一种链霉菌及其生产米尔贝霉素A4的方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510137374.2 (22)申请日 2015.03.27 CGMCC NO.9671 2014.09.16 C12N 1/20(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12R 1/55(2006.01) (71)申请人 浙江海正药业股份有限公司 地址 318000 浙江省台州市椒江区外沙路 46 号 (72)发明人 滕云 徐美冬 莫美依 何志慧 陈正杰 江连清 白骅 (54) 发明名称 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素 A4 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种链霉菌 (Streptomyces hygros

2、copicus)HS7522， 通过培养它制备米尔贝 霉素 A4 的方法。本发明的链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)HS7522 于 2014 年 9 月 16 日保藏 于 “中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心” ， 保藏登记号为CGMCC NO.9671， 命名为吸水链 霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)。其在含有 可同化碳源和氮源的营养培养基中， 并在通氧的 条件下通过发酵可生产米尔贝霉素 A4。本发明提 高了 A4 在发酵液中的含量， 发酵单位大幅提高， 具备很好的工业应用价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl

3、. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 106148215 A 2016.11.23 CN 106148215 A 1/1 页 2 1.一种链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)HS7522， 其保藏编号为 CGMCC NO.9671 且具有生产米尔贝霉素的能力。 2.根据权利要求 1 所述的链霉菌 HS7522， 在生产米尔贝霉素中的应用。 3.一种发酵生产米尔贝霉素的方法， 其特征在于 ： 包括采用链霉菌 HS7522 在含有可同 化的碳源和氮源的营养培养基里， 进行有氧发酵的步骤。 4.根据权

4、利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述可同化的碳源选自淀粉、 糊精、 葡萄糖、 工业糖蜜、 甘油、 蔗糖、 乳糖、 麦芽糖、 海藻糖、 木聚糖、 甘露醇、 山梨醇之一或上述物 质的组合。 5.根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述可同化的氮源选自酵母抽提物、 酵母粉、 牛肉浸膏、 胰蛋白胨、 蛋白胨、 黄豆饼粉、 棉籽饼粉、 花生饼粉、 麸质粉、 玉米浆干粉、 麸皮、 尿素、 铵盐之一或上述物质的组合。 6.根据权利要求 3 5 任何一项所述的制备方法， 其特征在于 ： 其中所采用的米尔贝 霉素产生菌为链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)、 链霉菌HS

5、7522(CGMCC NO.9671)自发的突变 株或通过常规的诱变得到的突变株。 7.根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养的温度为 20 -40， 培养基 pH 为 6.0-8.0， 培养时间为 300-360 小时。 权 利 要 求 书 CN 106148215 A 2 1/10 页 3 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素 A4 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种新的链霉菌、 通过发酵培养该菌生产米尔贝霉素 A4 的方法。 背景技术 0002 米尔贝霉素是微生物天然产物农药， 已有数据表明它是当今世界上最优良的杀螨 剂之一。美国环保署认定其为低危险性杀虫剂，

6、荷兰批准其为 “GNO” ( 作物生产中的天然产 物 )。它属生态友好型农药， 适用于有机农业病虫害的综合防治， 在发达国家已成为一种受 欢迎的杀虫杀螨剂。 0003 米尔贝霉素是日本三共公司以二斑叶螨作为试虫， 从微生物的发酵液中筛选出 的具有抗虫活性的代谢产物 (US3,950,360)。经过大量基础研究， 1983 年米尔贝霉素 (milbemycin)A3 和 A4 组分的混合物 (A3 ： A4 3 ： 7) 被用作杀螨剂， 米尔贝霉素 A3 和 A4 结构如式 I 所示。1990 年， 1的米尔贝霉素乳油 (milbeknock) 在日本作为杀螨剂用于茶 叶、 茄子。 1993年，

7、 1的米尔贝霉素乳油用作梨、 桃、 西瓜、 草莓、 茄子、 花卉的杀虫剂也在日 本登记。 当前， 米尔贝霉素已在日本、 欧美等多个国家登记， 并且作为安全、 对环境友好的杀 虫杀螨剂被美国环保局推荐使用。 0004 0005 日本三共公司是米尔贝霉素的原研厂， 其 1980 年发表的文献中表明米 尔 贝 霉 素 A3+A4 的 含 量 仅 仅 只 有 150mg/L 左 右 (Yo Takiguchi et al,The J.of Antibiotics,1980,OCT,1120-1127)。 后经过菌种诱变和发酵条件优化， 1990年米尔贝霉素 A3+A4的含量达到530mg/L(Koic

8、chi Nonaka et al,Actinomycetol.1990， 13:32-41)。 国内 米尔贝霉素研发启动较晚， 主要集中在东北农业大学项文胜课题组， 目前也取得了较大的 突破， 如在2011年发表的文献中米尔贝霉素A3+A4的单位含量最高达到了1595mg/L(Zhang Baoxin et al， African J Biotechnol10(37):7225-7235)， 在中国专利CN 103468625 A中 米尔贝霉素 A3+A4 的单位含量提高至 2237mg/L。 0006 米尔贝霉素发酵液组分复杂， 米尔贝霉素 A3， A4 为主要成分， 另外还含有其他结 构类

9、似物。 通常情况下米尔贝霉素发酵液中米尔贝霉素A3和A4的比例大约为1:2， 因此现 说 明 书 CN 106148215 A 3 2/10 页 4 有的商业化产品也是 A3， A4 的混合组分。导致这一结果最主要的原因在于要从 A3， A4 比例 相近的发酵液中单独分离出 A3， A4 单组分难度较大， 影响最终收率。实现 A4 的单一组分生 产， 可进一步推动米尔贝霉素 A4 单组分在其他领域的应用。而得到单组分最有效的方法是 获得能够生产单一组分的新菌种， 并进一步提高发酵单位。 发明内容 0007 鉴于此， 本发明的目的之一在于提供一种能提高米尔贝霉素 A4 单位产量的微生 物菌种，

10、该菌种的特点在于其发酵液中米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比大 于 80， 且米尔贝霉素 A4 的单位产量可以达到大于 4000ug/ml， 米尔贝霉素 A3+A4 的单位 产量可以达到大于 5000ug/ml， 发酵单位高， 杂质含量低。 0008 本发明的链霉菌 HS7522 的微生物菌种于 2014 年 9 月 16 日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院， 中国科 学院微生物研究所 )， 保藏号为 CGMCC NO.9671， 分类命名为吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus

11、)， 并登记入册， 证明存活。 0009 本发明的链霉菌HS7522主要生物学特征为 ： ISP1上菌落颜色白色， ISP2上菌落卵 石灰， ISP3 上亮象牙色， 圆形， 中间稍凸起， 多皱， 直径大小为中型 ( 约 6mm 左右 )， 除 ISP1 外， 孢子量丰富， 基内菌丝发达， 菌丝与培养基结合紧密， 不易挑起。在 ISP1， ISP2 培养基上 无色素产生， 在 ISP3 上有土黄灰色色素产生。 0010 本发明描述了链霉菌 HS7522 的形态学和分子水平上的特征， 经过和已知米尔贝 霉素生产菌进行形态学和分子水平的比较， 可以认定链霉菌 HS7522 属吸水链霉菌。链霉 菌 H

12、S7522 与 Streptomyces sp.NRRL 5739 16s rRNA 同源性 99.5， 与 Streptomyces bingchenggensis BCW-1 同源性 99.9。本菌株与多数米尔贝生产菌在形态上最大的差异 在于其他菌种如 Streptomyces sp.CGMCC 7677 的菌落在生产平板上会分泌金黄泪珠体于 菌落表面。而 HS7522 在同样的培养基上颜色鼠灰， 表面无泪珠 ( 见附图 1)。 0011 本发明的还提供了一种采用链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)制备米尔贝霉素的方 法。该方法包括采用链霉菌 HS7522(CGMCC NO.9

13、671) 在含有可同化的碳、 氮源的营养培养 基里， 进行有氧发酵的过程。 0012 优选的实施方案中， 上述可同化的碳源优选自淀粉、 糊精、 葡萄糖、 工业糖蜜、 甘 油、 蔗糖、 乳糖、 麦芽糖、 海藻糖、 木聚糖、 甘露醇、 山梨醇之一或上述物质的组合。 0013 优选的实施方案中， 上述可同化的氮源优选自酵母抽提物、 酵母粉、 牛肉浸膏、 胰 蛋白胨、 蛋白胨、 脱脂奶粉， 全脂奶粉， 黄豆饼粉、 棉籽饼粉、 花生饼粉、 麸质粉、 玉米浆干粉、 麸皮、 尿素、 铵盐之一或上述物质的组合。 0014 优选的实施方案中， 所述发酵培养的温度优选为 20 -40， 优选 25 -35， 培

14、养基 pH 为 6.0-8.0， 优选 7.0 左右 ； 培养时间为 300-360 小时 ； 通氧量为 0.5-1.0vvm。 0015 所述发酵方式为液体深层发酵。 0016 米尔贝霉素可以通过以下方法进行检测 ： 0017 取发酵液 0.5ml， 加入 4.5ml 75乙醇， 混合均匀， 3000rpm、 15 分钟离心， 取上层 液进样。 0018 HPLC 柱 ： Zorbex RX-C8 ； 150mm*4.6mm ； 5m 说 明 书 CN 106148215 A 4 3/10 页 5 0019 紫外吸收波长 ： 240nm 0020 温度控制 ： 摄氏 22 度 0021 HP

15、LC 流动相条件 ： 梯度洗脱 0022 0023 0024 进样量 ： 10l 0025 本发明采用的米尔贝霉素产生菌为链霉菌 HS7522(CGMCC NO.9671)、 链霉菌 HS7522(CGMCC NO.9671) 自发的突变株或通过常规的诱变得到的突变株。 0026 本发明的主要优点在于 ： 0027 1. 本发明提供了一种生产米尔贝霉素的新菌链霉菌 HS7522 及其生产米尔贝霉素 的方法。本发明链霉菌 HS7522 的特点在于其发酵液中米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总 含量的百分比大于 80， 且米尔贝霉素 A4 的单位产量可以达到大于 4000ug/ml， 米

16、尔贝霉 素 A3+A4 的单位产量可以达到大于 5000ug/ml， 发酵单位高， 杂质含量低。 0028 2.由于本发明所述的链霉菌HS7522通过发酵方法提高米尔贝霉素A4在发酵产物 中的比例， 降低了制备米尔贝霉素 A4 单一组分的难度， 有利于降低生产成本和扩大米尔贝 霉素 A4 单组分的应用范围。 0029 3.提高了米尔贝霉素A4发酵单位。 本发明所述的链霉菌HS7522生产米尔贝霉素 A4 的效价较原始菌 Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677 大幅提高， 有利于实现 产业化生产。 附图说明 ： 0030 图 1 ： 本 发 明 链 霉

17、 菌 HS7522 菌 株 的 菌 落 形 态 与 链 霉 菌 Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677 对比图， 其中 B 为链霉菌 Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677 菌落形态， A 为本发明链霉菌 HS7522 菌落形态。 0031 图 2 ： 本发明链霉菌 HS7522 在实施例 6 的 50L 发酵罐中生产米尔贝霉素 A3 和 A4 的发酵曲线。 0032 图3 ： 本发明链霉菌HS7522在实施例6条件下产生的米尔贝霉素A4的HPLC图谱， 说 明 书 CN 106148215 A 5 4/1

18、0 页 6 米尔贝霉素 A4 含量为 4100mg/L， A3 含量 962mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含 量的百分比为 81。 具体实施方式 0033 实施例 1 ： 菌株来源 0034 本发明链霉菌 Streptomyces hygroscopicus HS7522 系在米尔贝霉素产生菌种 Streptomyces milbemycinicus CGMCC 7677(见中国专利CN103789339A)的基础上， 通过多 轮的诱变选育 ( 包括 NTG， EMS， UV 等诱变手段 ) 得到的米尔贝霉素 A4 高比例菌种。该菌种 与原始菌种相比， 其外观形态发

19、生了较大的变化， 属于形态突变株。 0035 链霉菌 Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677 菌株在 ISP3 斜面培养基 中 28培养 10-12 天后， 在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下， 在磨口试管中磨碎菌丝体 并悬浮于无菌水中， 制得菌悬液， 采用 NTG( 亚硝基胍 )， EMS( 甲基磺酸乙酯 )， UV( 紫外线 ) 诱变处理。 0036 称取 NTG 晶体 10mg， 溶解在 10ml 无菌 Tris 缓冲液 (pH8.0) 中， 再用移液管加入 1ml菌悬液， 置于28培养基中旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。 将处理过的菌悬

20、液 经适当稀释涂布于 ISP3 平板上。未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于 ISP3 平板作 为对照。28培养 10 天后， 检查菌落数， 并计致死率。 0037 取 10-1或 10 -2梯度的单细胞菌悬液 5ml-10ml 到带一根回形针的平板内 ( 直径 9cm)， 置 UV 诱箱内 , 置磁力搅拌器上， 开盖于 UV15W， 30cm 处照射数分钟 ( 一般 2-5 分钟 )， 边照边搅拌， 照后用黑布包好 . 然后用生理盐水 (0.9氯化钠溶液 ) 稀释 10-210-7， 分别 涂 ISP3 平板得诱变组。 0038 吸取 1ml EMS 溶于 2ml 无水乙醇中， 再加入 2

21、2ml， pH7.2 的 0.1mol/L 磷酸缓冲液。 取 10-1或 10 -2梯度的单细胞菌悬液 5ml 到带一根回形针的平板内， 加入 5ml， 4.0 EMS 溶 液， 最后 EMS 溶液浓度为 2.0， 置磁力搅拌器上， 搅拌处理 20 分钟至 60 分钟。诱变平板内 加入 10ml 5的硫代硫酸钠即可中止反应， 用生理盐水依次稀释 10-210-7， 涂 ISP3 平板 得诱变组。 0039 挑选经过多轮上述单个或组合诱变后的单菌落不少于 10000 株， 进行摇瓶 发酵， HPLC 检测米尔贝霉素的产量。经过多轮诱变， 筛选出突变菌株 Streptomyces hygrosco

22、picus HS7522。 0040 实施例 2 ： 链霉菌 HS7522 菌种培养特征 0041 参照 链霉菌鉴定手册 、放线菌的分类与鉴定 、常见细菌系统鉴定手册 中的 有关内容进行实验。 0042 采用 ISP1、 ISP2、 ISP3、 ISP4、 ISP5、 高氏一号、 苹果酸钙、 营养琼脂、 YMS 和查氏十 种培养基， 28培养 7 10 天后， 观察菌丝体的颜色及色素情况 ( 培养特征见表 1)。 0043 表 1 链霉菌 HS7522 在 10 种培养基上的培养特征 0044 说 明 书 CN 106148215 A 6 5/10 页 7 0045 备注 ： 表 1 中 “/

23、” 为不产生色素。 0046 实施例 3 ： 生理生化试验 0047 参照 链霉菌鉴定手册 、放线菌的分类与鉴定 、常见细菌系统鉴定手册 中的 有关内容进行实验。除温度实验外， 均为 28培养 7 10 天。 0048 1) 碳源的利用 ： 采用 ISP9 作为基础培养基， 各种碳源的终浓度均为 1.0。( 结 果见表 2) 0049 2) 无机氮源的利用 ： 采用 ISP9 作为基础培养基， 硝酸钾和硫酸铵的浓度均为 0.1。( 结果见表 2) 0050 3) 降解试验和 NaCl 耐受实验 ( 结果见表 7) 采用基础培养基为 GYEA(pH6.8)， 各 种降解物的浓度见表 3。( 结果

24、见表 3) 0051 4) 氧化酶和过氧化氢酶试验 ( 结果见表 4)、 pH 试验 ( 结果见表 5) 和温度试验 ( 结果见表 6) 均采用 YMS 培养基。 0052 表 2 链霉菌 HS7522 菌株的碳源和氮源的利用情况 0053 说 明 书 CN 106148215 A 7 6/10 页 8 0054 表 3 链霉菌 HS7522 菌株的降解试验结果 0055 0056 表 4 链霉菌 HS7522 菌株主要的生理生化特征 0057 0058 0059 表 5 链霉菌 HS7522 菌株生长的 pH 试验 0060 0061 表 6 链霉菌 HS7522 菌株生长的温度试验 006

25、2 0063 表 7 链霉菌 HS7522 菌株对 NaCl 的耐受性 0064 说 明 书 CN 106148215 A 8 7/10 页 9 0065 备注 ： 表 2-7 中， 0 ： 无生长 ； 1 ： 生长很弱 ； 2 ： 能生长， 有少量孢子 ； 3 ： 生长良好， 有 大量孢子 ； 4 ： 生长最好， 有丰富孢子 ； + ： 阳性 ； - ： 阴性。 0066 实施例 4 ： 16S rDNA 序列分析 0067 收集在 ISP2 上生长好的本发明菌丝体， 接于含玻璃珠的 TSB 液体培养基中， 置于 28的培养箱中， 250r/min 震荡培养 2-4d。离心收集菌丝体， 用无

26、菌水洗涤 2 次后保存于 4备用。 0068 (1) 菌丝体 1000rpm 离心 1min。 0069 (2) 加终浓度为 3-4mg/ml 的溶菌酶溶液 ( 菌丝体体积 : 溶菌酶溶液体积 1:5-10)， 37水浴 1-3hr。 0070 (3) 加 50-100ug/ml 蛋白酶 K 及 1 SDS， 37水浴 0.5-3h。 0071 (4) 加等体积的中性酚 / 氯仿， 振荡 30sec， 12000rpm 离心 5min。 0072 (5) 上清加 1/10 体积的 3M NaAc 溶液和等体积的异丙醇， 混匀。室温放置 5min， 12000rpm 离心 5min。 0073

27、(6) 沉淀用 70乙醇洗涤 2 遍， 干燥后溶于 TE/RNase。 0074 (7) 将提取的基因组作为模板， 采用通用引物进行 PCR 扩增。 0075 上游引物 27F 为 5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 0076 下游引物 1495R 为 5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 0077 反应在 PCR 扩增仪上进行。其程序是 ： 95预变性 5min， 94变性 45s， 55复性 45s， 72延伸 90s， 进行 30 个循环， 72延伸 10min。反应体系如下 ： 0078 0079 用 0.8琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。选用条带清晰

28、的产物进行纯化。扩增产 物经凝胶电泳回收， 并连接到T载体后进行测序， 获得了该菌株16S rDNA一级结构的序列。 通过在 Genebank 数据库中进行相似性搜索 (blast)， 结果显示与 Streptomyces sp.NRRL 573916s rRNA 同源性 99.5， 与 Streptomyces bingchenggensis BCW-1 同源性 99.9。 0080 表 8 链霉菌 HS7522 和相关菌株的同源性 0081 说 明 书 CN 106148215 A 9 8/10 页 10 0082 链霉菌 HS7522 与已知的米尔贝霉素产生菌的比较 0083 据 CN1

29、01100651A 报 道，米 尔 贝 霉 素 产 生 菌 冰 城 链 霉 菌 (streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734 在高氏一号培养基上菌落表面灰色 ( 有黑色吸水 斑)， 菌落背面黄灰色， 有黄褐色色素产生。 而本发明链霉菌HS7522在高氏一号培养基上菌 落表面白色， 菌落背面米褐色， 无色素产生。 0084 据 US3950360 报道， 米尔贝霉素产生菌 Streptomyces NRRL NO.5739 在 ISP2 培养 基上气生菌丝灰色， 背面黄褐色， 菌落表面有许多黄色泪珠， 有黄色色素产生 ； 在 ISP4 培养 基上

30、气生菌丝灰色， 背面土黄， 菌落表面也有许多黄色泪珠， 有明亮的橄榄绿会色素产生， 能够利用阿拉伯糖和木糖。而本发明链霉菌 HS7522 在 SP2 培养基上气生菌丝卵石灰， 背面 米红色， 菌落表面无泪珠， 无色素产生 ； 在 ISP4 培养基上气生菌丝象牙色， 背面象牙色， 菌 落表面无泪珠， 无色素产生， 不能利用阿拉伯糖和木糖。 0085 综上所述， 本发明链霉菌 HS7522 属于链霉菌属， 但它不同于已知的米尔贝霉素产 生菌 Streptomyces NRRL NO.5739， 菌冰城链霉菌 (streptomyces bingchengsis sp.nov) CGMCC NO.1

31、734， 链霉菌 HS7522 是一株全新的菌种。 0086 实施例 5 ： 制备米尔贝霉素 A4 0087 (1) 斜面菌丝体的制备与培养 0088 斜面孢子培养基配方 (g/L) ： 酵母抽提物 2， 麦芽抽提物 2， 蔗糖 10， 脱脂奶粉 1.2， 琼脂 20， 消前 pH 7.0-7.2， 试管 30200mm， 装量 20mL， 经 121灭菌 20 分钟后， 冷却到 50-60摆斜面， 接入一环菌丝体经 281培养 10 天后， 菌丝成熟。 0089 (2) 种子液的制备与培养 0090 种子培养基配方 (g/L) ： 酵母抽提物 5， 蛋白胨 5， 蔗糖 20， 脱脂奶粉 3，

32、 磷酸氢二钾 0.8， 消前 pH6.8-7.2， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 121灭菌 20 分钟。菌体接种 量为 105-106c.f.u./mL， 培养温度 281， 250rpm， 摇床振荡培养 48 小时。 0091 (3) 米尔贝霉素 A4 发酵培养基的制备与培养 0092 发酵培养基配方 (g/L) ： 酵母抽提物 5， 蔗糖 100， 脱脂奶粉 11， 黄豆饼粉 10， 棉籽 饼粉14， 磷酸氢二钾1， 七水硫酸亚铁0.1， 硫酸锌0.02， 碳酸钙5， 硫酸铜0.05， 钼酸钠0.5， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 121灭菌

33、20 分钟。将种子液以 10 ( 体积百分 比 ) 的接种量接入， 在 281， 250rpm 摇床振荡培养 14 天， 发酵结束后， 发酵液经 HPLC 测 定， 测得米尔贝霉素A4含量为3900mg/L， A3含量为967mg/L， 米尔贝霉素A4的含量占A3和 A4 总含量的百分比为 80.1。实施例 6 ： 制备米尔贝霉素 A4 0093 (1) 种子罐种子液的制备 说 明 书 CN 106148215 A 10 9/10 页 11 0094 在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例5， 同时添加 0.25的泡敌作消泡剂 )， 灭菌采用蒸汽灭菌， 121条件下

34、30 分钟， 待冷却后， 接入 200ml 摇瓶种子液， 培养温度 281， 搅拌转速 150rpm， 通气量 1vvm， 培养 48 小时。 0095 (2) 发酵罐培养基的配制与培养 0096 发酵培养基的配方与前述实施例 5 相同， 但要添加 0.25泡敌作为消泡剂， 发酵 罐50L， 投料体积为35L， 消前pH7.0-7.6， 于121下蒸汽灭菌25分钟， 冷却后， 接入约3.5L 种子罐培养液， 发酵温度 281， 搅拌桨转速底限 150rpm， 与溶氧关联， 溶氧不低于 35。 通气量为 0.6vvm， 发酵培养 14 天， 放罐， 发酵液经 HPLC 测定， 测得米尔贝霉素 A

35、4 含量为 4100mg/L， A3 含量为 962mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比为 81。 0097 实施例 7 ： 制备米尔贝霉素 A4 0098 (1) 种子罐种子液的制备 0099 在 15T 种子罐中投入 8T 的种子培养基 ( 种子培养基的配比见实施例 5， 同时添加 0.25的泡敌作消泡剂 )， 灭菌采用蒸汽灭菌， 121条件下 35 分钟， 消后体积 10T， 待冷却 后， 接入2L摇瓶种子液， 培养温度281， 搅拌转速100rpm， 通气量0.8vvm， 培养48小时。 0100 (2) 发酵罐培养基的配制与培养 0101 发酵培养基

36、的配方与前述实施例 5 相同， 但要添加 0.3泡敌作为消泡剂， 发酵罐 70T， 投料体积为55T， 消前pH6.8-7.6， 于121下蒸汽灭菌35分钟， 冷却后， 接入约6T种子 罐培养液， 发酵温度 281， 搅拌桨转速底限 50rpm， 与溶氧关联， 溶氧不低于 35。通气 量为0.5vvm， 发酵培养14天， 放罐， 发酵液经HPLC测定， 测得米尔贝霉素A4含量为4020mg/ L， A3 含量为 961mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比为 80.7。 0102 实施例 8 ： 制备米尔贝霉素 A4 0103 种子培养基配方 (g/L) ： 酵

37、母浸粉 5， 蛋白胨 5， 蔗糖 40， 磷酸氢二钾 0.5， 消前 pH7.0-7.4。摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 25mL， 经 121灭菌 20 分钟。从实施例 5 中的斜 面上挖取12cm面积的菌块接入种子瓶中， 281下培养45hr。 取上述种子培养液2.5mL 接入发酵培养基 ： 酵母膏 12， 糖蜜 200， 脱脂奶粉 11， 黄豆饼粉 11， 棉籽饼粉 11， 磷酸氢二钾 1， 七水硫酸亚铁 0.1， 硫酸锌 0.02， 碳酸钙 5， 硫酸铜 0.05， 钼酸钠 0.5， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 121灭菌 20 分钟， 在 281， 250

38、rpm 摇床振荡培养 14 天， 发酵结束， 发酵液经 HPLC 测定， 测得米尔贝霉素 A4 的含量为 3960mg/L， A3 含量为 929mg/L， 米尔贝霉 素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比为 81。 0104 实施例 9 ： 制备米尔贝霉素 A4 0105 种子液按实施例8进行， 然后2.5mL种子液接入发酵培养基 ： 蛋白胨10， 蔗糖140， 玉米浆 10， 黄豆饼粉 10， 麸质粉 15， 磷酸氢二钾 1， 七水硫酸亚铁 0.1， 硫酸锌 0.02， 碳酸钙 5， 硫酸铜 0.05， 钼酸钠 0.5， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 12

39、1灭菌 20 分钟， 在 281， 250rpm 摇床振荡培养 14 天， 发酵结束后， 发酵液经 HPLC 测定， 测得米尔贝霉素 A4 的含量为 4100mg/L， A3 含量为 900mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比 为 82。对比实施例 1 ： 本发明链霉菌 HS7522 与原始菌 CGMCC 7677 生产米尔贝霉素的对 比实验 0106 (1) 斜面， 种子， 发酵培养基组成和培养条件同实施例 5， 菌种采用原始菌 CGMCC 7677， 进行五组平行发酵培养， 发酵结束后， 发酵液经HPLC测定， 测得米尔贝霉素A4的平均 说 明 书 CN

40、106148215 A 11 10/10 页 12 含量为 729mg/L， A3 的平均含量为 297mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百 分比为 71。 0107 (2) 斜面， 种子， 发酵培养基组成和培养条件同实施例 5， 菌种采用本发明链霉菌 HS7522， 进行五组平行发酵培养， 发酵结束后， 发酵液经HPLC测定， 测得米尔贝霉素A4的平 均含量为 4016mg/L， A3 的平均含量为 942mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的 百分比为 81。 说 明 书 CN 106148215 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106148215 A 13 2/2 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 106148215 A 14