创新霉素生物合成基因簇及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710146841.7 (22)申请日 2017.03.13 (71)申请人 山东大学苏州研究院 地址 215000 江苏省苏州市林泉街377号公 共学院5号楼704室 申请人 山东大学 (72)发明人 卞小莹张友明许晓坤 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (51)Int.Cl. C12N 15/52(2006.01) C12N 9/00(2006.01) C12P 17/18(2006.01) (54)发明名称 创新霉素生物

2、合成基因簇及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种创新霉素的生物合成基 因簇， 该基因簇的核苷酸序列如SEQIDNo.1所 示， 命名为cxm； 其包含编码创新霉素生物合成所 涉及的10个基因， 其中7个是与生物合成相关基 因， 1个是调控基因， 1个抗性基因， 1个是转运基 因， 所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2SEQ IDNo.11所示。 所述基因功能通过异源表达结合 基因同框删除试验验证。 本发明还公开了所述基 因簇或其表达的编码蛋白在催化合成创新霉素 或其类似物中的应用， 实现了创新霉素的生物合 成。 本发明所提供的基因及其蛋白也可以用来寻 找和发现可用于医药、 工业或农业的化

3、合物或基 因、 蛋白。 权利要求书2页 说明书7页 序列表15页 附图2页 CN 106754986 A 2017.05.31 CN 106754986 A 1.一种创新霉素的生物合成基因簇， 其特征在于， 所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， 命名为cxm； 其包含编码创新霉素生物合成所涉及的10个基因， 其中7个是与生物 合成相关基因， 1个是调控基因， 1个抗性基因， 1个是转运基因， 所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.2SEQ ID No.11所示， 具体是： (1)抗性蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示， 命名为cxm0， 其位于基因

4、 簇核苷酸序列第1-966个碱基处， 长度为966个碱基对， 编码一个色氨酰tRNA合成酶， 321个 氨基酸， 序列如SEQ ID No.12所示； (2)转录调控蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示， 命名为Cxm1， 其位于 基因簇核苷酸序列第1177-2199个碱基处， 长度为1023个碱基对， 编码一个LysR家族转录调 控蛋白， 340个氨基酸， 序列如SEQ ID No.13所示； (3)转运蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示， 命名为Cxm2， 其位于基因 簇核苷酸序列第2415-3905个碱基处， 长度为1491个碱基对， 编码一

5、个转运蛋白， 496个氨基 酸， 序列如SEQ ID No.14所示； (4)巯基转运蛋白(sulfur carrier protein)激活蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.5所示， 命名为cxm3， 其位于基因簇核苷酸序列第3974-4690个碱基处， 长度为 717个碱基对， 编码一个功能未知蛋白， 238个氨基酸， 序列如SEQ ID No.15所示； (5)巯基转运蛋白(sulfur carrier protein)基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示， 命名为cxm4， 其位于基因簇核苷酸序列第4694-4996个碱基处， 长度为303个碱基

6、对， 编码一个巯基转运蛋白， 100个氨基酸， 序列如SEQ ID No.16所示； (6)细胞色素P450酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示， 命名为cxm5， 其位 于基因簇核苷酸序列第4993-6207个碱基处， 长度为1215个碱基对， 编码一个细胞色素P450 酶， 404个氨基酸， 序列如SEQ ID No.17所示； (7)酮泛解酸还原酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示， 命名为cxm6， 其位 于基因簇核苷酸序列第6204-7160个碱基处， 长度为957个碱基对， 编码一个细胞色素P450 酶， 318个氨基酸， 序列如SEQ ID

7、 No.18所示； (8)5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型氨基转移酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9 所示， 命名为cxm7， 其位于基因簇核苷酸序列第7157-8245个碱基处， 长度为1089个碱基对， 编码一个PLP依赖型氨基转移酶， 362个氨基酸， 序列如SEQ ID No.19所示； (9)自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所 示， 命名为cxm8， 其位于基因簇核苷酸序列第8318-10189个碱基处， 长度为1872个碱基对， 编码一个自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶， 623个氨基酸， 序列如SEQ ID No

8、.20所示； (10)自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示， 命 名为cxm9， 其位于基因簇核苷酸序列第10186-10917个碱基处， 长度为732个碱基对， 编码一 个自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白， 243个氨基酸， 序列如SEQ ID No.21所示。 2.权利要求1所述创新霉素的生物合成基因簇表达的编码蛋白。 3.根据权利要求2所述的编码蛋白， 其特征在于， 所述编码蛋白的氨基酸序列分别如 SEQ ID No.12SEQ ID No.21所示。 4.权利要求1所述创新霉素的生物合成基因簇或权利要求1所述创新霉素的生物合成 基因簇表达的编码蛋

9、白在催化合成创新霉素或其类似物中的应用。 权利要求书 1/2 页 2 CN 106754986 A 2 5.一种重组载体， 其特征在于， 该重组载体包含权利要求1所述的创新霉素生物合成基 因簇。 6.根据权利要求5所述的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体是p15A-cm-apra-cxm或 其的突变载体。 7.一种宿主， 其特征在于， 该宿主包含权利要求5或6所述的重组载体。 8.根据权利要求7所述的宿主， 其特征在于， 所述宿主为链霉菌、 假单胞菌、 伯克氏菌、 大肠杆菌、 芽孢杆菌、 酵母、 植物或动物。 9.根据权利要求8所述的宿主， 其特征在于， 所述宿主为天蓝色链霉菌A3(2)、

10、 白色链霉 菌J1074或变铅青链霉菌K4-114。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106754986 A 3 创新霉素生物合成基因簇及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物基因资源和基因工程领域， 具体地， 涉及一种创新霉素生物合 成基因簇、 包含其的载体、 宿主及其应用。 背景技术 0002 创新霉素(chuangxinmycin， CXM)与色氨酸(tryptophan)有结构上的相似性(见式 (I)， 是一种高效的细菌色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)的选择性抑制剂。 0003 0004 比如创新霉素对大肠杆菌的TrpRS的IC50为30nM， 但是其在30 M浓度下对绵羊的

11、 TrpRS没有抑制作用， 显示了创新霉素是一种特异性的抑制剂(Brown et al,2002)。 最近的 研究表明色氨酰tRNA合成酶抑制剂(吲哚霉素和创新霉素)能够扰乱与氯霉素、 红霉素和万 古霉素抗性相关的富含色氨酸的蛋白的生物合成， 从而减弱细菌对氯霉素、 红霉素和万古 霉素的抗性， 因此色氨酰tRNA合成酶抑制剂与另外的抗生素联用可以降低细菌的多重抗药 性。 创新霉素是中国发现的第一个全新结构的新抗生素， 由济南游动放线菌(Actinoplanes tsinanensis)产生， 其分子的主核为罕见的吲哚并噻喃三环结构， 这在化学上是一个新的 含硫的杂环体系。 最初报道该抗生素对金

12、黄色葡萄球菌、 大肠杆菌和痢疾志贺菌有较强的 抗菌活性， 并对感染了痢疾志贺菌和大肠杆菌的小鼠模型显示出体内抗菌活性。 初步临床 试验表明它对于大肠杆菌引起的败血症、 胆囊炎和尿路感染有显著的疗效(有效率达 77.86)。 体外和体内的联合抗菌实验表明， 创新霉素与庆大霉素、 新霉素、 巴龙霉素、 卡那 霉素B、 多黏霉素、 氨苄青霉素、 青霉素和头孢菌素I等8种抗生素有不同程度的协同作用， 提 高创新霉素抗菌作用432倍， 有可能提高临床疗效， 防止或延缓耐药性的产生。 但是由于 其发酵单位太低导致生产成本高， 抗菌谱较窄， 仅能口服， 且抗菌活性低于目前临床上其他 抗菌药物， 致使其仍未广

13、泛用于临床。 0005 关于创新霉素的生物合成机理及其相关重要的酶学研究还没有得到验证。 从化学 结构上来说， 创新霉素属于吲哚类生物碱， 很有可能是利用色氨酸作为起始单元进行生物 合成的， 但是它的具体的生物合成途径依然未知。 我国学者曾对创新霉素的生物合成进行 了初步的研究， 利用同位素标记的方法发现创新霉素分子中噻喃环的硫直接来自半胱氨酸 的巯基， 应用标记甲基供体S-腺苷-L-甲基-14C甲硫氨酸(SAM)测定创新霉素产生菌无细 胞提取物对吲哚丙酮酸的甲基化作用， 发现创新霉素产生菌中存在吲哚丙酮酸碳甲基转移 说明书 1/7 页 4 CN 106754986 A 4 酶(indolep

14、yruvate C-methyltransferase)可能负责C-2的甲基化， 其分子量是55000 5000道尔顿。 经对现有技术的文献检索， 尚未发现有关创新霉素生物合成基因簇、 包含其的 载体及宿主和利用基因表达编码蛋白用于催化合成抗生素创新霉素或其类似物应用的报 道。 发明内容 0006 针对现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种创新霉素的生物合成基因簇、 包 含其的载体、 宿主及其应用。 利用本发明的基因簇可实施发酵生产创新霉素， 实现创新霉素 的生物合成。 0007 本发明所述的创新霉素的生物合成基因簇， 其特征在于， 该基因簇的核苷酸序列 如SEQ ID No.1所示， 命名

15、为cxm； 其包含编码创新霉素生物合成所涉及的10个基因， 其中7 个是与生物合成相关基因， 1个是调控基因， 1个抗性基因， 1个是转运基因， 所述基因的核苷 酸序列如SEQ ID No.2SEQ ID No.11所示， 具体是： 0008 (1)抗性蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示， 命名为cxm0， 其位于 基因簇核苷酸序列第1-966个碱基处， 长度为966个碱基对， 编码一个色氨酰tRNA合成酶， 321个氨基酸， 序列如SEQ ID No.12所示； 0009 (2)转录调控蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示， 命名为Cxm1， 其

16、 位于基因簇核苷酸序列第1177-2199个碱基处， 长度为1023个碱基对， 编码一个LysR家族转 录调控蛋白， 340个氨基酸， 序列如SEQ ID No.13所示； 0010 (3)转运蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示， 命名为Cxm2， 其位于 基因簇核苷酸序列第2415-3905个碱基处， 长度为1491个碱基对， 编码一个转运蛋白， 496个 氨基酸， 序列如SEQ ID No.14所示； 0011 (4)巯基转运蛋白(sulfur carrier protein)激活蛋白基因， 该基因的核苷酸序 列如SEQ ID No.5所示， 命名为cxm3， 其位

17、于基因簇核苷酸序列第3974-4690个碱基处， 长度 为717个碱基对， 编码一个功能未知蛋白， 238个氨基酸， 序列如SEQ ID No.15所示； 0012 (5)巯基转运蛋白(sulfur carrier protein)基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示， 命名为cxm4， 其位于基因簇核苷酸序列第4694-4996个碱基处， 长度为303个 碱基对， 编码一个巯基转运蛋白， 100个氨基酸， 序列如SEQ ID No.16所示； 0013 (6)细胞色素P450酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示， 命名为cxm5， 其位于基因簇核苷酸序列

18、第4993-6207个碱基处， 长度为1215个碱基对， 编码一个细胞色素 P450酶， 404个氨基酸， 序列如SEQ ID No.17所示； 0014 (7)酮泛解酸还原酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示， 命名为cxm6， 其位于基因簇核苷酸序列第6204-7160个碱基处， 长度为957个碱基对， 编码一个细胞色素 P450酶， 318个氨基酸， 序列如SEQ ID No.18所示； 0015 (8)5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型氨基转移酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示， 命名为cxm7， 其位于基因簇核苷酸序列第7157-8245个碱基处，

19、 长度为1089个 碱基对， 编码一个PLP依赖型氨基转移酶， 362个氨基酸， 如SEQ ID No.19所示； 0016 (9)自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示， 命名为cxm8， 其位于基因簇核苷酸序列第8318-10189个碱基处， 长度为1872个 说明书 2/7 页 5 CN 106754986 A 5 碱基对， 编码一个自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶， 623个氨基酸， 序列如SEQ ID No.20 所示； 0017 (10)自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白基因， 该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所 示， 命名为c

20、xm9， 其位于基因簇核苷酸序列第10186-10917个碱基处， 长度为732个碱基对， 编码一个自由基S-腺苷甲硫氨酸蛋白， 243个氨基酸， 序列如SEQ ID No.21所示。 0018 本发明所述创新霉素的生物合成基因簇核苷酸序列cxm的互补序列可根据DNA碱 基互补原则随时得到。 序列SEQ ID No.1的核苷酸序列或者部分核苷酸序列可以通过聚合 酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用Red/ET同源重组技术的 线性重组LLHR得到。 0019 本发明所述创新霉素的生物合成基因簇表达的编码蛋白。 0020 其中， 所述编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ I

21、D No.12SEQ ID No.21所示。 0021 本发明所述创新霉素的生物合成基因簇或其表达的编码蛋白在催化合成创新霉 素或其类似物中的应用。 0022 创新霉素生物合成基因簇的直接克隆、 异源表达和遗传操作证实， 利用本发明所 述创新霉素的生物合成基因簇通过生物技术表达编码蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.12 SEQ ID No.21所示)可用于催化合成抗生素创新霉素或其类似物、 或者催化合成含噻喃或 者吲哚并噻喃三环结构单元的化合物。 0023 创新霉素为色氨酸结构类似物， 根据基因单敲除实验推测其生物合成是以色氨酸 起始， 经氨基转移酶Cxm7的脱氨基作用， 形成吲哚丙酮酸，

22、 吲哚丙酮酸在硫载体蛋白Cxm4及 硫载体蛋白激活蛋白的共同催化加上硫原子形成不稳定的吲哚硫碳酸化合物， 之后在细胞 色素P450Cxm5和还原酶Cxm6的共同催化下含硫六元环闭合形成去甲基创新霉素， 去甲基创 新霉素在甲基转移酶Cxm8及其蛋白Cxm9的催化下加上甲基， 形成创新霉素。 0024 本发明所述的一种重组载体， 其特征在于， 该重组载体包含本发明所述的创新霉 素生物合成基因簇。 而且该载体中的创新霉素生物合成基因被中断、 被置换或同框缺失， 至 少其中之一的基因包含有序列SEQ ID No.1中的核苷酸序列。 0025 其中， 上述重组载体优选是p15A-cm-apra-cxm。

23、 0026 本发明所述的一种宿主， 其特征在于， 该宿主包含上述的重组载体。 0027 其中， 所述宿主优选为链霉菌、 假单胞菌、 伯克氏菌、 大肠杆菌、 芽孢杆菌、 酵母、 植 物或动物。 最优选为天蓝色链霉菌A3(2)、 白色链霉菌J1074或变铅青链霉菌K4-114。 0028 与现有技术相比， 本发明具有如下的有益效果： 0029 利用本发明的基因簇可发酵生产创新霉素， 实现创新霉素的生物合成； 同时， 本发 明所提供的包含创新霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息有助于阐明与理解创新霉 素类抗生素的生物合成的分子机理， 为利用基因工程手段改造提供理论基础与材料。 本发 明所提供的基因及

24、其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、 工业或农业的化合物或基 因、 蛋白。 附图说明 0030 图1为创新霉素生物合成基因簇的基因组成。 0031 其中： Resistance： 抗性基因； Regulator:调控基因： Transporter:转运基因； 说明书 3/7 页 6 CN 106754986 A 6 Biosynthesis： 合成基因。 0032 图2为带有创新霉素生物合成基因簇的重组载体。 0033 其中： Apra： 安普霉素抗性基因； Cm： 氯霉素抗性基因； Int： 位点特异性重组酶 integrase； P15A： P15A复制子。 0034 图3为创新霉素生

25、物合成基因簇的异源表达及与创新霉素生物合成相关的10个基 因的同框缺失突变分析。 0035 其中： CXM： 创新霉素； Dem-CXM： 去甲基创新霉素； A3(2)： 天蓝色链霉菌A3(2)； J1074： 白色链霉菌J1074； K4-114： 变铅青链霉菌K4-114； A3(2)/cxm： 重组有cxm基因簇的天 蓝色链霉菌A3(2)； J1074/cxm： 重组有cxm基因簇的白色链霉菌J1074； K4-114/cxm： 重组有 cxm基因簇的天变铅青链霉菌K4-114； 0036 A3(2)/cxmcxm0： 为将cxm中的cxm0同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中；

26、0037 A3(2)/cxmcxm1： 为将cxm中的cxm1同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0038 A3(2)/cxmcxm2： 为将cxm中的cxm2同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0039 A3(2)/cxmcxm3： 为将cxm中的cxm3同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0040 A3(2)/cxmcxm4： 为将cxm中的cxm4同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0041 A3(2)/cxmcxm5： 为将cxm中的cxm5同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0042 A3(2)/cxmcxm6： 为将cxm中的cxm

27、6同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0043 A3(2)/cxmcxm7： 为将cxm中的cxm7同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0044 A3(2)/cxmcxm8： 为将cxm中的cxm8同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中； 0045 A3(2)/cxmcxm9： 为将cxm中的cxm9同框敲除后， 转至天蓝色链霉菌A3(2)中。 具体实施方式 0046 下面结合附图和实施例对本发明保护内容作进一步阐述。 实施例中所描述的内容 仅用于解释和说明本发明， 而不应当也不会限制本发明权利要求所界定的保护范围。 0047 一般性说明： 如下实施例所涉及的限制性内切

28、酶均购自NEB公司， DNA聚合酶、 T4连 接酶均购自Takara公司， 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自Qiangen公 司， 操作完全按照相应说明书进行。 质粒构建中基因测序及引物合成由上海生工公司完成。 质粒p15A-cm-ccdB见文献(Wang H ,et al .Improved seamless mutagenesis by recombineering using ccdB for counterselection.Nucleic Acids Research,2014,42 (5):e37)、 菌株GB05， GB05dir， GB05Red见文献(Fu

29、J.et al.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.Nature Biotechnolgy,2012,30:440-446)， 天蓝色链霉菌A3(2)见文献 (Bentley SD,et al.Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Nature,2002,417:141-147)、

30、 白色链霉菌J1074见文献 (Zaburannyi N,et al.Insights into naturally minimised Streptomyces albus J1074genome.BMC Genomics,2014,15:97)， 变铅青链霉菌K4-114见文献(Ziermann R, etal.Recombinant Polyketide Synthesis in Streptomyces:Engineering of Improved Host Strains.BioTechniques,1999,26:106-110)。 上述菌株均为科研实验常用宿主， 均可 通过公开

31、的保藏机构购买或实验室分享等方式获得。 济南游动放线菌购于中国医药集团总 说明书 4/7 页 7 CN 106754986 A 7 公司四川抗菌素工业研究所(CPCC240351)。 实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说 明， 均为本领域常规方法与市售试剂。 0048 实施例1： 创新霉素产生菌济南游动放线菌基因组DNA的提取及测序 0049 将济南游动放线菌菌株从-80接种至高氏固体平板中， 30培养4天， 刮取菌体 接种至168G(葡萄糖22g， 牛肉膏4g， 蛋白胨5g， 酵母提取物0.5g， 酪胨3g， 食盐1.5g， 加水 900mL高温灭菌， 甘氨酸10g加入100mL水单独灭菌

32、， 使用时向培养基中添加十分之一体积的 10甘氨酸)培养基中50mL/250mL三角瓶， 30， 150rpm培养4天， 菌体成乳白色小团状， 分 装1.8mL至2mL离心管中， 13000rpm离心5分钟， 倒掉上清后用1.6mL的水洗涤， 13000rpm离心 5分钟倒掉上清， 用450 L pH8.0的10mM Tris-HCl重悬菌体， 加入30 L 20mg/mL的蛋白酶K， 混匀， 加入40 L 10SDS， 旋转混匀， 40水浴2小时， 管内液体变为透明， 加入500 L酚氯仿 异戊醇(25:24:1)， 将离心管旋转30次混匀， 液体完全变为白色， 14600rpm离心10分钟

33、， 用剪 过的枪尖吸取上清， 不要吸到白色层， 转移至另一新的2mL离心管， 加入500 L酚氯仿异戊醇 (25:24:1)， 将离心管旋转30次混匀， 液体完全变为白色， 14600rpm离心10分钟， 用剪过的枪 尖吸取上清300 L， 不要吸到白色层， 转移至另一新的2mL离心管， 加入30 L pH7.5的3M醋酸 钠， 混匀后加入900 L的无水乙醇， 混匀， 有大团的DNA出现， 将其钩出置于新的离心管， 加 1.8mL70乙醇洗涤， 10000rpm离心1分钟， 加入200 l水溶解， 加RNaseA使终浓度为10 g/ mL， 37温育1小时。 依次用等体积的酚氯仿异戊醇抽提两

34、次， 向水相中加入0.1体积的3M醋 酸， 2体积的无水乙醇,轻轻的混合充分,有絮状DNA出现。 将四管DNA合并到1管(每管中有 1.8mL70乙醇用于洗涤),将液体吸出， 再加1mL无水乙醇洗涤， 吸出乙醇,自然晾干， 溶于 200 L的水中。 0050 基因组提取后构建10kb SMRTbell DNA文库， 使用PacBio RS II单分子测序， 获得 50X的数据量， 开发适用于细菌基因组分析的软件， 原始数据经过预处理去除接头、 引物及 低质量数据后， 对细菌基因组进行de novo组装和分析， 基因功能注释采用BLAST软件与 NCBI的蛋白质数据库(NR)及SwissProt

35、、 KEGG、 GO等4个数据库进行比对。 利用生物信息学工 具antiSAMSH菌株中所有的次级代谢产物合成基因簇进行分析。 0051 济南游动放线菌的基因组大小为8,397,261bp， GC含量为70.81， 其中包含7,673 个基因， 基因总长度为7,170,756， 基因平均长度为935bp， 共预测得到19个基因簇， 其中 PKS/NRPS类型基因簇有6个， 细菌素基因簇3个。 0052 通过抗性基因cxm0(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)寻找创新霉素的生物合成基 因簇。 0053 由于创新霉素的结构与色氨酸类似， 推断其是由色氨酸作为底物合成， 可能与创 新霉素的结构

36、类似物吲哚霉素的基因簇一样， 基因簇内部包含tryptophanyl- tRNAsynthetase， 通过对基因组进行搜索， 发现2个tryptophanyl-tRNA synthetase的编码 基因， 其中第二个编码基因cxm0与吲哚霉素生物合成的抗性基因蛋白Ind0高度同源， 相似 度达74.4， 它位于一个基因簇中， 这个基因簇包括10个基因， 1个抗性基因cxm0(核苷酸序 列如SEQ ID No.2所示)， 1个转录调节蛋白cxm1(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)， 1个转运 蛋白cxm2(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)， 7个结构基因， 分别为cxm3可能为

37、SCP(硫载体 蛋白)激活蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)， cxm4为SCP(硫载体蛋白)基因(核苷 酸序列如SEQ ID No.6所示)， cxm5为P450(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)， cxm6为还原酶 说明书 5/7 页 8 CN 106754986 A 8 (核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)， cxm7氨基转移酶(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)， cxm8为自由基S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)， cxm9可能为 蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)， 综上推断cxm09这一11

38、Kb的序列为创新霉 素的生物合成基因簇。 (见图1) 0054 实施例2： 创新霉素生物合成基因簇的直接克隆 0055 济南游动放线菌提取基因组DNA后， 取200 l， 约300 g/ l， 用EcoRV和Asc 进行双 酶切， 400 l酶切体系， 37温育3小时后， 酚氯仿抽提DNA一次， 然后乙醇沉淀回收， 用少量 ddH2O溶解。 线性克隆载体p15A-cm-HA， HA为创新霉素基因簇的同源臂， 用质粒p15A-cm- tetR-ccdB-hgy扩增获得。 5 g的基因组DNA与0.5 g的线性克隆载体共同电转至经过诱导重 组酶表达的GB05dir中， 37复苏1小时， 涂布至含有

39、cm的LB平板， 37过夜培养， 挑取克隆 用含有cm的LB培养过夜， 提取质粒后酶切鉴定， 含有cxm基因簇的重组质粒p15A-cm-cxm进 行酶切鉴定， 挑取正确的克隆对整个基因簇进行测序， 结果显示11Kb的基因序列无突变。 0056 实施例3： 创新霉素生物合成基因簇的异源表达 0057 以pSET152为模板， 扩增携带同源臂的intgrase-attP-oriT-apra， 得到的PCR产物 与基因簇直接克隆后的质粒p15A-cm-cxm共同转化至经过诱导表达重组酶的菌株GB05red 中进行线环重组， 挑取克隆酶切鉴定， 得到整合有创新霉素基因簇的结合转移质粒p15A- cm-

40、apra-cxm， 将此质粒电转至结合转移供体菌ET12567/pUZ8002， 质粒p15A-cm-apra-cxm 通过结合转移移至天蓝色链霉菌A3(2)中并整合到其染色体的attB位点， 37培养17h-18h 后用l ml无菌水含适量抗生素和萘啶酮酸(用来抑制大肠杆菌的生长)来覆盖， 倒置30培 养7天后即可看到接合子生长， 挑取克隆PCR验证， 将正确的克隆接种至添加安普霉素(50 g/mL)和萘啶酮酸(25 g/mL)的M1(可溶性淀粉10g/L， 酵母浸粉4g/L， 蛋白胨2g/L)液体培养 基进行发酵， 50mL/250mL， 200rpm， 30培养7天。 0058 创新霉素

41、的分离纯化 0059 用6M HCl将发酵液pH调至23， 用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液萃取三次， 合并 乙酸乙酯， 减压蒸干， 用1mL甲醇溶解， 0.22 m膜过滤， -80保存。 0060 创新霉素的分析 0061 色谱-质谱联 用(LC/MS) 检测发酵产物使用的是布鲁克公 司的impact HDmicroTOF-Q III系统。 0062 LC条件： 色谱柱为YMC-PACK ODS-A(C18,2504.6mm,5 m,12nm)， 流动相为(水： A； Merck HPLC级乙睛： B， 分别添加0.1甲酸， (0-5min 5B， 5-45min 5-95， 45-60min

42、95B， 60-65min 5B)流速为0.75ml/min， 检测器DAD， 柱温为25， 质谱检测是在离子阱 的负离子模式下进行， 扫描范围m/z100-1000， autoMS2， 进样量3 L。 0063 实施例4： 与创新霉素生物合成相关的10个基因的同框缺失 0064 以两侧携带PacI酶切位点的amp抗性基因为打靶载体， 分别设计10对含有对应同 源臂的引物， 扩增后得到含有amp抗性基因、 Pac 酶切位点及同源臂的PCR产物， 与质粒 p15A-cm-apra-cxm共同电转化至经过诱导表达重组酶的GB05red中， 37复苏1小时， 涂布 至含有amp和apra的LB平板，

43、 37过夜培养， 挑取克隆培养后酶切鉴定， 选取正确的克隆培 养后提取质粒， 用Pac 酶切， 将酶切体系用0.22 m滤膜除盐40min， 用T4连接酶自身连接， 4 过夜， 将T4连接体系用0.22 m滤膜除盐40min， 全部涂布至含有apra的LB平板， 37过夜 说明书 6/7 页 9 CN 106754986 A 9 培养， 长出的克隆经过双划线筛选后得到除去amp抗性基因的克隆， 酶切鉴定并测序， 得到 基因单敲除的质粒， 通过结合转移转至天蓝色链霉菌A3(2)中， PCR鉴定， 用M1培养基进行发 酵， 提取粗产物， 进行LC-MS分析。 0065 结果见图3。 说明书 7/7

44、 页 10 CN 106754986 A 10 序列表 山东大学苏州研究院 山东大学 创新霉素生物合成基因簇及其应用 2017-02-16 21 1 10917 DNA 济南游动放线菌(Actinoplanes tsinanensis) 创新霉素的生物合成基因簇cxm （1） （10917） 1 ctacttcaga ccggcaaggc tgagcgcacg atccaagcgg tctcgtgacc gcgcccgagc 60 acggtcggcc ccctcagccc ggatcttcgc cagctccgat cgctcttcga ggagctgcag 120 tgcccgctca c

45、gcaccggtg cgatcaggga gatcactgcc tctgcggctg cttccttgag 180 gtcacggtag gaatcgatac ccttcgccgc atcgctcggg agcgtgtcag tgcaggcagc 240 cctgatctcc aggaggttgg caacgcccgg ctgttcgtcc ggggcgtagc ggacggtgtt 300 ttctccgtct gtcactgcgc gttggaactt ccggcgtacg gcctccgggc tgtccaggac 360 gtagacgatg ccgctgccgt ccgaggacga

46、 cttcgacatc ttccgcgtag gggcagcgag 420 atcacgtacc cgggctgcgg ctacgggcag gacggcttgc ggaaccgtga acacctcgcc 480 gtagtccgtg ttgaaccgcc gcgccaaggt ccgggccagc tccacatgct ggttctgatc 540 gtgaccgacg ggcacctctg aagcgccatg aagcaggatg tccgccgcca tgaggacggg 600 gtaggtgagc agaccaaggc gtacggagtt gctcccctgg gacttctc

47、ct tgaactgcac 660 catccttcga gcctccccga aggtgcaggt gcactcgaga agccacgtca acgccatgtg 720 ctcctggatg aggtccgact gcacgaagag acgttcctgg ggtacgcccg ccgcgatgag 780 taaagcgagt tggtggtcgg tcagttcctg gagacgttcg gggtcgtgct tggtcgtcat 840 ggcgtgcagg ttgctgacga aatacaggtc ttcggggccc gactgtgctg cccaacgacg 900 ca

48、ctgcccca aggtagttac ccaggtgcgc cttacctgaa ggcgtgatcc cggaaagact 960 gaacattggc cctgatcctc tcgtcttgac cgcatcgacg aggcgggccg accaagttca 1020 gcagcccgtc cctcggagcg gctggctggc tcggtcgagc gcaggttctt gggccgccct 1080 aggcggccca ccaacaaaga ttcctgcgca acatgatcgc gaacgtacca caactggcag 1140 gggccatcag gaagttcctg acagcccctg ctctcatcag gccggagcgg ttccggttgg 1200 tcgaggttct ccgaagagcg tcctgacggc tggatcctgg gctgcggcct gagcgcacct 1260 gacggcgagg cgtaccagtt cggagtcgga accctcacgc caggcaaggg acaaccgggc 1320 ggcaggcaca tccgtcac