不同时间点取样， 提取水稻样品总RNA； 反转录成cDNA， real-timeRT-PCR检测cDNA； 分 析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时 间点的表达。 与现有技术相比， 本发明克服了研 究非生物环境pH影响寄主-病原互作机制中， 常 借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变 化、 以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期 长和效率低的弊端， 提供了一种更为

3、简便、 有效、 准确地弱酸处理病原菌孢子、 定量检测水稻PCD 途径主要相关基因表达的方法， 为更快速准确地 进行弱酸对水稻与稻瘟病菌互作机制的研究提 供重要的实验依据。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106754614 A 2017.05.31 CN 106754614 A 1.一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子； (2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片； (3)于0h,24h,48h,72h和96h五个时间点取样， 提取水稻样品总RNA； (4)反转录成c

4、DNA， real-time RT-PCR检测cDNA； (5)分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106754614 A 2 一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法 技术领域 0001 本发明属于植物保护和生物技术领域， 尤其涉及一种弱酸抑制稻瘟菌效应蛋白基 因过表达菌株侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法。 背景技术 0002 为了成功侵入寄主， 侵染过程中， 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)在寄主的不同 组织分泌不同的蛋白。 尽管一些 “真正的” 毒性因子能成功抑制寄主防御响应， 但需要不同 的胞外分泌蛋

5、白协同起作用。 灰葡萄孢菌株的分泌组研究表明， 在pH4和pH6条件下， 灰葡萄 孢菌株培养液呈现黑色的原因是菌丝在生长过程中产生的有色次生代谢产物所致。 Louis 等人研究发现， 新月旋腔孢菌培养过程中的培养液出现淡黄色和乳白色， 以及菌丝的黑化， 是由于其除了分泌包括有色次生代谢产物外， 还伴有候选效应蛋白的分泌。 研究还表明， 黑 色素水平较高的新月旋腔孢菌株比黑色素水平较低的菌株具有更强的毒性， 黑色素和相关 次生代谢产物是新月旋腔孢菌株的毒性因子。 对定殖于寄主组织上的新月旋腔孢菌菌丝进 行观察发现， 棕黑色的色素可能是新月旋腔孢菌在高温条件下维持其毒性必需的适应性特 性。 有研究

6、发现色素合成和热激响应相关蛋白在新月旋腔孢菌定殖寄主过程中表达上调。 pH是影响真菌分泌不同效应蛋白以促进其在寄主组织内定殖的重要环境因素。 而pH是如何 影响病原菌与寄主互作过程中寄主对不同pH环境响应的抗病机制(例如SA途径、 JA途径及 PCD途径的响应)？ 目前尚未有这方面的研究报道。 发明内容 0003 本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种抑制侵染水稻PCD途径相关基 因上调的方法。 0004 本发明通过以下技术方案来实现上述目的： 0005 本发明包括以下步骤： 0006 (1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢 子；

7、0007 (2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片； 0008 (3)于0h,24h,48h,72h和96h五个时间点取样， 提取水稻样品总RNA； 0009 (4)反转录成cDNA， real-time RT-PCR检测cDNA； 0010 (5)分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。 0011 本发明的有益效果在于： 0012 本发明是一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法， 与现有技术相比， 本发 明弱酸处理病原菌孢子后喷雾接种水稻叶片对水稻PCD途径主要相关基因表达的影响。 它 克服了研究非生物环境pH影响寄主-病原互作机制中， 常借助温室设计各种弱酸处理以观 察

8、寄主表型变化、 以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端， 提供了 一种更为简便、 有效、 准确地弱酸处理病原菌孢子、 定量检测水稻PCD途径主要相关基因表 说明书 1/4 页 3 CN 106754614 A 3 达的方法， 为更快速准确地进行弱酸对水稻与稻瘟病菌互作机制的研究提供重要的实验依 据。 具体实施方式 0013 下面对本发明作进一步说明： 0014 本发明包括以下步骤： 0015 (1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢 子； 0016 (2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片； 0017 (3)于0h,24h,48h,7

9、2h和96h五个时间点取样， 提取水稻样品总RNA； 0018 (4)反转录成cDNA， real-time RT-PCR检测cDNA； 0019 (5)分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。 0020 本发明中弱酸处理稻瘟菌孢子、 稻瘟病菌孢子喷雾接种、 水稻育苗、 水稻总RNA提 取、 real-time RT-PCR及数据分析等方法均与常规相同。 0021 本发明的有益效果是直接准确地检测经弱酸处理的稻瘟菌效应蛋白基因过表达 菌株孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上， 于不同时间点取样， 提取水稻叶片总RNA， real- time RT-PCR分析受侵染水稻PCD途

10、径相关基因PR1a的表达。 克服了已有研究病菌与寄主互 作时对非生物因子响应机制时借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、 以及筛选 大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端， 最终达到为今后有目的地直接深入 开展病原菌与寄主互作时对非生物因子之一(弱酸)响应机制的研究提供重要的实验依据。 具体方法是采用弱酸处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子， 将处理后的孢子悬浮液喷 雾接种于水稻叶片上， 于不同时间点(0h,24h,48h,72h和96h)取样， 提取样品总RNA， real- time RT-PCR分析PCD途径相关的基因(PR1a和PR5)的表达量。 通过分析弱酸(pH4.6

11、,pH5.0, pH5.2,pH5.5)处理病原菌基因过表达菌株侵染水稻后对水稻PCD途径相关基因表达的影 响， 可准确快速地了弱酸处理稻瘟病菌后对其侵染水稻PCD途径相关基因的表达变化， 为有 目的地直接深入开展病原菌与寄主互作时对非生物因子之一(弱酸)响应机制的研究提供 重要的实验依据。 克服了已有研究病菌与寄主互作时对非生物因子响应机制时借助温室设 计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、 以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效 率低的弊端。 0022 实施例一： 0023 采用弱酸pH4.6处理稻瘟病菌孢子悬浮液， 将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水 稻叶片上， 28黑暗保湿24h后，

12、置于温室中进行保温保湿。 于接种0h、 24h、 48h和96h取样， TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA， 利用real-time RT-PCR检测PCD途径相关的基因 (PR1a和PR5)表达量(表1)。 0024 表1PAL和EDS1在pH4.6处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量 说明书 2/4 页 4 CN 106754614 A 4 0025 0026 实施例二： 0027 采用弱酸pH5.0处理稻瘟病菌孢子悬浮液， 将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水 稻叶片上， 28黑暗保湿24h后， 置于温室中进行保温保湿。 于接种0h、 24h、 48h和96h取样， Tri

13、zolRNA提取试剂盒提取样品总RNA， 利用real-time RT-PCR检测PCD途径相关的基因 (PR1a和PR5)表达量(表2)。 0028 表2PAL和EDS1在pH5.0处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量 0029 0030 实施例三： 0031 采用弱酸pH5.2处理稻瘟病菌孢子悬浮液， 将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水 稻叶片上， 28黑暗保湿24h后， 置于温室中进行保温保湿。 于接种0h、 24h、 48h和96h取样， TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA， 利用real-time RT-PCR检测PCD途径相关的基因 (PR1a和PR5)表达量(表3

14、)。 0032 表3PAL和EDS1在pH5.2处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量 0033 0034 实施例四： 0035 采用弱酸pH5.5处理稻瘟病菌孢子悬浮液， 将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水 稻叶片上， 28黑暗保湿24h后， 置于温室中进行保温保湿。 于接种0h、 24h、 48h和96h取样， TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA， 利用real-time RT-PCR检测PCD途径相关的基因 (PR1a和PR5)表达量(表4)。 0036 表4PAL和EDS1在pH5.5处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量 说明书 3/4 页 5 CN 106754614 A 5 0037 0038 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。 说明书 4/4 页 6 CN 106754614 A 6