1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710033721.6 (22)申请日 2017.01.17 (71)申请人 李露青 地址 315137 浙江省宁波市鄞州区云龙镇 丽云路55号 (72)发明人 李露青 (51)Int.Cl. C07K 14/435(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种抗癌活性肽变体及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种抗癌活性肽变体， 该蛋白 变体相对于野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生 长的效果。 这些变
2、体蛋白质和它们的衍生物可以 用于多种肿瘤的治疗。 权利要求书1页 说明书3页 序列表3页 CN 106589094 A 2017.04.26 CN 106589094 A 1.一种抗癌活性肽， 其氨基酸序列为SEQ ID NO： 6所示。 2.如权利要求1所述的活性肽变体在制备抑制肿瘤药物中的用途。 3.一种抗肿瘤药物制剂， 它含有权利要求1所述的活性肽变体以及药学上合适的载体。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106589094 A 2 一种抗癌活性肽变体及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体地说， 本发明涉及抗癌活性肽变体。 背景技术 0002 多 肽抗 癌药 物是
3、 近年来 抗 癌药 物研发的 热 点 。 现 有技术中 ， 专 利申 请 ZL200710035478.8从新疆穴居狼蛛粗毒中分离纯化获得的抗癌活性肽， 为24肽。 这种多肽 能诱导细胞凋亡杀灭多种癌细胞， 并能抑制癌细胞增殖， 但对正常细胞和动物毒性较弱； 同 时还可抑制低氧诱导因子HIF 转录活性， 从而抑制肿瘤组织血管再生， 有效的抑制实体瘤 生长； 其抗癌活性具有高效低毒的特点， 对于开发治疗肺癌、 肝癌、 子宫颈癌等实体瘤的药 物有着较好的应用前景。 0003 现有技术中， 为了提高多肽的活性， 针对多肽序列进行特异性的改变， 从而寻找活 性更高的变体是常规的做法。 为了进一步提高该
4、多肽的生物活性， 申请人通过大量的实验， 针对该申请获得的多肽进行了氨基酸的改变， 从而获得了比原始多肽本身具有更高抑制活 性的变体。 0004 发明详述 0005 本发明涉及的多肽， 序列如下: 0006 NB： RKGWFKAMKSIAKFIAKEKLKEHL； 0007 (NB1)： RKGWFKAMKSTAKFIAKEKLKEHL； 0008 (NB 2)： RKGWFKAMKSTAKFIAKEKLKEHLS； 0009 (NB 3)： SRKGWFKAMKSTAKFIAKEKLKEHLSS； 0010 (NB 4)： SRKGWFKAMKSTAKFIAKEKEKEHLS； 0011
5、(NB 5)： SRKGWFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLSS； 0012 (NB 6)： SRKGSFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLS； 0013 (NB 7)： SRKGFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLSS； 0014 (NB 8)： SRKGFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLS； 0015 (NB 9)： RKGWAKAMKSTAKFIAKEKLKEHL； 0016 (NB 10)： RKGWAKAMKSFAKFIAKEKLKEHL； 0017 (NB 11)： RKGWIKAMKSFAKFIAKEKLKEHL； 0018 (NB 12)： RKGWIKAM
6、KSFAKFIAKEKLKEHLS； 0019 (NB 13)： RKGWWKAMKSTAKFIAKEKLKEHLS； 0020 (NB 14)： RKGWWKAMKSTAKFIAKEKLKEHL； 0021 对照1： RKGWFKAMKSWAKFIAKEKLKEHL； 0022 对照2： RKGWSKAMKSIAKFIAKEKLKEHL。 0023 本发明的多肽合成后， 可以做成游离态形式， 也可以做成阳离子盐， 如： TFA盐(三 氟乙酸盐)， HCl盐(盐酸盐)， 醋酸盐形式。 0024 本发明的多肽， 可以选择和一种或多种药物载体组合， 制成多种药物剂型， 用于治 说明书 1/3 页
7、3 CN 106589094 A 3 疗。 这些药物剂型涵盖： 注射溶液、 片剂、 霜剂、 胶囊、 软膏、 洗剂、 舌含片等剂型局部或全身 给药。 剂量优选在10-510-2mg/kg体重的范围内， 以0.1-0.5的较高浓度全身或局部 给药。 对于具体治疗的最佳剂量的确定是本领域技术人员熟知的。 具体实施方式 0025 实施例1： 本发明多肽的人工化学合成 0026 通过常规的合成方法， 合成了本发明多肽， 经质谱鉴定显示纯度较高， 与设定序列 的多肽分子结构相同。 0027 实施例2： 多肽杀灭癌细胞实验 0028 通过MTT分析法测定了本发明多肽对Hela、 CNE1和JB6 3种细胞株
8、的毒性。 作用浓 度为40微摩尔本发明多肽。 为了进一步验证， 采用溶血实验检测本发明多肽对于正常细胞 的毒性， 结果显示200微摩尔本发明多肽只能裂解约15的红细胞， 说明本发明多肽对于正 常细胞毒性较弱。 在整体动物水平， 我们也检测了本发明多肽的毒性， 以200毫克/kg体重皮 下注射小鼠没有出现明显的毒性反应(48小时内)， 表明本发明多肽毒性较低， 对于癌细胞 具有较强的选择性。 0029 采用Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测了本发明多肽杀灭癌细胞 的机制， 发现本发明多肽可诱导Hela细胞凋亡， 未经药物处理的Hela细胞凋亡较少， 说明本 发明多肽通过诱导细
9、胞凋亡杀灭癌细胞。 0030 本发明多肽对3中细胞株的杀灭结果 0031 说明书 2/3 页 4 CN 106589094 A 4 0032 0033 实施例3本发明多肽抑制裸鼠荷瘤生长 0034 上述实验表明本发明多肽具有较强的抑制癌细胞作用， 但仍需要确定本发明多肽 是否具有在体抗实体瘤的作用， 采用裸鼠荷瘤模型开展研究。 实验结果示本发明多肽可明 显抑制实体瘤生长。 在给药前(0天)， 对照组(生理盐水)和给药组的实体瘤体积大小相似， 而在药物干预的时间内， 生理盐水对照组的肿瘤体积快速增大， 表明其肿瘤持续生长， 而给 药组中NB和NB1-14的肿瘤体积没有明显变化， 说明肿瘤生长被抑
10、制。 在第10天给药完成， 对 照组(生理盐水)的肿瘤体积是给药组的5倍， 而给药为对照1和对照2的肽其肿瘤大小与给 药为生理盐水的对照组结果相似， 肿瘤大小相当。 上述结果表明本发明多肽可有效的抑制 肿瘤生长。 说明书 3/3 页 5 CN 106589094 A 5 序列表 李露青 一种抗癌活性肽变体变体及其应用 17 1 24 PRT 人工序列 1 RKGWFKAMKSIAKFIAKEKLKEHL； 2 24 PRT 人工序列 2 RKGWFKAMKSTAKFIAKEKLKEHL； 3 25 PRT 人工序列 3 RKGWFKAMKSTAKFIAKEKLKEHLS 4 27 PRT 人工
11、序列 4 SRKGWFKAMKSTAKFIAKEKLKEHLSS； 5 26 PRT 人工序列 5 SRKGWFKAMKSTAKFIAKEKEKEHLS； 6 27 PRT 人工序列 序列表 1/3 页 6 CN 106589094 A 6 6 SRKGWFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLSS； 7 26 PRT 人工序列 7 SRKGSFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLS； 8 27 PRT 人工序列 8 SRKGFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLSS； 9 26 PRT 人工序列 9 SRKGFKAMKSTAKFIAKEKSKEHLS； 10 24 PRT 人工序列 10
12、 RKGWAKAMKSTAKFIAKEKLKEHL； 11 24 PRT 人工序列 11 RKGWAKAMKSFAKFIAKEKLKEHL； 12 24 PRT 人工序列 12 RKGWIKAMKSFAKFIAKEKLKEHL； 13 序列表 2/3 页 7 CN 106589094 A 7 25 PRT 人工序列 13 RKGWIKAMKSFAKFIAKEKLKEHLS； 14 25 PRT 人工序列 14 RKGWWKAMKSTAKFIAKEKLKEHLS； 15 24 PRT 人工序列 15 RKGWWKAMKSTAKFIAKEKLKEHL； 16 24 PRT 人工序列 16 RKGWFKAMKSWAKFIAKEKLKEHL； 17 24 PRT 人工序列 17 RKGWSKAMKSIAKFIAKEKLKEHL 序列表 3/3 页 8 CN 106589094 A 8
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