一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410193429.7 (22)申请日 2014.05.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104017753 A (43)申请公布日 2014.09.03 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M 2014079 2014.03.12 (73)专利权人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌区西农路 22号西北农林科技大学生命学院 专利权人 王瑶 (72)发明人 沈锡辉葛云辉刘应保司美茹 刘翔韦林芳李梦琪李玉菲 崔博宇王瑶 (74)专

2、利代理机构 西安吉盛专利代理有限责任 公司 61108 代理人 张培勋 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/01(2006.01) 审查员 蔡玉品 (54)发明名称 一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌 (57)摘要 本发明提供了一株可高效降解木质素的乙 酸钙不动杆菌， 其特征在于： 乙酸钙不动杆菌 AcinetobactercalcoaceticusLG-1， 已在中国 典型培养物保藏中心 （CCTCC） 登记保藏； 保藏日 期为2014年3月12日； 编号为CCTCCM2014079。 该菌对木质素具有高效降解作用，

3、 其可以在以木 质素作为唯一碳源的木质素无机盐培养液中生 长， 且其生长曲线图显示该菌的生长效果明显高 于作为阳性对照的红球菌和作为阴性对照的大 肠杆菌， 本菌株可应用于造纸， 能源， 环保等领 域， 利用其对碱性木质素的高效降解效率进而解 决碱木质素在各行业中降解难度大的问题。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 104017753 B 2017.01.11 CN 104017753 B 1.一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌， 其特征在于， 所述菌株为乙酸钙不动杆菌 （ Acinetobactercalcoaceticus ） LG-1， 其保藏编号为CCTCCNo.M2

4、014079。 2.如权利要求1所述的可降解木质素的乙酸钙不动杆菌， 其特征在于， 所述乙酸钙不动 杆菌可用于降解木质素。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104017753 B 2 一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌 AcinetobactercalcoaceticusLG-1。 背景技术 0002 木质素占木质纤维素的30左右， 在生物能源领域及生物材料领域具有巨大的潜 在应用价值。 然而， 由于木质素本身结构复杂， 分子量大， 不含易水解的单元， 是公认的最难 以化学和生物降解的天然高聚物之一。 造纸

5、废水是目前最主要的环境污染源之一， 其主要 成份是未降解的木质素类化合物及其衍生物， 这些难以降解的物质对受纳水体造成严重污 染， 破坏水体生态系统， 直接威胁人类健康。 简而言之， 木质素降解困难的技术瓶颈， 制约了 资源再利用， 同时也带来了环境污染问题。 目前， 降解木质素主要采用理化处理和生物降 解。 理化处理能源成本较高， 且易造成二次污染。 筛选并利用微生物降解木质素不仅可以缓 解环境污染， 生产生物能源， 还可以通过控制性的解聚， 变废为宝， 生成有利用价值的芳香 族化合物， 实现资源再利用。 0003 中国专利文件公告号201010104203以不动杆菌(Acinetobact

6、er？ Sp.ND12)完整细 胞为生物催化剂降解纯的尼古丁,同时降解烟叶中的尼古丁含量， 实验证明其具有调整烟 叶原料的尼古丁含量,提高烟叶可用性,及分解烟尘中的尼古丁,减少其对环境污染等优 点。 0004 中国专利文件公告号201210279167公开了一株拜氏不动杆菌(Acinetobacter beijerinckiiLJL-12)及其应用， 该一种不动杆菌可以在ACC作为唯一氮源的环境中生长， 同时将ACC分解； 可以合成IAA， 且IAA合成量随着L-Trp浓度的增加而增加； 可以合成嗜铁 素； 在石油污染的盐碱土中对燕麦的生长有促进作用。 拜氏不动杆菌LJL-12有望在石油污 染

7、的盐碱土壤的植物修复中发挥重要作用。 0005 中国专利文件公告号201210271764提供了一株不动杆菌SSAL-8。 该不动杆菌可用 于降解水华鱼腥藻， 其降解效果随菌株浓度的增大而增加， 当菌株的浓度为35时， 对水华 鱼腥藻叶绿素a的抑制率达91。 0006 中国专利文件公告号201310016531公开了一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌， 将 核桃根际促生乙酸钙不动杆菌以浇灌的方式均匀施入核桃根系的周围， 可明显促进根系生 长， 提高侧根数， 增加核桃底径和苗高的生长， 与对照相比， 差异达到极显著水平。 0007 然而， 截至目前， 将不动杆菌用于木质素的降解的发明还未见有报道，

8、本发明专利 旨在寻找一种木质素高效降解菌株， 进一步解决这一应用的瓶颈问题。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌， 解决木质素生物降解 较难这一瓶颈问题。 0009 为此， 本发明提供了一株可降解木质素的乙酸钙不动杆菌， 其特征在于： 乙酸钙不 说明书 1/5 页 3 CN 104017753 B 3 动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLG-1， 已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)登记 保藏； 保藏日期为2014年3月12日； 编号为CCTCCM2014079。 0010 所述乙酸钙不动杆菌用于降解木质素的应用。 0011 所述

9、乙酸钙不动杆菌降解木质素过程为： 将乙酸钙不动杆菌驯化培养后转接于木 质素无机盐培养液中， 以红球菌为阳性对照， 以大肠杆菌为阴性对照， 制作其在木质素无机 盐培养液中的生长曲线图。 0012 所述乙酸钙不动杆菌降解木质素过程为： 将乙酸钙不动杆菌驯化培养后划线于以 木质素作为唯一碳源的固体木质素无机盐培养基中培养， 以同样划线的固体无机盐培养基 作为对照。 0013 所述以木质素作为唯一碳源的木质素无机盐培养液的配方为： 5gLignin， 1.55g K2HPO4， 0.85gNaH2PO42H20， 2.0g(NH4)2SO4， 0.1gMgCl26H20， 10mgEDTA， 2mgZ

10、nSO4 7H20， 1mgCaCl22H20， 5mgFeSO47H20， 0.2mgNa2MoO42H20， 0.2mgCuSO45H20， 0.4mg CoCl26H20， and1mgMnCI22H20； 0014 所述固体无机盐培养基的配方为： 1.55gK2HPO4， 0.85gNaH2PO42H20， 2.0g (NH4)2SO4， 0.1gMgCl26H20， 10mgEDTA， 2mgZnSO47H20， 1mgCaCl22H20， 5mgFeSO4 7H20， 0.2mgNa2MoO42H20， 0.2mgCuSO45H20， 0.4mgCoCl26H20， and1mgM

11、nCI2 2H20， Agar15g； 0015 所述以木质素作为唯一碳源的固体木质素无机盐培养基的配方为与固体木质素 无机盐培养基的配方相同， 增加5gLignin。 0016 本发明的有益效果是： 本发明提供的这种可一株可降解木质素的乙酸钙不动杆 菌， 其特征在于： 乙酸钙不动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLG-1， 已在中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)登记保藏； 保藏日期为2014年3月12日； 编号为CCTCCM2014079。 该菌 对木质素具有高效降解作用， 其可以在以木质素作为唯一碳源的木质素无机盐培养液中生 长， 且其生长曲线图显示该菌的生长效果

12、明显高于作为阳性对照的红球菌和作为阴性对照 的大肠杆菌， 本菌株可应用于造纸， 能源， 环保等领域， 利用其对碱性木质素的高效降解效 率进而解决碱木质素在各行业中降解难度大的问题。 0017 以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。 附图说明 0018 图1是该一种可降解木质素的乙酸钙不动杆菌Acinetobactercalcoaceticus LG-1在木质素无机盐培养液中的生长曲线图， 其中R.opacus为阳性对照， E.coli为阴性对 照， 比较易得， AcinetobactercalcoaceticusLG-1生长状况良好， 可以更为有效的利用木 质素。 0019 图2该一种可降解

13、木质素的乙酸钙不动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLG-1 在固体木质素无机盐培养基 0020 图3该一种可降解木质素的乙酸钙不动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLG-1 在固体无机盐培养基中的生长状况， 图中之所以会有菌落生长主要是由于其琼脂含微量可 利用杂质。 0021 图2、 图3对照， 培养基的唯一变量是有无木质素， 易得该菌株可利用木质素生长。 说明书 2/5 页 4 CN 104017753 B 4 具体实施方式 0022 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明， 但并不是对本发明的限 制， 仅仅作示例说明。 0023 实施

14、例1： 0024 乙酸钙不动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLG-1， 已在中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)登记保藏； 保藏日期为2014年3月12日； 编号为CCTCCM2014079。 0025 该菌株的筛选、 鉴定、 应用操作流程如下： 0026 1、 菌株的筛选 0027 A:造纸厂污水区采样， 得到样品污泥。 0028 B:配制木质素无机盐培养液和无机盐培养基， 并各分装数分100ml至250ml规格的 三角瓶中灭菌处理。 0029 C:配置200g/L的木质素母液， 灭菌， 并以足量的灭菌的ddH2O对其进行透析处理 (无菌条件)， 分装至含100mL

15、无机盐培养基的三角瓶中， 制得透析木质素无机盐培养液。 0030 D:配置0.9(w/v)NaCl溶液， 灭菌处理， 按1:100(w/v)的比例加入污泥样品中， 37 ,220rpm， 孵育2小时。 0031 E:将孵育后的污泥样品按1:100的比例加入木质素无机盐培养液中富集培养， 条 件37,220rpm,48h。 之后转接至另一木质素无机盐培养液中富集培养， 条件不变， 每48h转 接一次， 前三次转至未透析的木质素无机盐培养液中富集培养， 之后五次转至透析的木质 素无机盐培养液中进行筛选， 条件37,220rpm。 0032 所述以木质素作为唯一碳源的木质素无机盐培养液的配方为： 5

16、gLignin， 1.55g K2HPO4， 0.85gNaH2PO42H20， 2.0g(NH4)2SO4， 0.1gMgCl26H20， 10mgEDTA， 2mgZnSO4 7H20， 1mgCaCl22H20， 5mgFeSO47H20， 0.2mgNa2MoO42H20， 0.2mgCuSO45H20， 0.4mg CoCl26H20， and1mgMnCI22H20； 0033 所述无机盐培养液的配方为： 1.55gK2HPO4， 0.85gNaH2PO42H20， 2.0g(NH4)2SO4， 0.1gMgCl26H20， 10mgEDTA， 2mgZnSO47H20， 1mgC

17、aCl22H20， 5mgFeSO47H20， 0.2mgNa2MoO42H20， 0.2mgCuSO45H20， 0.4mgCoCl26H20， and1mgMnCI22H20。 0034 2、 菌株的鉴定 0035 A:分离并保存筛选所得菌株:从最后一瓶木质素无机盐培养液中取样进行梯度稀 释， 涂布于固体木质素无机盐培养基中， 37培养箱培养12h。 将生长良好的单克隆菌株转 接至5mlLB培养基中， 37,220rpm， 12h。 -80冻存菌株。 0036 B:挑取效果好的菌株进行16sPCR， 送样测序， 序列比对， 种属鉴定。 引物为27F， 1492R。 序列如下： 0037 2

18、7F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 0038 1492R： TACGGCTACCTTGTTACGACTT 0039 其16S序列如下： 0040 5 CACATGCAAGTCGAGCGGGGAAAGGTAGCTTGCTACCGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCT TAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAG GGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCA

19、AGGCG 说明书 3/5 页 5 CN 104017753 B 5 ACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAA GCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGATAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCT AACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGA

20、GGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGG CGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGG AGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATC TGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAA CGATGTCTACTAGCCGTTG

21、GGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTAC GGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAAC GCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAG GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTAT TTGCCAG

22、CGAGTAATGTCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTC ATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGC TAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC GGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGC

23、ACCA GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAGAGGGCGGTTACCA3 0041 3、 菌株的应用 0042 如前所述， 该乙酸钙不动杆菌用于降解木质素的应用， 其功能验证流程如下： 0043 制作该菌株在木质素作唯一碳源的透析木质素无机盐培养液中的生长曲线， 其中 以红球菌为阳性对照， 大肠杆菌为阴性对照， 其具体操作步骤为： 0044 A： 分别接醋酸钙不动杆菌LG-1(筛选所得)、 红球菌、 大肠杆菌于三支装有5mLLB 液体培养基的试管中， 37， 200rpm,培养12h。 0045 B： 于分光光度计上分别测三管菌液的OD600， 测得结果如下表,并按下表取样量分

24、别将三支菌转接至木质素无机盐培养液中培养， 每株菌做3个重复。 每隔一定的时间取样进 行菌落计数(梯度稀释涂布平板法)。 0046 用处OD600取量( L) R.opacus阳性对照0.8643 LG-1实验组1.050 DH5 阴性对照0.83642.8 0047 实验结果表明， AcinetobactercalcoaceticusLG-1菌株对木质素有着高效的降 解效率以及利用效率， 在相同条件下， 以红球菌作为阳性对照， 大肠杆菌作为阴性对照， 制 作其在木质素无机盐培养液中的生长曲线图(附图1)， 由图1其生长效果明显高于二者。 可 以更加有效的利用木质素。 在能源应用领域有巨大的应

25、用潜力。 0048 实施例2： 菌株对木质素的降解实验还可以下列实验验证： 0049 将在LB培养基中培养所得的菌液划线于固体木质素无机盐培养基和固体无机盐 培养基中， 37培养箱培养12h， 进行降解验证。 0050 所述固体无机盐培养基的配方为： 1.55gK2HPO4， 0.85gNaH2PO42H20， 2.0g (NH4)2SO4， 0.1gMgCl26H20， 10mgEDTA， 2mgZnSO47H20， 1mgCaCl22H20， 5mgFeSO4 说明书 4/5 页 6 CN 104017753 B 6 7H20， 0.2mgNa2MoO42H20， 0.2mgCuSO45H

26、20， 0.4mgCoCl26H20， and1mgMnCI2 2H20， Agar15g； 0051 所述以木质素作为唯一碳源的固体木质素无机盐培养基的配方为与固体木质素 无机盐培养基的配方相同， 增加5gLignin。 0052 所述LB培养基的配方为： NaCl10g， YEASTEXTRACT5g， TRYPTONE10g 0053 实验结果如附图2、 3所示， 菌株在固体木质素无机盐培养基中生长良好， 而在固体 无机盐培养基基本未见大量繁殖， 图3中之所以会有菌落生长主要是由于其琼脂含微量可 利用杂质。 然而将二者对照， 以有无木质素作为唯一变量的两组实验表明， 该菌株可利用木 质素

27、生长， 即其具有较好的木质素降解功能。 0054 以上例举仅仅是对本发明的举例说明， 并不构成对本发明的保护范围的限制， 凡 是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 104017753 B 7 SEQUENCELISTING 西北农林科技大学， 王瑶 一株可高效降解木质素的乙酸钙不动杆菌 1 1 PatentInversion3.3 1 1413 DNA AcinetobactercalcoaceticusLG-1 1 cacatgcaagtcgagcggggaaaggtagcttgctaccggacctagcggcggacgggtgag60 ta

28、atgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacatctcgaaagggatgctaataccg120 catacgtcctacgggagaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaa180 gtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctg240 agaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300 tggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgc

29、gtgtgtgaagaagg360 ccttatggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctactttagataatacctagagat420 agtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatac480 agagggtgcaagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgcgcgtaggcggctaattaa540 gtcaaatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactggttagctagag600 序列表 1/2 页 8 CN 104017753 B

30、 8 tgtgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaa660 taccgatggcgaaggcagccatctggcctaacactgacgctgaggtgcgaaagcatgggg720 agcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttgg780 ggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggt840 cgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcaca

31、agcggtggagcatgtggtt900 taattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatagtaagaactttccagaga960 tggattggtgccttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtc1020 gtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcgagt1080 aatgtcgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtc1140 aagtcatcatggccctta

32、cggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaaggg1200 ttgctacacagcgatgtgatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggattggagtct1260 gcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaa1320 tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaag1380 tagctagcctaactgcaaagagggcggttacca 序列表 2/2 页 9 CN 104017753 B 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 10 CN 104017753 B 10