1、(10)授权公告号 CN 101475946 B (45)授权公告日 2013.06.26 CN 101475946 B *CN101475946B* (21)申请号 200910045445.0 (22)申请日 2009.01.16 C12N 15/52(2006.01) C12N 9/00(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 上海师范大学 地址 200234 上
2、海市徐汇区桂林路 100 号 (72)发明人 开国银 廖攀 张林 周伟 董彦君 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 何葆芳 CN 101319220 A,2008.12.10, Hua W.P., Wang Z.Z. 登录号 ： FJ178784. GenBank .2008, Hua W.P., Wang Z.Z. 登录号 ： FJ178784. GenBank .2008, 周伟.丹参叶遗传转化体系的建立及HMGR基 因 3 片段的克隆 .优秀硕士学位论文全文数据 库 农业科技辑 .2008,( 第 5 期 ), (54) 发明名称 丹参牻牛儿基牻牛
3、儿基焦磷酸合成酶基因及 其编码的蛋白质和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种丹参牻牛儿基牻牛儿基焦 磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用， 填补 了从我国传统中药材丹参中分离克隆出牻牛儿基 牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的空白。本发明所提 供的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因具有 SEQ ID No.1 中所示的第 73 1167 位核苷酸序 列， 其编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基 酸序列。本发明的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成 酶基因可通过基因工程技术提高丹参中萜类活性 成分丹参酮的含量， 有助于丹参药材的品质改良， 具有很好的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件
4、审查员 王启扬 权利要求书 1 页 说明书 14 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书14页 (10)授权公告号 CN 101475946 B CN 101475946 B *CN101475946B* 1/1 页 2 1. 一种丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因， 其特征在于， 所述基因由 SEQ ID No.1 中所示的第 73 1167 位核苷酸序列构成。 2. 一种权利要求 1 所述的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因编码的蛋白质， 其 特征在于， 所述蛋白质由 SEQ ID No.2 所示氨基酸序列构成。 3. 一种质粒， 其特征在于
5、， 含有权利要求 1 所述基因的全序列。 4. 一种植物表达载体， 其特征在于， 含有权利要求 1 所述基因的全序列。 5. 一种宿主细胞， 其特征在于， 含有权利要求 1 所述基因的全序列。 6. 根据权利要求 5 所述的宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、 农杆 菌细胞、 酵母细胞、 烟草细胞或丹参细胞。 7. 根据权利要求 6 所述的宿主细胞， 其特征在于， 所述的丹参细胞为丹参发根细胞。 8. 一种权利要求 1 所述的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用， 其特征在 于， 用权利要求 4 所述的植物表达载体转化丹参细胞。 9. 一种权利要求 1 所述的丹参牻牛儿
6、基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用， 其特征在 于， 用含有权利要求 1 所述基因的农杆菌细胞与丹参细胞共培养雄性不育植株。 10. 一种权利要求 1 所述的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用， 其特征 在于， 用含有权利要求 1 所述基因的农杆菌细胞与丹参发根细胞培育雄性不育植株。 11. 一种权利要求 1 所述的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用， 其特征 在于， 用权利要求 1 所述的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因序列提供一种转基因丹 参。 权 利 要 求 书 CN 101475946 B 2 1/14 页 3 丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白 质和应用
7、 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体说， 是涉及在丹参中表达的牻牛儿基牻牛儿基焦 磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用。 背景技术 0002 心脑血管疾病是目前对人类威胁最大的三大类疾病之一， 且是位于这三大疾病之 首。据统计， 全世界每年大约有 1700 万人死于心脑血管疾病， 约占全球总死亡人数的 1/3 ； 我国每年大约有 260 万人死于心脑血管疾病， 心脑血管疾病已成为威胁全人类健康与生命 的 “头号杀手” 。因此积极研究及开发高效、 低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对 提高人类健康水平具有十分深远的意义。 0003 中药丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvi
8、a miltiorrhiza Bunge)的干燥根及 根茎， 因其色红且形状似参而得名 “丹参” ， 是一种主治心血管系统疾病的常用中药。 丹参作 为一种传统中药材在我国沿用已久， 始载于 神农本草经 ， 被列为上品。 本草经疏 、本草 纲目 中亦有记载。传统中医认为丹参具有祛瘀止痛、 活血通经、 清心除烦的作用， 主治冠 心病、 心绞痛、 心烦不眠、 月经不调、 经闭痛经等症。现代药理研究表明丹参对心血管系统， 血液系统的疾病疗效十分显著。以丹参为主的多种复方制剂如复方丹参注射液、 复方丹参 片、 复方丹参胶囊和复方丹参滴丸等， 被临床广泛用于治疗心血管疾病、 肾病、 肝病及抗感 染等， 近
9、年来还发现丹参具有抗肿瘤活性， 因此， 丹参在临床上具有十分广泛的用途。然而 由于丹参的市场需求巨大， 而野生资源日益减少， 加之丹参为多年生草本植物， 其生长周期 较长， 药用活性成分含量低， 在传统的栽培模式下， 面临着品质严重退化及品种选育成本过 高等诸多弊端。因此， 如何使得丹参这一原料药材的供应在数量和质量上能更好地满足临 床应用的需求成了一个研究热点。 0004 研究表明 ： 利用现代基因工程技术将丹参药用活性成分生物合成途径中的关键酶 基因导入到丹参中， 获得转基因的发根、 细胞系或再生植株， 并进行大规模的培养， 是提高 丹参药用活性成分的含量和拓展丹参活性产物来源的最佳途径之
10、一。 而丹参活性成分主要 分为两大类 ： 即脂溶性二萜类化合物 ( 丹参酮 I、 丹参酮 II A、 隐丹参酮等 ) 和水溶性酚酸 类化合物(丹酚酸A、 丹酚酸B、 紫草酸、 迷迭香酸、 原儿茶醛、 丹参素等)， 牻牛儿基牻牛儿基 焦磷酸合成酶 (GGPPS) 催化 15 碳的法呢基焦磷酸 (FPP) 与另一个 5 碳分子异戊烯基焦磷 酸 (IPP) 可合成 20 碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 (GGPP)， GGPP 是二萜类物质 ( 包括丹参 酮和青蒿素等 ) 的生物合成的关键前体物质。由于牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因编 码的酶对于丹参酮类二萜成分的生物合成具有显著影响， 因此， 这一步
11、是利用基因工程技 术来调控丹参酮生物合成的关键切入点。 但至今尚未有从药物植物丹参中分离克隆出全长 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的文献报道。 发明内容 说 明 书 CN 101475946 B 3 2/14 页 4 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基 因及其编码的蛋白质和应用， 以填补从我国药物植物丹参中分离克隆出牻牛儿基牻牛儿基 焦磷酸合成酶基因的空白。 0006 本发明所提供的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因， 是具有 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列或者添加、 取代、 插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基 因及其衍生的
12、核苷酸序列。 0007 本发明所提供的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因编码的蛋白质， 是具有 SEQ IDNo.2 所示的氨基酸序列或者添加、 取代、 插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。 0008 含有本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因全序列或部分片段的质 粒和植物表达载体均属于本发明的保护范围。 0009 一种宿主细胞， 该细胞含有本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因或 质粒或植物表达载体的基因序列。 0010 所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、 农杆菌细胞、 酵母细胞、 烟草细胞、 丹参发根细胞、 丹参细胞或其它植物细胞， 优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或丹参发根细胞。
13、0011 本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的应用， 包括用所述的植物表 达载体转化丹参细胞或者用所述的农杆菌与丹参细胞共培养或者用所述的丹参发根细胞 培育雄性不育植株或者用所述的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因序列提供一种转基 因丹参。 0012 本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下 ： 0013 本发明所说的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的 DNA 分子包括 ： 编码具 有丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶活性的多肽的核苷酸序列， 而且所述的核苷酸序列 与 SEQ IDNO.1 中从核苷酸第 73 1167 位的核苷酸序列有至少 70的同源性 ； 或者所述 的核苷酸序列能在
14、 40 55条件下与 SEQ ID NO.1 中从核苷酸第 73 1167 的核苷酸序 列杂交。较佳地， 所述的序列编码具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列的多肽。更佳地， 所 述的序列具有 SEQID NO.1 中从核苷酸第 73 1167 位的核苷酸序列。 0014 本发明分离出的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶多肽包括 ： 具有 SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段， 或其活性衍生物。 较佳地， 该 多肽是具有 SEQ ID NO.2 序列的多肽。 0015 本发明中的 DNA 分子包含所述的 DNA 分子中 8 100 个连续核苷酸。
15、0016 在本发明中，“分离的” 、“纯化的” DNA 是指 ： 该 DNA 或片段已从天然状态下位于其 两侧的序列中分离出来， 或指该 DNA 或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且 已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。 0017 本发明中术语 “丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 ( 或多肽 ) 基因” 是指 ： 编码 具有丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶活性的多肽的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.1 中第 73 1167 位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于 SEQ ID NO.1 序列的编码框 第 73 1167 位核苷酸中， 有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简
16、并密码子所取代后 而产生的序列。由于密码子的简并性， 所以与 SEQ ID NO.1 中第 73 1167 位核苷酸序列 同源性低至约70的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。 还包括能在中度严谨 条件下， 更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第731167位的核苷酸序列 说 明 书 CN 101475946 B 4 3/14 页 5 杂交的核苷酸序列。还包括与 SEQ ID NO.1 中从核苷酸第 73 1167 位的核苷酸序列的同 源性至少70， 较佳地至少80， 更佳地至少90， 最佳地至少95的核苷酸序列。 还包括 能编码具有与天然的丹参牻牛儿基牻牛
17、儿基焦磷酸合成酶相同功能的蛋白的 SEQ IDNO.1 中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括 ( 但并不限于 ) ： 若干个 ( 通常为 1 90 个， 较佳地 1 60 个， 更佳地 1 20 个， 最佳地 1 10 个 ) 核苷酸的缺失、 插入和 / 或 取代， 以及在 5 和 / 或 3 端添加数个 ( 通常为 60 个以内， 较佳地为 30 个以内， 更佳地为 10 个以内， 最佳地为 5 个以内 ) 核苷酸。 0018 本发明中术语 “丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶蛋白或多肽” 是指 ： 具有丹参 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶活性的 SEQ ID NO.2 序列的多肽。该术
18、语还包括具有与天 然丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶相同功能的 SEQ ID NO.2 序列的变异形式。这些变 异形式包括 ( 但并不限于 ) ： 若干个 ( 通常为 1 50 个， 较佳地 1 30 个， 更佳地 1 20 个， 最佳地 1 10 个 ) 氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一 个或数个 ( 通常为 20 个以内， 较佳地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内 ) 氨基酸。例如， 在 本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改
19、变蛋白质的功能。该术语还包 括丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的活性片段和活性衍生物， 还包括能够可操作地连 于信号肽、 启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。 0019 本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶多肽的变异形式包括 ： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导突变体、 在高或低的严谨条件下能与丹参牻 牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 DNA 杂交的 DNA 所编码的蛋白、 以及利用丹参牻牛儿基牻牛 儿基焦磷酸合成酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。 0020 本发明中丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶保守性变异多肽是指 ： 与 SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比
20、， 有至多10个， 较佳地至多8个， 更佳地至多5个氨基酸性质相似或 相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表 1 进行替换而产生。 0021 表 1. 保守性变异多肽中的取代残基 0022 最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val ； Leu ； Ile Val Arg(R) Lys ； Gln ； Asn Lys Asn(N) Gln ； His ； Lys ； Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp 说 明 书 CN 101475946 B 5 4/14 页
21、 6 Gly(G) Pro ； Ala Ala His(H) Asn ； Gln ； Lys ； Arg Arg Ile(I) Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe Leu Leu(L) Ile ； Val ； Met ； Ala ； Phe Ile Lys(K) Arg ； Gln ； Asn Arg Met(M) Leu ； Phe ； Ile Leu Phe(F) Leu ； Val ； Ile ； Ala ； Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr ； Phe Tyr Tyr(Y)
22、 Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val(V) Ile ； Leu ； Met ； Phe ； Ala Leu 0023 本发明还包括丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶或多肽的类似物。 这些类似物 与天然牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是 不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体可以通过各种技术得到， 如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还可通 过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然 L- 氨基酸的 残基 ( 如 D- 氨基酸 ) 的类似物， 以及
23、具有非天然存在的或合成的氨基酸 ( 如 、 - 氨基 酸)的类似物。 应理解， 本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。 所述修饰(通常 不改变一级结构 ) 形式包括 ： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰 还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生 的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶 ( 如哺乳动物的糖基化酶或去糖 基化酶 ) 而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 ( 如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷 酸苏氨酸 ) 的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 0024 在本发明中， 可
24、选用本领域已知的各种载体， 如市售的载体， 包括质粒， 粘粒等。 在 生产本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶多肽时， 可以将丹参牻牛儿基牻牛儿基 焦磷酸合成酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列， 从而形成丹参牻牛儿基牻牛 儿基焦磷酸合成酶表达载体。所述 “可操作地连于” 指这样一种状况， 即线性 DNA 序列的某 些部分能够影响同一线性 DNA 序列其他部分的活性。例如， 如果信号肽 DNA 作为前体表达 并参与多肽的分泌， 那么信号肽 ( 分泌前导序列 )DNA 就是可操作地连于多肽 DNA ； 如果启 说 明 书 CN 101475946 B 6 5/14 页 7 动子控制序列
25、的转录， 那么它是可操作地连于编码序列 ； 如果核糖体结合位点被置于能使 其翻译的位置时， 那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于” 意味着相邻， 而 对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。 0025 本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆 菌 ； 常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 烟草细胞和其它植物细胞。 0026 本发明还可用 Northern 印迹法技术分析丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基 因产物的表达， 即分析丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的 RNA 转录物在细胞中的存在 和数量。 0027 此外， 本发明中可用作探针的核酸分子通常具有丹
26、参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合 成酶核苷酸编码序列的 8 100 个连续核苷酸， 较佳地具有 15 50 个连续核苷酸。该探 针可用于检测样品中是否存在编码丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的核酸分子。 0028 本发明涉及检测样品中是否存在丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶核苷酸序 列的方法， 它包括用上述的探针与样品进行杂交， 然后检测探针是否发生了结合。较佳地， 该样品是 PCR 扩增后的产物， 其中 PCR 扩增引物对应于丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成 酶核苷酸编码序列， 并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为 15 50 个核苷 酸。 此外， 根据本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合
27、成酶核苷酸序列和氨基酸序列， 可 以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上， 筛选丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 源基因或同源蛋白。 0029 为了得到与丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶相关的丹参 cDNAs 的点阵， 可以 用DNA探针筛选丹参cDNA文库， 这些探针是在低严谨条件下， 用 32P对丹参牻牛儿基牻牛儿 基焦磷酸合成酶基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的 cDNA 文库是 来自丹参的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的 cDNA 文库的方法是分子生物学领域 众所周知的。另外， 许多这样的 cDNA 文库也可以购买到， 例如购自 Clontech， Strata
28、gene， Palo Alto， Cal.。 这种筛选方法可以识别与丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的基因家 族的核苷酸序列。 0030 本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶核苷酸全长序列或其片段通常可 以用 PCR 扩增法、 重组法或人工合成的方法获得。对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开 的有关核苷酸序列， 尤其是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA 库或按本领域技 术人员已知的常规方法所制备的 cDNA 库作为模板， 扩增而得有关序列。当序列较长时， 常 常需要进行两次或多次 PCR 扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一 旦获得了有关的序列， 就
29、可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入 载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外， 本发明蛋白 的片段还可用固相技术， 通过直接合成肽而加以生产 (Stewart 等人， (1969)Solid-Phase Peptide Synthesis， WH Freeman Co.， San Francisco ； Merrifield J.(1963)J.Am Chem. Soc 85 ： 2149 2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如， 可以用 Applie
30、d Biosystems 的 431A 型肽合成仪 (Foster City， CA) 来自动合成肽。可以分别化学合成本 发明蛋白的各片段， 然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的丹参牻牛 儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶， 通过各种常规筛选方法， 可筛选出与丹参牻牛儿基牻牛儿基 说 明 书 CN 101475946 B 7 6/14 页 8 焦磷酸合成酶发生相互作用的物质， 或者受体、 抑制剂或拮剂等。 0031 本发明提供的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因是首次从丹参中克隆制备的， 可以通过基因工程技术来提高丹参等植物中丹参酮的含量， 转基因结果显示， 丹参牻牛儿 基牻牛儿基焦磷酸合
31、成酶基因对促进丹参酮含量的提高有明显作用， 丹参牻牛儿基牻牛儿 基焦磷酸合成酶基因可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中， 尤其可 用于中药材丹参的品质改良， 对于缓解丹参酮药源严重匮乏问题具有较好的促进作用， 因 此本发明具有很好的应用前景。 具体实施方式 0032 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0033 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按
32、照常规条件， 例如 Sambrook 等 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述 的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0034 实施例 1( 丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆 ) 0035 1. 组织分离 (isolation) 0036 丹参植株来源于河南， 采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。 0037 2.RNA 的分离 (RNA isolation) 0038 取部分组织用研钵研碎， 加入盛有裂解液的1.5mL EP管， 充分振荡后， 再移入玻璃 匀浆器内。匀浆后移至
33、1.5mL EP 管中， 抽提总 RNA(TRIzol Reagents， GIBCO BRL， USA)。用 甲醛变性胶电泳鉴定总 RNA 质量， 然后在分光光度计上测定 RNA 含量。 0039 3. 基因的全长克隆 (Cloning of Full-length cDNA) 0040 根据曼地亚红豆杉， 野生烟草及其它已克隆得到的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合 成酶氨基酸保守序列， 设计简并引物， 利用同源性基因克隆原理， 采用 Smart-RACE 方法 (Clonetech 试剂盒 ) 进行 cDNA 全长克隆， 分三个阶段进行 ： 0041 (1)3 -RACE 0042 PCR(UPM
34、+F2)得到SmGGPPS F2 (695bp)， 回收， 连接到T-Easy载体上， 用SP6或T7 作为通用引物， 采用终止物荧光标记(Big-Dye， Perkin-Elmer， USA)的方法， 在ABI 3730测 序仪 (Perkin-Elmer， USA) 上进行测序。测序结果用 GCG 软件包 (Wisconsin group， USA) 中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)， 结果表明其核酸序列及编码 蛋白与已知 GGPPS 基因 ( 如野生烟草 GGPPS 基因等 ) 的同源性很高， 故初步认为它是一个 GGPPS 基因。 0043
35、(2)5 -RACE 0044 根 据 3 RACE 结 果， 设 计 反 向 特 异 引 物 R2， 经 PCR(UPM+R2) 得 到 SmGGPPS R2(748bp)(过程同(1)。 回收， 连接到T-Easy载体上， 用SP6或T7作为通用引物， 采用终 止物荧光标记 (Big-Dye， Perkin-Elmer， USA) 的方法， 在 ABI 3730 测序仪 (Perkin-Elmer， USA) 上进行测序。 说 明 书 CN 101475946 B 8 7/14 页 9 0045 (3) 将 5 RACE 测序结果与 3 RACE 测序结果比序并进行拼接， 得到全长片段 序
36、列信息， 并设计一对特异引物 SmGGPPS KF1(5 -ATGAGATCTATGAATCTGGT-3 )(SEQ ID NO.3) 和 SmGGPPS KR1(5 -TTAGTTCTGCCTATGTGCAA-3 )(SEQ ID NO.4) 进行 PCR 扩增 SmGGPPS 编码区得到 SmGGPPS 编码区 (1095bp)( 过程同步骤 (1)。 0046 BLAST 的结果证明 ： 从丹参中新得到的基因确为一个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合 成酶基因。研究表明， 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因对于萜类物质如紫杉醇等的代 谢合成具有重要影响， 故推测新克隆的基因具有相似的功能。 0047
37、 通过组合使用上述 3 种方法， 获得了候选的丹参 SmGGPPS 蛋白的全长编码序列。 在拼接得到全长 ( 至少包含完整的开放读框 ) 的基础上， 以 SmGGPPS F1(5 -ATCAACAGACT TACCCGAACTCT-3 ) 为正向引物， SmGGPPS R1(5 -CTACAACAAACACCAAACTTTTC-3 ) 为反 向引物， 以总 RNA 为模板， 进行 RT-PCR 扩增， PCR 条件为 94 5 分钟， 随之以 94 1 分钟、 58 1 分钟和 72 2 分半钟进行 35 个循环， 最后以 72延伸 10 分钟。电泳检测 PCR 扩增 产物， 获得扩增片段长度
38、为 1217bp。然后按常规方法以 PCR 扩增产物进行克隆、 测序， 获得 SEQ ID NO.1 所示的序列。 0048 实施例 2( 丹参 GGPPS 基因的序列信息与同源性分析 ) 0049 本发明的丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶全长 cDNA 的长度为 1095bp， 详细 序列见 SEQ ID NO.1， 其中开放读框位于 73 1167 位核苷酸。根据全长 cDNA 推导出丹参 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的氨基酸序列， 共 364 个氨基酸残基， 分子量 39.04KDa， pI 为 5.68， 详细序列见 SEQ ID NO.2。 0050 将丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成
39、酶的全长 cDNA 序列及其编码蛋白质用 BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS tr anslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR 数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索， 结 果发现它与野生烟草 GGPPS 基因 (GenBank Accession No.EF382626) 具有 72的同源性 ( 见表 2) ； 在氨基酸水平上， 它与野生烟草 GGPPS(GenBank Accession No.ABQ53935) 的第 1 364 位氨基酸残基有 74的相
40、同性和 85的相似性 ( 见表 3)。由上可见， 丹参牻牛儿 基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因与野生烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因无论从核 酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。 故可以认为丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 在提高丹参中丹参酮类二萜成分含量上具有促进作用。 0051 表 2. 本发明的丹参 SmGGPPS 与野生烟草 (Nicotiana attenuata)NaGGPPS 的核苷 酸序列的同源比较 (GAP) 0052 Query 297 GATCCACGACGCGATGCGCTACTCCCTCCTCGCCGGAGGCAAGCGCGTCCGCCCCATGCT 356 0053
41、| | | | | | | | | 0054 Sbjct 258 GATCCACGAATCTATGCGCTACTCTCTTCTCGCGGGGGGCAAAAGGGTCCGCCCCATGCT 317 0055 Query 357 CTGTATCGCCGCCTGCGAGATCGTCGGCGGCCCCCAGTCGGCGGCGATCCCCGCCGCCTG 416 0056 | | | | | | | | | | 0057 Sbjct 318 CTGCCTCGCCGCCTGCGAGCTCGTCGGCGGCCACCCCTCCACCGCCATGCCTGCCGCCTG 377 0058 Query 417 CG
42、CCGTCGAGATGATCCACACCATGTCTCTCATCCACGACGATCTACCCTGTATGGACAA 476 0059 | | | | | | | | 0060 Sbjct 378 CTCCATCGAGATGATCCACACCATGTCCCTCATGCACGACGACCTCCCCTGCATGGACAA 437 说 明 书 CN 101475946 B 9 8/14 页 10 0061 Query 477 TGATGACCTCCGCCGCGGCAAGCCCACCAATCACAAGGTCTTCGGCGAAGACGTTGCTGT 536 0062 | | | | | | | | |
43、| | | 0063 Sbjct 438 CGACCATCTCCGCCGCGGCCATCCCACTAACCACATCGTCTTCGGAGAGGACGTCGCTGT 497 0064 Query 537 GCTCGCAGGGGATGCTCTGTTGGCTTTCGCGTTCGAATTCATGGCCACGGCAACGACGGG 596 0065 | | | | | | | | | | | | | | | | 0066 Sbjct 498 CCTCGCCGGCGACGCTCTTCTTGCCTATTCCTTCGAATACTTAGCCACCGCGACAGAGGG 557 0067 Query 597 GG
44、TGGCGCCGGAAAGGATACTGGCGGCGGTGGGGGAGCTGGCGAAGGCGATCGGGACAGA 656 0068 | | | | | | | | | | | | | | 0069 Sbjct 558 AGTCCTTCCTGAACGGATAGTCAGAGTGATCGCCGAGTTGGCGAAATGTATCCGCTCAGA 617 0070 Query 657 GGGGCTGGTGGCGGGGCAAGTGGTGGACCT-GAACTGCACCGGCGATGCAAACG-TA 711 0071 | | | | | | | | | | | | | 0072 Sbjct 618 A
45、GGCCTTCTGGCGGGGCAGGTGGTGGATATATGCTCTGAA-GGCG-TG-AGCGAGATC 672 0073 Query 712 GGGTTAGACACATTGGAATTCATACACATACACAAAACTGCTGCACTGTTAGAGGCCTCT 771 0074 | | | | | | | | | | | | | | 0075 Sbjct 673 GGGTTGGAGCATTTGGAGTACATACATTTGCACAAGACGGCGGCGTTGCTCGAGGGCTCG 732 0076 Query 772 GTAGTTTTGGGGGCTATTTTGGGAGGTGGA
46、AGCAGCGATCAAATTGAGAAATTAAGAACT 831 0077 | | | | | | | | | | | | | | | 0078 Sbjct 733 GTCGTCTTGGGCGCGATTTTGGGTGGCGGGAATGATGAAGAGGTTGAAAGGTTGAGGAAG 792 0079 Query 832 TTCGCTAGGAAAATTGGTCTGCTTTTCCAAGTTGTGGATGACATTTTGGATGTGACCAAG 891 0080 | | | | | | | | | | | | | | | 0081 Sbjct 793 TTTGCCAGGTGTATTGGGCT
47、GTTGTTTCAGGTGGTGGATGATATTCTTGATGTTACTAAA 852 0082 Query 892 TCTTCGGAGGAGTTGGGAAAGACGGCTGGGAAGGACTTGGCCGTCGACAAGACCACGTAT 951 0083 | | | | | | | | | | | 0084 Sbjct 853 ACGTCGGTGGAGCTGGGGAAGACGGCCGGGAAAGATTTGGTGGCGGATAAGACCACGTAT 912 0085 Query 952 CCCAAGCTGCTGGGGCTGGACAAGGCCATGGAGTTTGCCGAGAAGCTCAACGA
48、GGAGGCC 1011 0086 | | | | | | | | | | | | | | 0087 Sbjct 913 CCGAAGCTGATTGGGATTGAGAAGTCGAGGGAGTTTGCGGAGAAGTTGAACCGGGAGGCG 972 0088 Query 1012 AAGGCGCAGCTCGCAGGGTTCGACCCGAGCAAGGCGGCTCCACTGACCGCGCTGGCCGAT 1071 0089 | | | | | | | | | | | | | 0090 Sbjct 973 CAGGAACAGCTTGTAGGGTTTGATTCGGATAAGGCCGCGCCGTTGATTGCGCTCGCGAAT 1032 0091 Query 1072 TACATTGCACATAGGCAGAA 1091 009
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