猪胴体和肉质性状SNP遗传标记及应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410344261.5 (22)申请日 2014.07.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104087595 A (43)申请公布日 2014.10.08 (73)专利权人 湖北省农业科学院畜牧兽医研究 所 地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖瑶 苑1号 (72)发明人 彭先文乔木武华玉吴俊静 梅书棋郭咪咪宋忠旭刘贵生 孙华李良华张华盖 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 张红兵 (51)Int.Cl. C12N 15/1

2、2(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) 审查员 冯娟 (54)发明名称 猪胴体和肉质性状SNP遗传标记及应用 (57)摘要 本发明属于家畜遗传标记制备技术领域， 具 体涉及一种猪胴体和肉质性状的SNP遗传标记的 制备与应用， 从猪OLR1基因中克隆获得一种作为 遗传标记应用的猪胴体和肉质性状的基因片段， 其核苷酸序列如序列表SEQIDNO： 1和图4所示， 在图4所示序列的408bp处有一个C/T的碱基替 换， 该突变导致Pst -RFLP多态性。 本发明还公 开了制备猪胴体和肉质性状遗传标记的

3、方法以 及制备的遗传标记在猪胴体和肉质性状多态性 检测中的应用， 为猪的标记辅助选择提供了一个 新的标记。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图3页 CN 104087595 B 2017.01.04 CN 104087595 B 1.一种猪胴体和肉质性状SNP遗传标记， 其核苷酸序列如下所示： CGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATTACATG CATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGAAGA

4、TGGC AAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCATGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATCAATTCAGAAATG TTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGTTATCTCTGAGGA AACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTATTCTTTTCCTAAT CTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCRGCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTG

5、GGAAATTTCTGAATCT CTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTCCTTCTTACATTT ATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGT 上述序列中的第408bp处的R是C或T， 导致PstI-RFLP多态性。 2.一种筛选猪胴体和肉质性状遗传标记的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 从猪耳组织中提取基因组DNA， 根据猪OLR1基因序列设计引物， 其DNA序列如序列表SEQ IDNO： 4和5所示， 用正向引物CGGTGGAAGAGCATTT

6、GT和反向引物ACCTTGGGTCAGGCACTT在猪基 因组DNA中进行PCR扩增， PCR产物纯化和克隆测序， 获得如序列表SEQIDNO： 1所示的核苷 酸序列。 3.权利要求1所述的遗传标记在猪胴体和肉质性状检测中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104087595 B 2 猪胴体和肉质性状SNP遗传标记及应用 技术领域 0001 本发明属于猪的遗传标记制备技术领域， 具体涉及一种猪OLR1基因片段作为胴体 和肉质性状的遗传标记及应用， 所述的遗传标记克隆自猪OLR1基因。 背景技术 0002 随着分子生物学技术的发展， 逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择 和分子标

7、记渗入等分子育种技术， 这些技术与常规育种技术相结合大大加速了猪育种的进 程。 分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成， 从而实现对基 因型的直接选择， 进行分子育种， 是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用， 通过分子 标记的方法， 不仅能缩短育种时限， 大大减少育种的人力物力消耗； 另外， 分子标记的多样 性更使得分子标记在动物育种中的应用潜力大大提高(鲁绍熊,吴常信.,2000)。 用于辅助 选择的分子标记包括蛋白质标记， 微卫星标记， 单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism， 简称SNP)标记等。 0003 SNP标记指由基因

8、组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性， 包括碱基转换、 颠换、 单 碱基插入或缺失等， 被公认为是最新的第三代DNA分子标记。 其数量多， 多态性丰富。 其检测 方法包括PCR-SSCP、 PCR-RFLP、 测序及SNP芯片等。 限制性内切酶片段长度多态性 (RestrictionFragmentLengthPolymorphism， RFLP)是根据不同品种(个体)基因组的限 制性内切酶的酶切位点碱基发生突变， 或酶切位点之间发生了碱基的插入、 缺失， 导致酶切 片段大小发生了变化， 这种变化可以通过琼脂糖电泳进行检测， 从而可比较不同品种(个 体)的DNA水平的差异(即多态性)(Beuz

9、enN.D.,etal.2000)。 0004 氧化型低密度脂蛋白受体1(oxidizedlow-densitylipoproteinreceptor1, OLR1)是一类可以结合氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的受体。 Sawamura等(1997)首次在牛内皮 细胞上发现了OLR1基因， 并成功克隆了人内皮细胞OLR1基因， 随后相继克隆了大鼠、 小鼠及 兔子等OLR1基因的cDNA序列(Mikietal.,1998； Kumeetal.,1998)。 这几个物种中OLR1 基因的编码氨基酸序列比较相似。 猪OLR1基因有5个内含子和6个外显子， 编码274个氨基 酸， 与人OLR1基因有7

10、9的相似性， 与牛的相似性最高， 达到84(Yamanakaetal.,1998； Mingetal.,2001)。 OLR1基因被广泛认为与心血管疾病的形成密切相关， 此外在脂肪代谢 过程中发挥着重要的作用。 Patricia等(2005)首次在脂肪细胞中研究OLR1的作用， 证明 OLR1在PPAR和其相关抗糖尿病配体的参与下， 在调控脂代谢， 从而潜在地调节胰岛素抵 抗方面发挥着重要作用。 JuwonA等(2007)研究证明胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基 末端激酶(JNK)通路是OLR1在脂肪细胞中发挥作用的重要作用通路。 孙超等(2009)研究表 明OLR1基因在小鼠前体脂

11、肪细胞分化过程中通过P38MAPK通路发挥作用， 对抑制脂肪细胞 增殖有一定的作用。 李托(2013)在秦川牛群体中分析OLR1基因遗传多态性与肉质性状的相 关性， 发现在g.l0497位点存在CA突变， CC纯合基因型与秦川牛眼肌面积和眼肌深度有显 著相关性。 目前， OLR1基因的研究主要集中在人、 小鼠、 大鼠和牛等物种， 对猪OLR1基因的研 究报道较少， 申请人对该基因在猪中进行了多态性研究和关联分析， 为猪的遗传改良提供 说明书 1/6 页 3 CN 104087595 B 3 了重要的理论依据。 发明内容 0005 本发明的目的在于获得与猪胴体和肉质性状相关的SNP遗传标记及应用

12、。 从猪 OLR1基因克隆得到一个特异的DNA片段， 通过寻找SNP位点， 并建立相应的SNP检测方法， 分 析其与猪胴体性状和肉质性状的关系， 为猪的标记辅助选择提供一种新的遗传标记。 0006 本发明通过下列技术方案实现： 0007 申请人通过对猪OLR1基因的分离克隆， 发现了一种与猪胴体和肉质性状相关的 SNP分子标记， 其核苷酸序列如下所示： 0008 CGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATTACATGCATG TCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCA

13、GCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGAAGATGGCAAAG ATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCATGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATCAATTCAGAAATGTTCC TCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGTTATCTCTGAGGAAACC CAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTATTCTTTTCCTAATCTGC TGGTGAAGTTACTGCCGCATTCGCAGA

14、GTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGAAATTTCTGAAT CTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTCCTTCTTACAT TTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGT 0009 上述序列中的第408bp处的R是C或T， 该突变导致PstI-RFLP多态性。 0010 申请人设计了扩增上述猪OLR1基因片段的引物对(该引物对也是检测本发明的遗 传标记的引物对)， 其DNA序列如下所示： 0011 正向引物： 5 CGGT

15、GGAAGAGCATTTGT3 ， 0012 反向引物： 5 ACCTTGGGTCAGGCACTT3 。 0013 本发明建立了一种筛选与猪胴体和肉质性状相关的分子标记的方法， 其步骤包 括： 0014 提取猪基因组DNA， 根据NCBI中公布的猪OLR1基因序列信息， 设计PCR扩增引物对 (其核苷酸序列如序列表SEQIDNO： 4和SEQIDNO： 5所示)， 用该引物对进行PCR扩增， 得到 长为583bp的扩增片段， 其核苷酸序列如序列表SEQIDNO： 1(其第408bp处的R是C或T， 或参 见图4， 其中： 该序列中的R显示碱基突变位置， 即408bp处的R是C或T)、 SEQI

16、DNO： 2(梅山 猪： 其第408bp处突变的碱基是T)和SEQIDNO： 3(大白猪： 其第408bp处的突变的碱基是C) 所示， 该突变导致PstI-RFLP多态性， 进而对所获得的PCR产物酶切分型， 进行基因型与猪 胴体性状和肉质性状之间的关联分析， 为猪的标记辅助选择提供一个新的遗传标记。 0015 本发明的遗传标记可以应用于猪胴体和肉质性状检测中。 本发明设计的引物对也 可应用于猪胴体和肉质性状检测中。 0016 更详细的技术方案如 具体实施方式 所述。 附图说明 0017 序列表SEQIDNO： 1是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列， 序列长度为583bp， 其中在该序列的第4

17、08bp处(即显示R处)存在一个等位基因突变(T/C替换)。 说明书 2/6 页 4 CN 104087595 B 4 0018 序列表SEQIDNO： 2是克隆的中国地方猪品种 “梅山猪” 的核苷酸序列。 序列长度 为583bp， 其中在该序列的第408bp处存在一个T/C替换(已经显示的突变的碱基是T)。 0019 序列表SEQIDNO： 3是克隆的国外猪种 “大白猪” 的核苷酸序列。 序列长度为 583bp， 其中在该序列的第408bp处存在一个C/T替换(已经显示的突变的碱基是C)。 0020 序列表SEQIDNO： 4和SEQIDNO： 5是本发明设计的引物对的核苷酸序列。 0021

18、 图1： 分别是大白猪、 长白猪、 梅山猪和清平猪OLR1序列比对结果， 图中加粗的英文 字母代表SNP位点。 0022 图2： 是猪OLR1基因第5内含子的扩增结果。 0023 琼脂糖浓度为1.5； 图中标记说明： 泳道M： DL2000Marker； 泳道14分别为大白 猪、 长白猪、 梅山猪和清平猪中的扩增片段， 片段大小为583bp。 0024 图3： 猪OLR1基因PstI-RFLP检测结果。 0025 琼脂糖浓度为1.5； 图中标记说明： 泳道M为DL2000Marker； CC基因型， 583bp； CT 基因型， 583bp， 172bp， 411bp； TT基因型， 172b

19、p， 411bp。 0026 图4： 是本发明克隆的猪OLR1基因第5内含子的核苷酸序列， 其中第408bp处的r是C 或T突变， 该突变导致PstI-RFLP多态性。 具体实施方式 0027 实施例1猪OLR1基因片段的获得及多态性检测方法的建立 0028 本发明的试验猪品种为国外血缘猪品种大白猪和长白猪； 中国地方猪品种梅山猪 和清平猪， 样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎与分子育种湖北省重点实 验室提供， 为常用品种。 0029 猪基因组DNA的提取： 0030 采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书 进行操作)提取， 具体步骤如下所述： 0

20、031 (1)采取20-50mg猪的耳组织， 用眼科手术剪剪成糊状后放入2ml的离心管中， 加入 200 l裂解液TL， 用枪头吹打均匀。 0032 (2)加入20 l蛋白酶K(20mg/ml)， 剧烈颠倒充分混匀， 55水浴锅中消化过夜。 0033 (3)加入200 l结合液CB(该试剂盒自带)， 充分颠倒混匀， 70放置10min。 0034 (4)冷却后加入100 l异丙醇， 剧烈颠倒充分混匀。 0035 (5)用1mL的枪头吸取上述混合物， 加入吸附柱AC中， 10000rpm离心30s， 倒掉收集 管中的废液。 0036 (6)加入500uL抑制物去除液IR(该试剂盒自带)， 120

21、00rpm离心30s， 弃废液。 0037 (7)加入700 l漂洗液WB(该试剂盒自带)， 12000rpm离心30s， 倒掉废液。 0038 (8)重复操作步骤7。 0039 (9)将吸附柱AC放回收集管中， 12000rpm离心2min， 尽量去除漂洗液， 以免残留的 乙醇抑制下游反应。 0040 (10)取出吸附柱AC， 放入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位加50-100 l 洗脱缓冲液EB， 室温放置3-5min， 12000rpm离心1min， 将溶液收集到离心管中。 0041 (11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20下保存备用。 说明书 3/6 页 5 C

22、N 104087595 B 5 0042 根据OLR1基因的基因组序列( GenBank登陆号： NC_010447 .4， http:/ www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010447.4)设计以下引物对， 其DNA序列如下所示： 0043 正向引物： 5 CGGTGGAAGAGCATTTGT3 ， 对应序列是SEQIDNO： 4所示的序列。 0044 反向引物： 5 ACCTTGGGTCAGGCACTT3 ， 对应序列是SEQIDNO： 5所示的序列。 0045 利用上述引物对在大白猪、 长白猪、 梅山猪和清平猪基因组DNA中进行PCR扩增， PCR反应体系2

23、5 L， 体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、 1Taqbuffer2.5mmol/L、 MgCl21.5mmol/L、 dNTPs2.5mmol/L、 上述正反向引物各0.5mmol/L、 1UTaqDNA聚合酶， PCR 的运行程序如下： 预变性944min； 然后9430s， 5340s， 7250s， 35个循环； 最后72继 续延伸10min。 0046 对上述四个猪品种的PCR产物经GelExtractionKit试剂盒(购自上海生工生物 工程技术有限公司， 按照试剂盒说明书操作)纯化、 克隆测序(测序委托上海生工生物工程 技术有限公司进行)， 得到片段的大小为583bp，

24、其核苷酸序列如序列表SEQIDNO： 2(梅山 猪)和SEQIDNO： 3(大白猪)所示。 经ClusterW软件进行序列比对， 发现其中位于该片段 408bp处(第5内含子52bp处)C/T变异引起了Pst 酶切位点(CTGCA G)多态性改变。 0047 取5.5 LPCR产物加入限制性内切酶0.5 L(10U/ L),10buffer1 L,ddH2O3 L,置37恒温反应过夜， 后经1.5的琼脂糖凝胶凝胶电泳分析， 在凝胶成像系统观察并记 录酶切分型结果。 当408bp处的碱基都为C时Pst 不识别该位点， 记为CC型(583bp)， 当突变 位点碱基都为T时Pst 酶识别该位点， 记

25、为TT型(172bp+411bp)， 当C和T都存在时记为CT型 (583bp+172bp+411bp)。 猪OLR1基因的PCR-Pst -RFLP的酶切分型结果如图3。 0048 实施例2本发明的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测验证 0049 在两个中国地方猪品种(梅山猪、 清平猪)和两个国外猪种(大白猪、 长白猪)检测 猪OLR1基因第5内含子区PCR-Pst -RFLP多态性分布频率， 检测结果如表1所示。 在大白猪、 长白猪中C等位基因频率较高， 在梅山猪、 清平猪中， TT基因频率占优势， T等位基因的频率 较高， 国外血缘的猪和中国地方猪品种中存在显著的差异。 0050 表1

26、OLR1基因第5内含子区Pst 酶切多态在不同品种中的分布结果 0051 0052 实施例3本发明克隆的分子标记与猪生产性状的关联分析及应用 0053 为了确定猪OLR1基因多态性与猪胴体和肉质性状是否相关， 选择259头大白梅 山F2代(杂交方法为常用方法。 血样委托华中农业大学猪遗传育种农业部重点实验室采集) 资源群体为试验材料， 采用实施例1所建立的Pst -RFLP方法进行多态性检测， 采用SAS统 计软件(SASInstituteInc,Version8.0)GLM程序进行单标记方差分析， 分析猪OLR1基因 Pst -RFLP不同基因型与猪胴体和肉质性状的相关关系， 所采用模型为：

27、 说明书 4/6 页 6 CN 104087595 B 6 0054 模型Yijk +Gi+Sj+Yk(+bijkXijk)+eijk 0055 Yij为性状表型值， 为平均值， Gi为基因型效应， Sj、 Yk为固定效应， 分别为性别、 年 度效应， bijk为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数， 胴体性状以屠宰体重为协变量， 肉质性状 以屠宰日龄为协变量， eijk为残差效应。 0056 由表2可以看出： 基因型不同时， 皮率、 瘦肉率、 6-7腰椎间膘厚、 臀部膘厚、 背最长 肌含水量等性状存在显著差异(P0.05)， 肩部膘厚、 胸腰椎间膘厚、 平均背膘厚、 背最长肌 肌内脂肪含量等性状存在

28、极显著差异(P0.01)。 0057 表2猪OLR1基因PCR-Pst -RFLP基因型与胴体和肉质性状的统计分析表 0058 0059 0060 表1说明： (1)、 以上数值为最小二乘均值标准误； 同行含有相同字母表示差异不 显著， 不同小写字母表示差异显著(P0.05)， 不同大写字母表示差异极显著(P0.01)； 基因 型效应*表示P0.05， *表示P0.01。 0061 (2)、 上述指标中皮率、 瘦肉率、 肥肉率、 瘦肥肉比例、 肩部膘厚、 6-7腰椎间膘厚、 胸 腰椎间膘厚、 臀部膘厚、 平均背膘厚为胴体性状； 背最长肌含水量和背最长肌肌内脂肪含量 为肉质性状。 0062 主要

29、参考文献 0063 JuwonA ,MatthewK ,Franklin ,etal .Linoleicacidregulatesthe expressionofoxidizedlowdensitylipoproteinreceptor(OLR1)in3T3- L1adipocytesviaERKandJNKpathwaysJ.FASEBJournal,2007,21(5):A455APR 0064 PatriciaC,Hong-PingGuan ,MichaelL .PPARyregulatesadipocyte cholesterolmetabolismviaoxidizedLDLrece

30、ptorl.ClinInvest,2005,115(8): 2244-2256. 0065 李托.秦川牛OLR1基因多态性与肉质性状的关联分析及与bta-miR-370相互作用 的研究D.西北农林科技大学,2013年。 说明书 5/6 页 7 CN 104087595 B 7 0066 孙超等.脂肪酸对小鼠前体脂肪细胞增殖分化及OLR1基因转录表达的作用J.西 北农林科技大学学报,2009,37(3):1-6。 说明书 6/6 页 8 CN 104087595 B 8 0001 序列表 1/4 页 9 CN 104087595 B 9 0002 序列表 2/4 页 10 CN 104087595 B 10 0003 序列表 3/4 页 11 CN 104087595 B 11 0004 序列表 4/4 页 12 CN 104087595 B 12 说明书附图 1/3 页 13 CN 104087595 B 13 图1 图2 图3 说明书附图 2/3 页 14 CN 104087595 B 14 图4 说明书附图 3/3 页 15 CN 104087595 B 15