1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611224636.X (22)申请日 2010.12.09 (30)优先权数据 09178558.4 2009.12.09 EP (62)分案原申请数据 201080063420.4 2010.12.09 (71)申请人 诺维信公司 地址 丹麦鲍斯韦 (72)发明人 L贝尔MD托斯卡诺 EP弗里斯M莫勒英格尔森 H伦德克维斯特 S索尔洛贝丹兹 (74)专利代理机构 北京坤瑞律师事务所 11494 代理人 史悦 (51)Int.Cl. C12N 9/24(2006.01)
2、C12N 15/56(2006.01) A21D 8/04(2006.01) (54)发明名称 产生GH8木聚糖酶变体的方法 (57)摘要 本发明涉及产生GH8木聚糖酶变体的方法， 具体地涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽和 编码所述多肽的分离的多核苷酸。 本发明还涉及 包含所述多核苷酸的核酸构建体、 载体和宿主细 胞， 以及制备和使用所述多肽的方法。 权利要求书1页 说明书50页 序列表230页 附图2页 CN 106929494 A 2017.07.07 CN 106929494 A 1.一种产生亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法， 所述方法包括下述步骤： a)提供编码成熟亲本GH8木聚糖酶
3、多肽的多核苷酸， 所述多肽包含第一保守GH8木聚糖 酶基序： STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1)， b)将至少一个突变导入编码多核苷酸， 由此将至少一个改变在第一保守GH8木聚糖酶 基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处导入编码的多肽， 和 c)将突变的多核苷酸在合适宿主细胞中并在有助于产生变体的条件下进行表达， 其中所述变体具有木聚糖酶活性。 2.权利要求1的方法， 其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶多肽包含氨基酸序列， 所述氨基 酸序列与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159中任一所示的GH8木聚糖酶 的组中的GH8木聚
4、糖酶的成熟部分至少60相同。 3.权利要求1或2的方法， 其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶包含第二保守GH8木聚糖酶基 序： NDASXRLPQ (SEQ ID NO:155)。 4.权利要求1-3任一项的方法， 其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶包含或组成为SEQ ID NO:3的氨基酸28至433。 5.权利要求1-4任一项的方法， 其中所述编码的多肽中的至少一个改变包括在第一保 守GH8木聚糖酶基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处的一个或多个氨基酸 的取代、 缺失和/或插入。 6.权利要求1-5任一项的方法， 其中所述编码多肽中的至少一个改变包括在第一保守 GH8木聚糖酶基序N端侧
5、侧翼的15个氨基酸位置中的一个或多个处的一个或多个氨基酸的 插入； 优选一个或多个丙氨酸的插入。 7.权利要求1-6任一项的方法， 其中所述变体当以充足量在混合之前或混合过程中加 入生面团时， 具有至少一种面包改善特性。 8.权利要求1-7任一项的方法， 其中所述变体当以充足量在混合之前或混合过程中加 入生面团时， 能够增加烘烤产品的面包体积或增加烘烤产品表面上切痕的宽度。 9.权利要求7或8任一项的方法， 其中所述变体当以充足量在混合之前或混合过程中加 入生面团时， 与亲本GH8木聚糖酶相比， 提供粘性较低的生面团。 10.一种亲本GH8木聚糖酶多肽的分离的变体， 所述多肽包含第一保守GH8
6、木聚糖酶基 序： STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1), 其中所述变体与亲本相比在第一保守GH8基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个 或多个处包含至少一个氨基酸改变， 且其中所述变体具有木聚糖酶活性。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106929494 A 2 产生GH8木聚糖酶变体的方法 0001 本发明申请是基于申请日为2010年12月9日， 申请号为201080063420.4(国际申请 号为PCT/EP2010/069249)， 名称为 “产生GH8木聚糖酶变体的方法” 的发明专利申请的分案 申请。 0002 涉及序列表 0003 本申请包含计算机可读形式的序列
7、表。 所述计算机可读形式通过提述并入本文。 发明领域 0004 本发明涉及产生保留木聚糖酶活性的亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法。 本发 明还涉及具有木聚糖酶活性的分离的GH8多肽变体和编码所述多肽变体的分离的多核苷 酸。 本发明进一步涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、 载体和宿主细胞， 以及用于产生和 使用所述多肽的方法， 如， 制备生面团或从这种生面团制备的烘烤食物。 更具体而言， 本发 明涉及这样的工艺， 其中所述生面团与用亲本GH8木聚糖酶制备相比， 粘性较低， 和/或其中 面包具有增加的体积。 0005 发明背景 0006 糖和二醇缀合物(glycol-conjugate)是糖基转
8、移酶(GT)和糖苷水解酶(GH)的底 物。 糖苷水解酶的结构在二十世纪八十年代逐渐开始的得到解析。 与此同时， 发现了新GH蛋 白， 并确定了其氨基酸序列。 从这些新数据， 得到了两个主要的观察结果。 1)用于命名酶家 族的经典的E.C.命名系统不够精确至能够对越来越多的具有不同结构但实现相同酶反应 的酶进行分类。 2)通过同源性相关联的酶可具有不同的酶活性， 因此亦使得E.C.命名系统 对于这些相关的酶是易混淆的。 0007 在1991年， 由Bernard Henrissat基于酶结构提出了新的基于家族的命名系统 (Henrissat B.,A classification of glyc
9、osyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities.Biochem.J.280:309-316(1991)； Henrissat B.,Bairoch A.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities.Biochem.J.293:781-788(1993)； Henrissat B.,Bairoch A .U pda ting the seq uence- ba sed cla
10、ssif ica tion of g lycosyl hydrolases.Biochem.J.316:695-696(1996)以及Davies G.,Henrissat B.Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases.Structure 3:853-859(1995)。 最新的分类系 统可从Carbohydrate-Active EnZymes网站获得(CAZy)。 0008 基于氨基酸序列相似性将糖苷水解酶归类为家族的分类的导入是因为序列和折 叠类似性之间有直接关系， 而预期此种分类会： 0009 (i)反映酶的结构特征， 这无法仅通
11、过底物特异性反映， 0010 (ii)协助揭示酶之间的进化关系， 和 0011 (iii)提供用于得到机理信息的方便工具。 0012 将氨基酸序列根据其与特定GH家族的相似性分组可给出针对新的假设蛋白的活 性方面的概念。 这些氨基酸序列中的一些通过同源性归类为一个GH家族， 后来表明其具有 说明书 1/50 页 3 CN 106929494 A 3 某种酶活性。 因此， 简言之， 将新氨基酸序列归类于一个GH家族并未具体表明确切的酶活 性。 该酶活性必需通过克隆或纯化蛋白的活性测定来阐明。 若该测定是困难的， 蛋白实际功 能的确定可能多年仍无法揭示。 0013 糖苷水解酶家族8(GH8)包含具
12、有几种已知活性的酶： 内切葡聚糖酶(EC: 3.2.1.4)； 地衣聚糖酶(lichenase)(EC:3.2.1.73)； 壳聚糖酶(EC:3.2.1.132)。 0014 一些木聚糖酶受见于面粉中的组分所抑制， 这使得它们不适用于制造基于生面团 的产物。 GH8木聚糖酶不受生面团中的组分所抑制， 且其在生面团中仅需要非常低剂量以提 供烘烤面包的体积增加。 不幸的是， 在烘烤领域中众所周知， 使用任何目前为止鉴定出的天 然存在的GH8木聚糖酶得到粘性生面团， 对其存在操作困难。 发明内容 0015 发明人鉴定出了在广泛范围的GH8木聚糖酶中保守的特征性氨基酸基序， 其包含 这些木聚糖酶中活性
13、位点中的谷氨酸(E)亲核体： 0016 STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1)。 0017 使用了分子建模， 并鉴定出沿GH8木聚糖酶活性位点线性排列的结构环(参见图 1)。 该环包含保守的GH8基序N端侧直接侧翼的约20个连续氨基酸(图1)。 0018 制造了合成表达构建体(SEQ ID NO:2)， 其编码来自芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)KK-1(UNIPROT登录号O52730； SEQ ID NO:4)的成熟GH8木聚糖酶。 该合成构建体包含编 码相互融合的成熟GH8木聚糖酶多肽编码序列和异源信号肽的序列， 该构建体的核酸序列 就芽孢杆菌属表达进行了优化。
14、 编码的异源信号肽和成熟的GH8木聚糖酶的氨基酸序列示 于SEQ ID NO:3。 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列不言自明是相同的。 0019 保守的GH8基序见于SEQ ID NO:3或4中所示的成熟多肽的氨基酸位置65-70。 0020 SEQ ID NO:3中保守GH8基序侧翼的环通过其中包含的氨基酸的定点诱变来进行 突变。 进行了单个氨基酸的缺失、 插入和取代， 及其某些组合， 以产生多种具有木聚糖酶活 性的GH8变体， 参见下文。 在烘烤应用中调查了变体的活性， 且其显示令人惊讶的饶有兴趣 和有希望的特性。 0021 相应地， 在第一个方面， 本
15、发明涉及产生亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法， 所 述方法包括下述步骤： 0022 a)提供编码成熟亲本GH8木聚糖酶多肽的多核苷酸， 所述多肽包含第一保守GH8木 聚糖酶基序： 0023 STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1)， 0024 b)将至少一个突变导入编码多核苷酸， 由此将一个改变在第一保守GH8木聚糖酶 基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处导入编码的多肽， 和 0025 c)将突变的多核苷酸在合适宿主细胞中并在有助于产生变体的条件下进行表达， 0026 其中所述变体具有木聚糖酶活性。 0027 在第二个方面， 本发明涉及亲本GH8木聚糖酶多肽的分离的
16、变体， 所述多肽包含第 一保守GH8木聚糖酶基序： 0028 STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1)， 0029 其中所述变体相对于亲本在第一保守GH8基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的 说明书 2/50 页 4 CN 106929494 A 4 一个或多个中包含至少一个氨基酸改变， 且其中所述变体具有木聚糖酶活性。 0030 在第三个方面， 本发明涉及包含核苷酸序列的分离的多核苷酸， 所述核酸序列编 码第二个方面的变体多肽。 0031 第四个方面涉及包含第三个方面的多核苷酸的核酸构建体。 0032 第五个方面涉及包含第四个方面的核酸构建体的重组表达载体。 0033 第六个方
17、面涉及重组宿主细胞， 其包含前述方面的重组表达载体、 第四个方面的 核酸构建体或可操作连接的第三个方面的多核苷酸和一个或多个调控序列， 所述调控序列 指导变体多肽的产生。 0034 第七个方面涉及产生第二个方面的变体多肽的方法， 包括： (a)在有助于变体产生 的条件下， 培养包含核酸构建体的宿主细胞， 所述核酸构建体包含编码变体多肽的核苷酸 序列； 和(b)回收所述变体。 0035 其他方面涉及包含第二个方面的变体多肽的组合物， 用于制备烘烤产品的方法 (所述方法包括将第二个方面的变体多肽添加至所述烘烤产品的生面团的步骤)， 或包含第 二个方面的变体多肽的面包改善组合物。 0036 本发明的
18、另一个方面涉及用于增加烘烤产品的面包体积(loaf volume)的方法， 其包括在所述烘烤产品的生面团的混合过程中添加充足量的第二个方面的变体多肽或包 含所述多肽的组合物的步骤。 0037 本发明的仍旧另一个方面涉及增加烘烤产品的面包体积的方法或增加烘烤产品 表面上的切痕(cut)宽度的方法， 其包括在所述烘烤产品的生面团的混合过程中添加充足 量的第二个方面的变体多肽或包含所述多肽的组合物。 0038 在最后一个方面， 本发明涉及用于增加烘烤产品的面包体积或增加烘烤产品表面 上的切痕(cut)宽度的面包改善组合物， 其特征在于其包含至少一种第二个方面的变体多 肽。 0039 具体地， 本发明
19、涉及如下各项： 0040 1.一种产生亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法， 所述方法包括下述步骤： 0041 a)提供编码成熟亲本GH8木聚糖酶多肽的多核苷酸， 所述多肽包含第一保守GH8木 聚糖酶基序： 0042 STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1)， 0043 b)将至少一个突变导入编码多核苷酸， 由此将至少一个改变在第一保守GH8木聚 糖酶基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处导入编码的多肽， 和 0044 c)将突变的多核苷酸在合适宿主细胞中并在有助于产生变体的条件下进行表达， 0045 其中所述变体具有木聚糖酶活性。 0046 2.项1的方法， 其中所述成
20、熟亲本GH8木聚糖酶多肽包含氨基酸序列， 所述氨基酸 序列与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159中任一所示的GH8木聚糖酶的 组中的GH8木聚糖酶的成熟部分至少60相同。 0047 3.项1或2的方法， 其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶包含第二保守GH8木聚糖酶基 序： 0048 NDASXRLPQ (SEQ ID NO:155)。 0049 4.项1-3任一项的方法， 其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶包含或组成为SEQ ID NO: 说明书 3/50 页 5 CN 106929494 A 5 3的氨基酸28至433。 0050 5.项1-4任一项的方
21、法， 其中所述编码的多肽中的至少一个改变包括在第一保守 GH8木聚糖酶基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处的一个或多个氨基酸的 取代、 缺失和/或插入。 0051 6.项1-5任一项的方法， 其中所述编码多肽中的至少一个改变包括在第一保守GH8 木聚糖酶基序N端侧侧翼的15个氨基酸位置中的一个或多个处的一个或多个氨基酸的插 入； 优选一个或多个丙氨酸的插入。 0052 7.项1-6任一项的方法， 其中所述变体当以充足量在混合之前或混合过程中加入 生面团时， 具有至少一种面包改善特性。 0053 8.项1-7任一项的方法， 其中所述变体当以充足量在混合之前或混合过程中加入 生面团时，
22、 能够增加烘烤产品的面包体积或增加烘烤产品表面上切痕的宽度。 0054 9.项7或8任一项的方法， 其中所述变体当以充足量在混合之前或混合过程中加入 生面团时， 与亲本GH8木聚糖酶相比， 提供粘性较低的生面团。 0055 10.一种亲本GH8木聚糖酶多肽的分离的变体， 所述多肽包含第一保守GH8木聚糖 酶基序： 0056 STEGASXGASYFW (SEQ ID NO:1), 0057 其中所述变体与亲本相比在第一保守GH8基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的 一个或多个处包含至少一个氨基酸改变， 且其中所述变体具有木聚糖酶活性。 0058 11.项10的变体， 选自下述的变体组： 005
23、9 (a)变体多肽， 其包含氨基酸序列， 所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159中所示的GH8木聚糖酶的组中的GH8木聚糖酶的成熟部分具有至少 60序列同一性； 0060 (b)变体多肽， 其由多核苷酸编码， 所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与以 下杂交： (i)SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽编码序列， 或(ii)(i)的全长互补链； 0061 (c)变体多肽， 其由多核苷酸编码， 所述多核苷酸包含核苷酸序列， 所述核苷酸序 列与SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽编码序列具有至少60序列同一性； 和 0062 (d)(
24、a)、 (b)或(c)的变体， 其包含一个或多个氨基酸的取代、 缺失和/或插入。 0063 12.项10或11的变体， 其中所述亲本GH8木聚糖酶多肽包含第二保守GH8木聚糖酶 基序： NDASXRLPQ(SEQ ID NO:155)。 0064 13.项10-12任一项的变体， 其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶多肽包含氨基酸序列， 所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3中所示的GH8木聚糖酶的成熟部分至少60相同。 0065 14.项10-13任一项的变体， 其由多核苷酸编码， 所述多核苷酸在至少中等-高严格 条件下与以下杂交： (i)多核苷酸， 其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列
25、的核苷酸序列， 或(ii)(i)的全长互补链。 0066 15.项10-14任一项的变体， 其由多核苷酸编码， 所述多核苷酸包含核苷酸序列， 所 述核苷酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少60序列同一性。 0067 16.项10-15任一项的变体， 其由多核苷酸编码， 所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:2的核苷酸序列； 或其编码具有木聚糖酶活性的多肽片段的亚序列。 0068 17.项10-16任一项的变体， 其中所述成熟多肽包含或组成为SEQ IDNO:3的氨基酸 说明书 4/50 页 6 CN 106929494 A 6 28至433。 0069 18.项10-
26、17任一项的变体， 其中所述成熟多肽由多核苷酸编码， 所述多核苷酸包 含或组成为SEQ ID NO:2的核苷酸82至1299。 0070 19.项10-18任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含一个或多个氨基酸 的取代、 缺失和/或插入。 0071 20.项10-19任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含在N端侧距离第一 保守GH8木聚糖酶基序20， 19， 18， 17， 16， 15， 14， 13， 12， 11， 10， 9， 8， 7， 6， 5， 4， 3， 2和/或1个氨 基酸的一个或多个位置处， 或在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中的位置45， 46，
27、47， 48， 49， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 60， 61， 62， 63和/或64的一个或多个位置处的一个或多 个氨基酸的取代、 缺失和/或插入。 0072 21.项10-20任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含于第一保守GH8木 聚糖酶基序N端侧侧翼的15个氨基酸位置中的一个或多个中， 优选包含于第一保守GH8木聚 糖酶基序N端侧侧翼的12个氨基酸位置中的一个或多个中。 0073 22.项10-21任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中在N端侧距离第一保守GH8木聚糖酶基序
28、12个氨基酸的位置的位置处， 或 在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中的位置53的位置处的一个或多个插入。 0074 23.项10-21任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中在N端侧距离第一保守GH8木聚糖酶基序10个氨基酸的位置的位置处， 或 在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中的位置55的位置处的一个或多个插入。 0075 24.项10-21任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中在N端侧距离第一保守GH8木聚糖酶基序8个氨基酸的位置的位置处， 或 在对应于SEQ ID NO:3的
29、成熟多肽中的位置57的位置处的一个或多个插入。 0076 25.项10-21任一项的多肽， 其中所述至少一个氨基酸改变包含在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中在N端侧距离第一保守GH8木聚糖酶基序6个氨基酸的位置的位置处， 或 在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中的位置59的位置处的一个或多个插入。 0077 26.项10-21任一项的变体， 其中所述至少一个氨基酸改变包含在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中在N端侧距离第一保守GH8木聚糖酶基序4个氨基酸的位置的位置处， 或 在对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽中的位置61的位置处的一个或多个插入。 0078 27.项2
30、1-26任一项的变体， 其中所述一个或多个插入包含至少一个丙氨酸残基， 至少一个天冬氨酸残基， 至少一个丝氨酸残基， 至少一个赖氨酸残基， 和/或至少一个苯丙 氨酸的插入； 优选所述一个或多个插入包含至少一个丙氨酸残基的插入。 0079 28.项21-27任一项的变体， 其中所述一个或多个插入包含至少一个氨基酸残基和 至少一个额外的但不同的氨基酸残基在相同位置或在不同位置的插入。 0080 29.项10-28任一项的变体， 当其以充足量在混合之前或在混合过程中添加至生面 团时具有至少一种面包改善特性。 0081 30.项10-28任一项的变体， 当其以充足量在混合之前或混合过程中添加至生面团
31、时， 能够增加烘烤产品的面包体积， 或增加烘烤产品表面的切痕的宽度。 0082 31.项29或30的变体， 当将其与以相同量添加的亲本GH8木聚糖酶相比时， 其提供 了粘性较低的生面团。 说明书 5/50 页 7 CN 106929494 A 7 0083 32.一种分离的多核苷酸， 其包含核苷酸序列， 所述核苷酸序列编码项10-31任一 项的变体多肽。 0084 33.一种核酸构建体， 其包含可操作连接的项32的多核苷酸和一个或多个调控序 列， 所述调控序列指导所述变体多肽在表达宿主中的产生。 0085 34.一种重组表达载体， 其包含项33的核酸构建体。 0086 35.一种重组宿主细胞，
32、 其包含项34的重组表达载体、 项33的核酸构建体或可操作 连接的项32的多核苷酸和一个或多个调控序列， 所述调控序列指导所述变体多肽的产生。 0087 36.一种产生项10-31任一项的变体多肽的方法， 包括： (a)在有助于产生所述变体 的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞， 所述核酸构建体包含编码所述变体多肽的核苷 酸序列； 和(b)回收所述变体。 0088 37.一种组合物， 其包含项10-31任一项的变体多肽。 0089 38.一种用于制备烘烤产品的方法， 所述方法包括将项10-31任一项的变体多肽或 包含项10-31任一项的变体多肽的面包改善组合物添加至所述烘烤产品的生面团的步骤。
33、 0090 39.前述任一项项的方法， 其中所述变体多肽或面包改善组合物在生面团的混合 过程中添加。 0091 40.项38或39的方法， 其中所述面包改善组合物进一步包含一种或多种选自下列 的面包改善剂： 酶、 乳化剂、 氧化剂、 奶粉、 脂肪、 糖、 氨基酸、 盐、 蛋白(谷蛋白， 纤维素结合位 点)或其混合物。 0092 41.项40的方法， 其中所述酶选自下列： -淀粉酶、 -淀粉酶、 产麦芽糖淀粉酶、 其 他木聚糖酶、 蛋白酶、 葡糖氧化酶、 氧化还原酶、 葡聚糖酶、 纤维素酶、 转谷氨酰胺酶、 异构 酶、 脂肪酶、 磷脂酶、 果胶酶或其混合物。 0093 42.项38-41任一项的
34、方法， 其中所述变体多肽作为细胞提取物、 无细胞提取物或 纯化蛋白存在。 0094 43.项38-41任一项的方法， 其中将所述变体多肽与干粉或颗粒， 特别是无尘颗粒 形式， 或液体形式的其他成分混合， 优选与一种或多种稳定剂如多元醇、 糖、 有机酸或糖醇 混合。 0095 44.一种增加烘烤产品的面包体积的方法， 包括在混合所述烘烤产品的生面团的 过程中， 添加充足量的项10-31任一项的变体多肽或项37的组合物的步骤。 0096 45.一种用于增加烘烤产品的面包体积或用于增加烘烤产品表面上切痕的宽度的 方法， 包括在混合所述烘烤产品的生面团的过程中， 添加充足量的项10-31任一项的变体多
35、 肽或项37的组合物的步骤。 0097 46.一种用于增加烘烤产品的面包体积或用于增加烘烤产品表面上切痕的宽度的 面包改善组合物， 其特征在于其包含至少一种项10-31任一项的变体多肽。 附图说明 0098 图1(横向)显示来自芽孢杆菌属菌种KK-1(UNIPROT登录号O52730； SEQ ID NO:4) 的亲本GH8木聚糖酶的分子模型的切面。 提供了底物结合袋的特写(浅灰色网状)， 其中活性 位点(深灰色网状)略低于图像中心。 第一保守GH8木聚糖酶基序(未显示)N端侧侧翼的环 (深灰卷曲)见于活性位点略上方， 可能略伸入底物结合袋。 指示了三个环氨基酸残基53 说明书 6/50 页
36、8 CN 106929494 A 8 (Asp)、 55(Asn)和59(Gly)(深灰)， 并显示了底物袋中底物分子的棒状模型。 0099 图2(横向)显示如下文定义部分显示的计算出的木聚糖酶活性标准曲线， x轴为以 FXU/ml计的木聚糖酶活性， 而y轴为在595nm处的吸光度(Abs595或OD595nm)。 0100 定义 0101 木聚糖酶活性： 就本发明而言， 任何商业上可获得的木聚糖酶活性测量试剂盒适 用于确定木聚糖酶活性。 本发明中木聚糖酶活性测量的唯一目的是作为初级筛选以确保本 发明的GH8木聚糖酶变体并不会由于疏忽而被导入其中的氨基酸变化所失活。 一种合适的 测量木聚糖酶活
37、性的方式如下所示： 0102 底物： 0103 来自小麦的AZCL-阿拉伯木聚糖(Megazyme)。 0104 测定缓冲液： 0105 50mM B&R(50mM H3PO4， 50mM乙酸， 50mM H3BO3)， 50mM KCl， 1mM CaCl2， 0.01 Triton X-100， pH使用NaOH调整至6.0。 0106 酶： 0107 所有酶稀释在含0.01Triton X-100的蒸馏水中制备。 0108 底物溶液： 0109 在测定缓冲液中制备AZCL-阿拉伯木聚糖底物的0.2(w/v)浆料。 切割1000 l移 液头的尖端以虹吸均一的等分试样。 0110 标样： 0
38、111 BioFeed WheatTM(Novozymes A/S)， 稀释于0.01Triton X-100。 FXU/ml： 0.05； 0.10； 0.15； 0.20； 0.25； 0.30； 0.40。 0112 分析： 0113 1.在Eppendorf热混合器中在37(混合)。 0114 2.将750 l底物溶液置于冰上5分钟。 0115 3.添加50 l酶样品。 0116 4.在1400rpm， 37温育15分钟。 0117 5.在冰/水浴上终止反应。 0118 6.在10,000rpm， 4离心5分钟。 0119 7.将200 l上清转移至微滴定板。 0120 8.测量终点吸
39、光度， OD595nm。 0121 备注： 吸光度OD595nm应在0-1.5的范围。 0122 备注： 在该测定中， 从FXU标样获得标准曲线， 但测量的活性为木聚糖酶单位。 对 azo-木聚糖而非azcl-木聚糖测量FXU。 0123 标准曲线： 0124 从具有439FXU(W)/g的声明(declared)木聚糖酶活性的BioFeed WheatTM (Novozymes A/S)制备标准溶液。 将2.05g BioFeed WheatTM在0.9NaCl中溶解至100mL， 这 提供了具有9.0FXU/mL的活性的溶液(冻结的储液维持在-80)。 0125 进行测定之前， 即刻将储液
40、稀释10倍以提供测定储备溶液(储液)。 说明书 7/50 页 9 CN 106929494 A 9 0126 0127 计算： 0128 标准曲线是从酶标样的A595减去std1获得的(如下所示)。 0129 活性根据酶的A595减去空白值来计算。 因为酶稀释液通常为无色的， 在这些情况 下使用std1作为空白值。 0130 标准曲线计算的实例， 该曲线示于图2： 0131 0132 本发明的成熟变体多肽具有其成熟GH8亲本木聚糖酶多肽的至少20， 优选至少 40， 更优选至少50， 更优选至少60， 更优选至少70， 更优选至少80， 甚至更优选至 少90， 最优选至少95， 并且甚至最优选
41、至少100的木聚糖酶活性。 0133 分离的多肽： 术语 “分离的多肽” 用于本文中指从来源分离的多肽。 在一个优选的 方面， 所述多肽是至少1纯， 优选至少5纯， 更优选至少10纯， 更优选至少20纯， 更优 选至少40纯， 更优选至少60纯， 甚至更优选至少80纯， 和最优选至少90纯， 如通过 SDS-PAGE确定。 0134 成熟多肽： 术语 “成熟多肽” 在本文中定义为在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、 C端截短、 糖基化、 磷酸化等之后以其最终形式存在的多肽。 在一个方面， 所述成熟多肽包含 或组成为表1中列出的氨基酸位置， 参见下文。 0135 成熟多肽编码序列： 术语 “成熟多
42、肽编码序列” 在本文中定义为编码具有木聚糖酶 活性的成熟多肽。 在一个方面， 所述成熟多肽编码序列包含或组成为编码成熟多肽的核苷 酸， 所述成熟多肽包含或组成为表1中列出的氨基酸位置， 参见下文。 0136 序列同一性： 参数 “序列同一性” 描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间 说明书 8/50 页 10 CN 106929494 A 10 的相关性。 0137 就本发明而言， 两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包 (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trend
43、s in Genetics 16:276-277)， 优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman- Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。 使用的可选参数 为缺口产生罚分(gap open penalty)10， 缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和 EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。 使用Needle标记为 “最长同一性(longest identity)” 的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比， 并计算如
44、下： 0138 (同样的残基100)/(比对长度比对中缺口的总数) 0139 就本发明而言， 两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软 件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见 上文)， 优选3 .0 .0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。 使用的可选参数为缺口产生罚分10， 缺口延伸 罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵
45、。 使用Needle标记为 “最长同一性” 的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比， 并计算如下： 0140 (同样的脱氧核糖核苷酸100)/(比对长度比对中缺口的总数) 0141 同源序列： 术语 “同源序列” 在本文中定义为在用SEQ ID NO:3-154和159中任一所 示的任何多肽或其成熟部分进行的tfasty搜索(Pearson,W.R.,1999,于Bioinformatics Methods and Protocols中,S.Misener和S.A.Krawetz编,pp.185-219)中E值(或期望分数) 小于0.001的预测蛋白质。 0142 多肽片段
46、： 术语 “多肽片段” 在本文中定义为从SEQ ID NO:3-154和159中任一的成 熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽； 其中所 述片段具有木聚糖酶活性。 0143 亚序列： 术语 “亚序列(subsequence)” 在本文中定义为从成熟多肽编码序列或其 同源序列的5 和/或3 端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列； 其中所述亚序列编 码具有木聚糖酶活性的多肽片段。 0144 等位变体(allelic variant)： 术语 “等位变体” 在本文中表示占据相同染色体基 因座的基因的任何两种或更多种可选形式。 等位变异通过突变天然地发生， 并
47、且可导致种 群内的多态性。 基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨 基酸序列的多肽。 多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。 0145 分离的多核苷酸： 术语 “分离的多核苷酸” 用于本文中指从来源分离的多核苷酸。 在一个优选的方面， 多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的， 为至少1纯， 优选至少5纯， 更 优选至少10纯， 更优选至少20纯， 更优选至少40纯， 更优选至少60纯， 甚至更优选 至少80纯， 并且最优选至少90纯。 0146 编码序列： 当用于本文时术语 “编码序列” 的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸 序列的核苷酸序列。 编码序列的边界通常由开读
48、框决定， 所述开读框通常以ATG起始密码子 或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始， 并且以终止密码子例如TAA、 TAG和TGA结束。 编码序列可以是DNA、 cDNA、 合成的或重组的核苷酸序列。 0147 cDNA： 术语 “cDNA” 在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、 已 说明书 9/50 页 11 CN 106929494 A 11 剪接的mRNA分子制备的DNA分子。 cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。 起 始的(initial)、 初级的RNA转录物是mRNA的前体， 其通过一系列的步骤加工然后作为成熟 的已剪接的mRNA出现。 这些
49、步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。 因而源自mRNA 的cDNA没有任何内含子序列。 0148 核酸构建体： 术语 “核酸构建体” 用于本文指单链或双链的核酸分子， 其分离自天 然存在的基因或其受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核 酸的区段， 或其为合成的。 当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列 时， 术语核酸构建体与术语 “表达盒” 同义。 0149 调控序列(control sequence)： 术语 “调控序列” 在本文定义为包括对编码本发明 多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。 各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可 以是天然的或外源的， 或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。 这些调控序列包 括但不限于前导序列、 聚腺苷酸化序列、 前肽序列、 启动子、 信号肽序列和转录终止子。 最少 的情况， 调控序列包
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