基于信号组合编码的DNA连接测序方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101570784 B (45)授权公告日 2011.11.23 CN 101570784 B *CN101570784B* (21)申请号 200910026892.1 (22)申请日 2009.06.03 C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 东南大学 地址 214135 江苏省无锡市菱湖大道 99 号 (72)发明人 涂景 陆祖宏 白云飞 葛芹玉 孙蓓丽 (74)专利代理机构 南京君陶专利商标代理有限 公司 32215 代理人 奚胜元 CN 1662662 A,2005.08.31, 全文 . CN 101432439 A,2009.05.13

2、, 全文 . Jay Shendure 等 .Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome.SCIENCE .2005, 第 39 卷 1728-1732. (54) 发明名称 基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法 (57) 摘要 本发明基于信号组合编码的 DNA 连接测序方 法， 涉及一种采用信号组合编码的 DNA 连接测序 方法， 属于生物技术领域。 本发明的特征在于连接 测序反应中的信号编码， 实现了利用相同数量标 记物， 在一次连接反应中同时检测标记物的指数 量的碱基类型的测序过程， 成倍缩短

3、测序时间， 大 幅提高测序通量， 降低测序成本。本发明利用现 有多个标记物在被检测时信号状态的组合进行编 码， 并与所测碱基的种类一一对应， 由于多个标记 物信号状态组合数量随着标记物种类的数量的增 加而呈现指数增长， 提高了相同数量标记物的分 辨力， 从而达到在一次测序反应中检测标记物的 指数量碱基类型的目的。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 范东升 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 15 页 附图 3 页 CN 101570784 B1/2 页 2 1. 一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于针对某一种

4、特定的 DNA 测 序探针， 利用多种标记物状态的组合进行标记， 对于一批 DNA 测序探针， 采用多种标记物状 态的组合进行二维或多维编码标记， 制备一套信号组合编码的 DNA 测序探针， 从而实现在 检测时对不同 DNA 测序探针的区分和鉴别 ； 所述标记物的状态， 包括标记物 “有信号” 、“无 信号” 两种状态， 以及标记物不同信号强度比例的状态 ： A 一套信号组合编码的 DNA 测序探针的制备 ： 首先制备未标记的 DNA 测序探针， 每一 种未标记的 DNA 测序探针由一个或多个测序碱基、 一个或多个简并碱基 N 或非严格配对碱 基组成 ； 测序碱基用于通过碱基互补配对法则测定待

5、测 DNA 中相应位置的碱基信息， 简并 碱基 N 为 A、 T、 C、 G 四种碱基中的任意一个 ； 完成未标记的 DNA 测序探针的制备后， 针对每 一种未标记的 DNA 测序探针， 采用多种标记物状态的基于二维或多维编码的一种组合进行 标记， 每种标记物在该 DNA 测序探针上标记与否及标记的量由该标记物在状态的组合中所 对应的状态决定 ； 采用不同的状态组合方案对不同的未标记 DNA 测序探针进行标记， 完成 一套信号组合编码的 DNA 测序探针的制备 ； B 利用上述一套信号组合编码的 DNA 测序探针的测序流程如下 ： a. 选取一条测序引物与待测的 DNA 模板依据碱基互补配对原

6、理进行杂交 ； b.向反应体系中加入上述的一套信号组合编码的DNA测序探针和DNA连接酶及其反应 体系， 进行 DNA 连接反应 ； c. 完成 DNA 连接反应后， 检测全部参与状态组合的标记物的信号， 判读每种标记物信 号所处的状态， 根据全部标记物状态的组合情况， 确定发生连接反应的 DNA 测序探针的种 类， 从而确定该测序探针上测序碱基的类型和排布， 并最终确定被测 DNA 模板上对应位置 的碱基或碱基序列信息 ； d. 完成对标记物信号的检测后， 移除 DNA 测序探针上的标记物 ； e. 重复上述步骤 b-d 直至 DNA 测序探针达到或超出待测 DNA 模板待测区域末端 ； f

7、. 该测序引物与待测 DNA 模板变性分离， 选取第二条测序引物 ； g. 重复上述步骤 a-f， 直至全部未知 DNA 模板的待测区域的全部序列信息得以确定。 2. 根据权利要求 1 所述的一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于所 述的多种标记物对未标记 DNA 测序探针进行组合标记， 其方案是对同一 DNA 测序探针分子 同时标记一种或多种标记物， 或者分别用不同的标记物标记同一种 DNA 测序探针的不同分 子， 随后将上述不同测序探针分子混合。 3. 根据权利要求 1 所述的一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于 所述的测序引物是指一组只能和所有

8、DNA 模板的一段通用序列杂交的寡核苷酸片段， 一组 测序引物在 DNA 模板上杂交区域彼此相差一个或数个碱基， 能够在数轮测序反应中完成对 DNA 模板全长的测序工作 ； 测序模板上的通用序列， 是在测序模板制备过程中通过连接反 应加入， 或者在扩增过程中通过引物引入。 4. 根据权利要求 1 所述的一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于所 述的 DNA 模板是通过对待测的 DNA 片段通过 DNA 扩增技术增加基因组中感兴趣的目的片 段的量， 扩增是单重的， 即一次扩增一个目的片段， 或者是多重的， 即一次扩增多个目的片 段 ； 所述的待测的 DNA 模板中的固定是通过

9、化学或者物理方法固定于平面片基上， 或固定 于 “96 孔板” 、“384 孔板” 及各种修饰的珠子载体上。 权 利 要 求 书 CN 101570784 B2/2 页 3 5. 根据权利要求 1 所述的一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于所 述的标记物， 是采用的荧光基团， 或利用测序探针化学的、 物理的性质的改变。 6. 根据权利要求 1 所述的一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于所 述的标记物的移除， 是标记基团通过化学的、 物理的方法与 DNA 测序探针分离， 或者 DNA 测 序探针化学的、 物理的性质恢复原有状态 ； 标记物的移除， 是仅

10、仅移除标记物本身， 或者同 时移除与标记物相连或不相连的一个或多个碱基及相关基团。 7. 根据权利要求 1 所述的一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征在于所 述的第二条测序引物是一组测序引物中除已经使用的测序引物中的任何一条， 并不一定是 与已使用的测序引物对应在测序模板上杂交位置最为接近的一条。 权 利 要 求 书 CN 101570784 B1/15 页 4 基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法 技术领域 0001 本发明基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法涉及一种采用信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 是一种实现 DNA 序列分析的方法， 属于生物技术领域。

11、 技术背景 0002 随着基因组研究的深入， 特别是人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的完 成， 生物学研究和医学研究方式产生了巨大变革。从基因水平上认识生命的差异， 疾病发 生、 发展的规律， 药物与生命体的相互作用， 不同物种之间的遗传差异以及同一物种内部不 同个体间的遗传差异成为可能。尽管导致疾病发生的因素众多， 但基因序列差异 ( 包括单 核苷酸多态性、 DNA 甲基化等 ) 被广泛认为是一个重要的内在因素。多数复杂疾病发生和 发展， 如癌症、 糖尿病、 心血管疾病、 精神疾病等， 是众多基因和环境共同作用的结果。通过 对某一特定疾病大量基因组样本中基因突变的大规模检测及与非患病对

12、照基因组样本的 比对， 即可获得与该疾病有关的基因型信息， 通过随后对药物敏感基因突变位点的筛查， 可 以获得对临床治疗与用药具有指导性意义的信息。 无论是亲缘关系较近的物种之间遗传差 异， 还是同一物种内部不同个体之间的遗传差异， 都主要是以基因序列差异的形式体现出 来。因此， 如何快速的筛查基因组中的基因序列差异成为后基因组时代的主要课题之一。 0003 现有的基因序列差异的检测方法主要为 ： 传统 Sanger DNA 测序法、 限制性酶切长 度多态性、 单链构象多态性和基于基因芯片的寡核苷酸探针杂交法等。 在这些方法中， 仅有 传统的Sanger DNA测序法能完成对目标片段的全方位序

13、列测定， 其余方法均只能确定很少 的一部分序列信息。但传统的 Sanger DNA 测序法存在通量低、 成本高、 耗时长等不足。第 一个人类基因组序列测定的费用大约为 10 亿美元。尽管这一费用目前已经降低到 2000 万 美元， 但依然是制约功能基因组研究的瓶颈， 大幅度降低 DNA 测序的成本将会大大推动生 命科学的发展。为此， 美国 Venter 基金会在 2003 年提出了 1000 美元人类全基因组测序的 研究目标。 2004年初， 美国国立卫生院投入4千多万美元支持DNA测序新技术的研究计划， 累计已经超过 1 亿美元。其目标是发展 10 万美元的人类全基因组 DNA 测序技术，

14、并最终减 低为 1000 美元。 0004 目前， 除对现有的基于电泳的测序技术的改进外， 正在研发的测序技术总体上可 以分为四类。第一类是延伸测序法， 将信号标记的碱基加入到正在发生聚合反应的 DNA 链 中进行检测， 第二类是连接测序法， 将信号标记的寡核苷酸片段加入到正在发生连接反应 的 DNA 链中进行检测 ； 第三类是杂交测序法， 通过制备一组高密度寡核苷酸微阵列芯片的 杂交信号， 进行目标基因的序列鉴定 ； 第四类是分子影像等一系列可以在单分子的水平上 进行测序的技术 ； 最后一类技术是诱导 DNA 分子蜿蜒通过非常细微的小孔， 在这个过程中 借助电子学或者光学的方法对碱基进行读出

15、， 也成为纳米孔道测序技术。目前只有延伸测 序方法和连接测序方法用于全基因组测序， 并且开发出了商品化的仪器和试剂， 大大提高 了 DNA 测序的效率， 大幅度降低了 DNA 测序的成本。然而， 目前新一代的 DNA 测序在测序成 本、 通量和速度等方面仍然不能满足生命科学研究的需要。主要原因之一是在检测核酸的 说 明 书 CN 101570784 B2/15 页 5 信号标记方法单一、 效率不高。例如， 在 DNA 连接测序方法中， 受标记物 ( 如荧光基团 ) 种 类的限制， 每次连接反应一般仅能确定一个碱基的信息， 如需在一次连接反应确定两个及 两个以上碱基信息， 则需要的标记物种类呈现

16、指数增长。 因此， 有效提高核酸的信号标记方 法， 将会大幅度提高 DNA 测序的速度、 减低试剂成本。 发明内容 0005 本发明的目的就是针对现有 DNA 的连接测序技术在检测核酸的信号标记方法单 一、 效率不高， 试图通过不同标记物状态的组合进行二维或多维的编码， 合成信号编码的 DNA 测序探针， 从而实现使用相同数量的标记物检测较多碱基或碱基组合的目的， 建立快 速、 准确、 低成本和高通量的序列测定方法。 0006 DNA 连接测序属于一种 DNA 合成测序方法。DNA 连接测序的基本步骤是 ： 首先在 待测的 DNA 模板上杂交一条与特定区域互补配对的测序引物 ； 接着向含有待测

17、模板和测序 引物的反应器中加入一种或一组寡核苷酸测序探针， 每个寡核苷酸探针由三部分组成 ： 简 并碱基或非严格配对碱基、 标记物和测序碱基 ； 简并碱基或非严格配对碱基是一组非特异 性的可与测序模板杂交的碱基组合， 标记物用于标记寡核苷酸探针， 便于在发生 DNA 连接 反应后进行检测 ； 测序碱基是一个和多个确定的碱基， 用于使得测序探针有选择性地与部 分测序模板 - 测序引物复合物发生连接反应， 发生反应的测序模板的相应碱基与测序探针 的测序碱基互补配对， 同时， 测序碱基与标记物存在某种对应关系 ； 在进行了 DNA 连接测序 反应后， 利用相应的检测手段对测序模板 - 引物 - 探针

18、复合物进行检测， 获得对应的信号 信息， 再利用预先设定的测序碱基和标记物的对应关系判读测序模板中相应位置的碱基信 息。 0007 当完成一次连接测序反应后， 移除测序模板-引物-探针复合物上的标记物， 以测 序探针作为新的连接起点进行下一次的连接测序反应， 连续进行连接反应直至完成所需测 序长度。测序引物与待测模板变性分离， 随后在待测模板上杂交与第一条引物序列平移一 个和多个碱基的测序引物， 进行新一轮多次连接反应 ； 完成后重复变性、 杂交、 连接过程直 至所有位置的碱基信息均完成测定。 0008 本发明技术方案 ： 本发明是一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其特征 在于针

19、对某一种特定的 DNA 测序探针， 利用多种标记物状态的组合进行标记， 对于一批 DNA 测序探针， 采用多种标记物状态的不同组合方案进行标记， 制备一套信号组合编码的 DNA 测序探针， 从而实现在检测时对不同 DNA 测序探针的区分和鉴别 ： 0009 A 一套信号组合编码的 DNA 测序探针的制备 ： 首先制备未标记的 DNA 测序探针， 每 一种未标记的 DNA 测序探针由一个或多个测序碱基、 一个或多个简并碱基 N 或非严格配对 碱基组成。测序碱基用于通过碱基互补配对法则测定待测 DNA 中相应位置的碱基信息， 简 并碱基 N 为 A、 T、 C、 G 四种碱基中的任意一个。完成未标

20、记的 DNA 测序探针的制备后， 针对 每一种未标记的 DNA 测序探针， 采用多种标记物状态的一种组合进行标记， 每种标记物在 该 DNA 测序探针上标记与否及标记的量由该标记物在状态的组合中所对应的状态决定。采 用不同的状态组合方案对不同的未标记 DNA 测序探针进行标记， 完成一套信号组合编码的 DNA 测序探针的制备。 0010 B 利用上述一套信号组合编码的 DNA 测序探针的测序流程如下 ： 说 明 书 CN 101570784 B3/15 页 6 0011 a. 选取一条测序引物与待测的 DNA 模板依据碱基互补配对原理进行杂交 ； 0012 b.向反应体系中加入上述的一套信号组

21、合编码的DNA测序探针和DNA连接酶及其 反应体系， 进行 DNA 连接反应 ； 0013 c. 完成 DNA 连接反应后， 检测全部参与状态组合的标记物的信号， 判读每种标记 物信号所处的状态， 根据全部标记物状态的组合情况， 确定发生连接反应的 DNA 测序探针 的种类， 从而确定该测序探针上测序碱基的类型和排布， 并最终确定被测 DNA 模板上对应 位置的碱基或碱基序列信息 ； 0014 d. 完成对标记物信号的检测后， 移除 DNA 测序探针上的标记物 ； 0015 e. 重复上述步骤 b-d 直至 DNA 测序探针达到或超出待测 DNA 模板待测区域末端 ； 0016 f. 该测序引

22、物与待测 DNA 模板变性分离， 选取第二条测序引物 ； 0017 g. 重复上述步骤 a-f， 直至全部未知 DNA 模板的待测区域的全部序列信息得以确 定。 0018 所述的多种标记物对未标记 DNA 测序探针进行组合标记， 其方案是对同一 DNA 测 序探针分子同时标记一种或多种标记物， 或者分别用不同的标记物标记同一种 DNA 测序探 针的不同分子， 随后将上述不同测序探针分子混合。 0019 所述的标记物的状态组合， 是标记物的 “有信号” 、“无信号” 两种状态组合， 或者是 标记物不同信号强度比例状态的组合。 0020 所述的测序引物是指一组只能和所有 DNA 模板的一段通用序列

23、杂交的寡核苷酸 片段， 一组测序引物在 DNA 模板上杂交区域彼此相差一个或数个碱基， 能够在数轮测序反 应中完成对 DNA 模板全长的测序工作 ； 测序模板上的通用序列， 是在测序模板制备过程中 通过连接反应加入， 或者在扩增过程中通过引物引入。 0021 所述的 DNA 模板是通过对待测的 DNA 片段通过 DNA 扩增技术增加基因组中感兴 趣的目的片段的量， 扩增是单重的， 即一次扩增一个目的片段， 或者是多重的， 即一次扩增 多个目的片段 ； 所述的待测的 DNA 模板中的固定是通过化学或者物理方法固定于平面片基 上， 或固定于 “96 孔板” 、“384 孔板” 及各种修饰的珠子载体

24、上。 0022 所述的标记物， 是采用的荧光基团， 或利用测序探针化学的、 物理的性质的改变， 如电阻变化、 电流变化。 0023 所述的检测是指与所述的标记物性质相适应的， 在激光激发的荧光标记基团时， 激光激发强度可为 95、 70、 45等多个不同强度， 光电倍增可以分别为 95、 70、 45等多个检测区间。 0024 所述的标记物的移除， 是标记基团通过化学的、 物理的方法与 DNA 测序探针分离， 或者 DNA 测序探针化学的、 物理的性质恢复原有状态。标记物的移除， 是仅仅移除标记物本 身， 或者同时移除与标记物相连或不相连的一个或多个碱基及相关基团。 0025 所述的第二条测序

25、引物是一组测序引物中除已经使用的测序引物中的任何一条， 并不一定是与已使用的测序引物对应在测序模板上杂交位置最为接近的一条。 0026 技术原理 ： 本发明是一种基于信号组合编码的 DNA 连接测序方法， 其技术原理可 以表述如下 ： 0027 设现有 n 种不同的信号标记物， 每种测序探针通过 n 种信号标记物的组合状态进 行标记。这里的组合状态可以是简单的 “有信号” 、“无信号” 二维状态， 也可以是 “100信 说 明 书 CN 101570784 B4/15 页 7 号” 、“75信号” 、“50信号” 、“25信号” 、“0信号” 等多维状态。这里我们以二维的状态 为例， 利用每一

26、种标记物在被检测时的 “有信号” 、“无信号” 两种状态进行二进制编码， 这里 我们把 “有信号” 记录为 “1” ， 把 “无信号” 记录为 “0” 。当对于某一特定的测序探针采用两 种标记物时， 通过这两种标记物产生的二组 “有信号” 和 “无信号” 状态的组合， 共得到 22 4 种组合状态， 即 “标记物 1 有信号、 标记物 2 有信号” 、“标记物 1 有信号、 标记物 2 无信 号” 、“标记物 1 无信号、 标记物 2 有信号” 、“标记物 1 无信号、 标记物 2 无信号” ， 把四种组合 状态分别记录为二进制数 “11” 、“10” 、“01” 、“00” ( 二位二进制数

27、的高位记录 1 号标记物 的状态， 低位记录 2 号标记物的状态 )， 从而实现了采用二种标记物同时标记四种测序探针 ( 附图 1)。当标记物数量为 n 时 (n 为大于等于 2 的整数 )， 记录 n 种标记物的每一个组合 状态为一个 n 位二进制数， 二进制数的每一位记录一种标记物的被检测状态，“1” 表示检测 到信号，“0” 表示未检测到信号， 全部 2n个 n 位二进制数与 n 个信号标记物的 2n种组合状 态一一对应， n 种标记物共可以同时标记 2n种测序探针。 0028 表 1 两种标记物四种组合状态检测测序探针类型的详细列表 0029 ( 状态中 “1” 表示检测到信号，“0”

28、 表示未检测到信号 ) 0030 待测测序探针类型 标记物 1 标记物 2 碱基类型 1 1 1 碱基类型 2 1 0 碱基类型 3 0 1 碱基类型 4 0 0 0031 由于构成DNA的常见碱基共有4种， 分别为腺嘌呤(A)、 鸟嘌呤(G)、 胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶 (C)， 因此需要准确检测一个碱基的 4 种类型测序探针需要两种标记物 “有信号” 和 “无信号” 的 4 种组合状态 ( 见表 1) ； 2 个碱基组成的测序探针组合共有 44 16 种类型， 需要 4 种标记物共 2222 16 种组合状态来检测 ； 依此类推， n 个 (n 为大于等于 2 的整数 ) 碱基组成的碱基组

29、合共需要 2n 种标记物共 22n种复合信号状态来检测， 每种复合 状态通过一个 2n 位二进制数来唯一表示， 并与测序探针的类型一一对应 ( 见表 2)。 0032 表 22n 种标记物 22n种复合状态检测 n 个碱基的详细列表 0033 ( 表中 “1” 表示该种标记物修饰该种测序探针，“0” 表示该种标记物不修饰该种测 序探针 ) 0034 测序探针类型 标记物 1 标记物 2 标记物 3 标记物 2n-2 标记物 2n-1 标记物 2n 测序探针 1 1 1 1 1 1 1 说 明 书 CN 101570784 B5/15 页 8 测序探针 2 1 1 1 1 1 0 测序探针 3

30、1 1 1 1 0 1 测序探针 22n-2 0 0 0 0 1 0 测序探针 22n-1 0 0 0 0 0 1 测序探针 22n 0 0 0 0 0 0 0035 本发明的有益效果 ： 0036 1. 本发明最大的优点是通过的标记物的组合信号编码， 实现在一次连接反应中同 时检测较多碱基或碱基组合。本发明在单次连接反应中测定 1 个碱基的类别仅需要 2 种标 记物， 而传统的方法需要4种标记物 ； 本发明在单次连接反应中测定2个碱基的类别仅需要 4 种标记物， 而传统的方法需要 16 种标记物。 0037 2. 由于在单次连接反应中检测多个碱基的类别所需的标记物种类与传统方法相 比呈现指数

31、型的下降， 使得在单次连接反应中同时检测多个碱基的类别成为可能， 成倍缩 短了对全部序列测定所需的时间。 0038 3. 通过信号组合编码， 检测相同长度的序列所需的连接反应次数的减少， 测序的 成本也成倍降低。 同时， 通过信号组合编码， 检测相同数量的碱基类型所需的标记物种类大 幅降低， 降低了对检测标记物设备的需求， 从而降低成本。 附图说明 0039 以下结合附图对本发明进行进一步说明。 0040 图 1 是当标记物状态简化为二维时， 即信号的有无时， 通过两种标记物的二维状 态组合检测在一次连接测序反应中 A、 T、 C、 G 四种碱基的原理图。1， 当待测碱基为 A 时， 测 序碱

32、基为 U 的测序探针所对应的标记物的组合状态为 “标记物 1 有信号， 标记物 2 有信号” ， 即 “1， 1” ； 2， 当待测碱基为C时， 测序碱基为G的测序探针所对应的标记物的组合状态为 “标 记物 1 有信号， 标记物 2 无信号” ， 即 “1， 0” ； 3， 当待测碱基为 G 时， 测序碱基为 C 的测序探 针所对应的标记物的组合状态为 “标记物 1 无信号， 标记物 2 有信号” ， 即 “0， 1” ； 4， 当待测 碱基为 T 时， 测序碱基为 A 的测序探针所对应的标记物的组合状态为 “标记物 1 无信号， 标 记物 2 无信号” ， 即 “0， 0” 。 0041 图

33、 2 是实例 2、 实例 3 和实例 4 的共同工作流程图。1， 将 P1、 P2 引物扩增后的 PCR 产物固定于玻片表面 ； 2， 第一条测序引物 I1 与固定于玻片表面的 PCR 产物杂交 ； 3， 测序引 物I1上连接了测序碱基与PCR待测位置互补的寡核苷酸探针 ； 4， 完成检测后移除荧光修饰 基团 ； 5， I1 连接进行第二次测序探针的连接 ； 6， 完成检测后再次移除荧光修饰基团 ； 7， I1 完成全部 4 次连接反应 ； 8， 测序引物 I1 与 PCR 产物变性分离 ； 9， 第二条测序引物 I2 与 PCR 产物杂交开始新一轮测序反应。 0042 图 3 是实例 2 测

34、序引物 I1 进行前两次测序连接反应的详细图解。1， 测序引物 I1 说 明 书 CN 101570784 B6/15 页 9 与固定于玻片表面的 PCR 产物杂交， I1 的 5 端前 11 个碱基与 PCR 引物 P2 互补链互补配 对， I1 的 3 末端的最后四个简并碱基 N 与待测 DNA 的 3 末端 1、 2、 3、 4 号碱基互补配对 ； 2， 进行第一次连接反应， 32 种寡核苷酸探针组成的混合物中测序碱基为 “5 -AG-3 ” 几种 寡核苷酸单体 ( 寡核苷酸探针其余位置为简并碱基 N) 与杂交于 PCR 产物上的 I1 连接， 通 过检测， 可以得知连接上寡核苷酸探针末

35、端分别标记有 CY3、 TXR、 FTC 基团， 查寡核苷酸探 针配方表得知待测 DNA 的 3 末端第 7、 8 号碱基为 “5 -CT-3 ” ； 3， 移除寡核苷酸探针末端 的荧光修饰基团 ； 4， 进行第二次连接， 检测待测 DNA 的 3 末端第 15、 16 号碱基。 具体实施方式 0043 本发明的实施方案分为两种 ： 0044 第一种是针对某一种测序探针， 选用若干种标记物同时对同一测序探针分子进行 标记。针对一次连接反应， 各个标记物在被检测时分别呈现 “有信号” 、“无信号” 的两种状 态， 由向测序连接反应体系中加入的特定测序探针决定， 制备含有不同标记物的测序探针 是本

36、发明的关键。 加入反应体系中的测序探针由一组标记了不同标记物的寡核苷酸探针组 成。每个寡核苷酸探针由一个或多个测序碱基 ( 通过碱基互补配对法则测定待测 DNA 中相 应位置的碱基信息 )、 一个或多个简并碱基 N(N 为 A、 T、 C、 G 四种碱基中的任意一个 ) 或非 严格配对碱基 ( 如次黄嘌呤等 ) 和一种具有被检测能力的标记物构成。测序碱基与标记物 之间的组合按照表 2 所列状态制备， 当表 2 中所确定的 “测序探针类型 i” 对应 k 种标记物 的状态为 “1” 时， 则在制备测序碱基为 “碱基组合类型 i” 的测序探针分子时， 同时标记表格 中 “测序探针类型 i” 所有状

37、态为 “1” 的标记物 ； 逐行合成表 2 所列全部 22n种寡核苷酸探 针， 该探针混合物即为所需制备的寡核苷酸探针混合物。 0045 第二种是将该种测序探针分为若干部分， 每一部分分别标记一种标记物。针对一 次连接反应， 各个标记物在被检测时分别呈现 “有信号” 、“无信号” 的两种状态， 由向测序连 接反应体系中加入的特定测序探针决定。 因此制备含有不同标记物的测序探针是本发明的 关键。加入反应体系中的测序探针由一组标记了不同标记物的寡核苷酸探针组成。每个寡 核苷酸探针由一个或多个测序碱基(通过碱基互补配对法则测定待测DNA中相应位置的碱 基信息)、 一个或多个简并碱基N(N为A、 T、

38、 C、 G四种碱基中的任意一个)或非严格配对碱基 ( 如次黄嘌呤等 ) 和一种具有被检测能力的标记物构成。测序碱基与标记物之间的组合按 照表 2 所列状态制备， 当表 2 中所确定的 “碱基组合类型 i” 与 “标记物 j” 所列状态为 “1” 时， 则制备测序碱基为 “碱基组合类型 i” 、 标记物为 “标记物 j” 的寡核苷酸探针 ； 如所列状 态为 “0” 时则不合成， 合成表 2 所列全部状态为 “1” 的寡核苷酸探针， 该探针混合物即为所 需制备的寡核苷酸探针混合物。 0046 更进一步地， 每一种标记物的状态可以通过相对信号强度的大小， 可以确定为 m 种状态 (m 2)。例如，

39、标记物的信号可以为 “0” 、“1” 、“2” 和 “3” 等四种状态。利用每一 种标记物在被检测时有 “无信号” 、“1/3 信号” 、“2/3 信号” 和 “全信号” 四种状态进行四进 制编码， 可以把 “无信号” 记录为 “0” ， 把 “1/3 信号” 记录为 “1” ， 把 “2/3 信号” 记录为 “2” ， 把 “全信号” 记录为 “3” 。当对于某一特定的测序探针采用两种标记物时， 通过这两种标记 物产生的信号组合， 共得到 44 16 种组合状态， 即 “00” 、“01” 、“02” 、“03” 、“10” 、“11” 、 “12” 、“13” 、“20” 、“21” 、“

40、22” 、“23” 、“30” 、“31” 、“32” 、“33” ( 二位四进制数的高位记录 1 说 明 书 CN 101570784 B7/15 页 10 号标记物的状态， 低位记录2号标记物的状态)， 从而实现了采用2种标记物同时标记16种 测序探针。当标记物数量为 n 时 (n 为大于等于 2 的整数 )， 记录标记物组合状态为全部 n 位四进制数 ( 即可以同时标记 4n种测序探针 )， 四进制数的每一位记录一种标记物的被检 测状态， 全部 4n个 n 位四进制数与 n 个信号标记物的 4n种组合状态一一对应。 0047 实施例 1 ： 本发明是一种基于信号组合编码的 DNA 连接测

41、序方法， 其特征在于针对 某一种特定的 DNA 测序探针， 利用多种标记物状态的组合进行标记， 对于一批 DNA 测序探 针， 采用多种标记物状态的不同组合方案进行标记， 制备一套信号组合编码的 DNA 测序探 针， 从而实现在检测时对不同 DNA 测序探针的区分和鉴别， 达到对待测模板进行测序的目 的。 0048 A 一套信号组合编码的 DNA 测序探针的制备 ： 首先制备未标记的 DNA 测序探针， 每 一种未标记的 DNA 测序探针由一个或多个测序碱基、 一个或多个简并碱基 N 或非严格配对 碱基组成。测序碱基用于通过碱基互补配对法则测定待测 DNA 中相应位置的碱基信息， 简 并碱基

42、N 为 A、 T、 C、 G 四种碱基中的任意一个。完成未标记的 DNA 测序探针的制备后， 针对 每一种未标记的 DNA 测序探针， 采用多种标记物状态的一种组合进行标记， 每种标记物在 该 DNA 测序探针上标记与否及标记的量由该标记物在状态的组合中所对应的状态决定。采 用不同的状态组合方案对不同的未标记 DNA 测序探针进行标记， 完成一套信号组合编码的 DNA 测序探针的制备。 0049 B 利用上述一套信号组合编码的 DNA 测序探针的测序流程如下 ： 0050 a. 选取一条测序引物与待测的 DNA 模板依据碱基互补配对原理进行杂交 ； 0051 b.向反应体系中加入上述的一套信号

43、组合编码的DNA测序探针和DNA连接酶及其 反应体系， 进行 DNA 连接反应 ； 0052 c. 完成 DNA 连接反应后， 检测全部参与状态组合的标记物的信号， 判读每种标记 物信号所处的状态， 根据全部标记物状态的组合情况， 确定发生连接反应的 DNA 测序探针 的种类， 从而确定该测序探针上测序碱基的类型和排布， 并最终确定被测 DNA 模板上对应 位置的碱基或碱基序列信息 ； 0053 d. 完成对标记物信号的检测后， 移除 DNA 测序探针上的标记物 ； 0054 e. 重复上述步骤 b-d 直至 DNA 测序探针达到或超出待测 DNA 模板待测区域末端 ； 0055 f. 该测序

44、引物与待测 DNA 模板变性分离， 选取第二条测序引物 ； 0056 g. 重复上述步骤 a-f， 直至全部未知 DNA 模板的待测区域的全部序列信息得以确 定。 0057 所述的多种标记物对未标记 DNA 测序探针进行组合标记， 其方案是对同一 DNA 测 序探针分子同时标记一种或多种标记物， 或者分别用不同的标记物标记同一种 DNA 测序探 针的不同分子， 随后将上述不同测序探针分子混合。 0058 所述的标记物的状态组合， 是标记物的 “有信号” 、“无信号” 两种状态组合， 或者是 标记物不同信号强度比例状态的组合。 0059 所述的测序引物是指一组只能和所有 DNA 模板的一段通用序

45、列杂交的寡核苷酸 片段， 一组测序引物在 DNA 模板上杂交区域彼此相差一个或数个碱基， 能够在数轮测序反 应中完成对 DNA 模板全长的测序工作 ； 测序模板上的通用序列， 是在测序模板制备过程中 通过连接反应加入， 或者在扩增过程中通过引物引入。 说 明 书 CN 101570784 B8/15 页 11 0060 所述的 DNA 模板是通过对待测的 DNA 片段通过 DNA 扩增技术增加基因组中感兴 趣的目的片段的量， 扩增是单重的， 即一次扩增一个目的片段， 或者是多重的， 即一次扩增 多个目的片段 ； 所述的待测的 DNA 模板中的固定是通过化学或者物理方法固定于平面片基 上， 或固

46、定于 “96 孔板” 、“384 孔板” 及各种修饰的珠子载体上。 0061 所述的标记物， 是采用的荧光基团， 或利用测序探针化学的、 物理的性质的改变， 如电阻变化、 电流变化。 0062 所述的检测是指与所述的标记物性质相适应的， 在激光激发的荧光标记基团时， 激光激发强度可为 95、 70、 45等多个不同强度， 光电倍增可以分别为 95、 70、 45等多个检测区间。 0063 所述的标记物的移除， 是标记基团通过化学的、 物理的方法与 DNA 测序探针分离， 或者 DNA 测序探针化学的、 物理的性质恢复原有状态。标记物的移除， 是仅仅移除标记物本 身， 或者同时移除与标记物相连或

47、不相连的一个或多个碱基及相关基团。 0064 所述的第二条测序引物是一组测序引物中除已经使用的测序引物中的任何一条， 并不一定是与已使用的测序引物对应在测序模板上杂交位置最为接近的一条。 0065 实施例 2 ： 四色荧光组合编码法 ( 分别标记方案 ) 检测人类 17 号染色体上， RP11-354P11 克隆上 45332-45363 共 32 个碱基对序列 ； 0066 提取人类全基因组 DNA， 利用 PCR 方法扩增目的片段， 引物为 P1、 P2( 序列见表 3)， 引物 P1 的 5 末端采用羟基修饰。扩增后的 PCR 产物固定于醛基修饰的玻片表面后， 加热 玻片至 95使双链

48、PCR 产物的一条链与固定链脱离， 随后开始测序反应。 0067 表 3 实例 2 中相关寡核苷酸序列信息 0068 序列名 序列信息 待测序列 5 -CACGGACCAGCTGCCCTGGACCAGCTGCAAGA-3 P1 OH-5 -CGCTATACTACCTCATCTCCTCCTTCACG-3 P2 5 -GCAGTTGCCAGTGTTCCAGGAGT-3 I1 5 -GTTCCAGGAGTNNNN-3 I2 5 -GTGTTCCAGGAGTNN-3 I3 5 -CAGTGTTCCAGGAGT-3 I4 5 -GCCAGTGTTCCAGGA-3 0069 向玻片表面加入杂交缓冲液和第一

49、条测序引物I1(序列见表3)， 37杂交复性20 分钟。向反应池中加入表所列的全部 32 种寡核苷酸探针组成的混合物， 采用 T4 核酸连接 酶进行连接反应， 反应条件为25连接30分钟。 连接完成后利用激光共聚焦显微镜对玻片 进行扫描， 扫描分别采用对应于CY3、 CY5、 TXR和FTC的波长进行， 根据获得的荧光信号判读 对应的碱基信息 ( 附图 2)。 说 明 书 CN 101570784 B9/15 页 12 0070 在 第 一 次 连 接 反 应 中， I1 与 待 测 DNA 及 引 物 P2 互 补 链 上 的 “5 -AAGAACTCCTGGAAC-3 ” 序列杂交， 加入寡核苷酸探针混合物后， 寡核苷酸探针混合物中 测序碱基如果与待测DNA位于I1引物3 端下游的第3、 4号碱基互补配对， 则这些寡核苷酸 探针与待测 DNA 杂交并与引物 I1 发生连接反应。待测 DNA 位于 I1 引物 3 端下游的第 3、 4 个碱基为 “5 -CT-3 ” ， 其反向互补碱基为 “5 -AG-3 ” ， 则所有测序碱基为 “5 -AG-3 ” 的 寡核苷酸探针 “5 -NNAGNNNN-3 -CY3” 、“5 -NNAGNNNN-3 -CY5” 、“5 -NNAG