Lys修饰的姜黄素衍生物、其合成及应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410562094.1 (22)申请日 2011.12.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104610089 A (43)申请公布日 2015.05.13 (62)分案原申请数据 201110415171.7 2011.12.13 (73)专利权人 首都医科大学 地址 100069 北京市丰台区右安门外西头 条10号 (72)发明人 赵明彭师奇王玉记吴建辉 王枫 (74)专利代理机构 北京思元知识产权代理事务 所(普通合伙) 11598 代理人 余光军

2、(51)Int.Cl. C07C 235/12(2006.01) C07C 231/12(2006.01) A61K 31/198(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (56)对比文件 CN 102250204 A,2011.11.23, CN 102241604 A,2011.11.16, 赵逸松等.靶向寡肽溶栓剂. 首都医科大学 学报 .2008,第29卷(第1期),103-105. 审查员 安玲玲 (54)发明名称 Lys修饰的姜黄素衍生物、 其合成及应用 (57)摘要 本发明公开了下式的

3、伪肽， 进一步公开了它 们的制备方法和用途。 本发明的伪肽具有优秀的 溶血栓活性、 抗血栓活性、 抗炎活性、 OH自由基清 除活性以及纳米结构。 权利要求书1页 说明书13页 附图5页 CN 104610089 B 2017.02.01 CN 104610089 B 1.下式的伪肽 2.制备权利要求1的伪肽的方法， 该方法由以下步骤构成： (1)在无水K2CO3存在下在无水THF中香草醛与溴乙酸乙酯反应生成3-甲氧基-4-氧乙酰 乙酯基苯甲醛； (2)在B2O3、 (nBuO)3B和nBu-NH2存在下3,4-二甲氧基苯甲醛在无水乙酸乙酯中与乙酰丙 酮缩合为6-(3,4-二-甲氧苯基)-5,6

4、-己烯-2,4-二酮； (3)在B2O3、 (nBuO)3B和nBu-NH2存在下， 在无水乙酸乙酯中6-(4-甲基-3-甲氧基苯基)- 5,6-己烯-2,4-二酮与3-甲氧基-4-氧乙酰乙酯基苯甲醛缩合为1-(4-甲基-3-甲氧基苯 基)-7-(4-氧乙酰乙酯基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮； (4)在NaOH存在下， 在丙酮中将1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯基-3-甲 氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮水解为1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酸基-3-甲 氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮； (5)在DCC和HOBt存在下

5、在无水THF中1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酸基-3-甲 氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮与Lys(Boc)-OBzl缩合为1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7- (4-氧乙酰-Lys(Boc)-OBzl-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮； (6)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys(Boc)- OBzl-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮脱去Boc生成1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7- (4-氧乙酰-Lys-OBzl-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮； (7)在NaOH存在下，

6、 在甲醇中将1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys-OBzl-3- 甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮水解为1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys- 3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮。 3.权利要求1的伪肽制备抗炎药物的应用。 4.权利要求1的伪肽制备OH自由基清除药物的应用。 5.权利要求1的伪肽制备溶血栓药物的应用。 6.权利要求1的伪肽制备溶血栓和抗血栓药物的应用。 7.权利要求1的伪肽制备溶血栓、 抗血栓和抗炎药物的应用。 8.权利要求1的伪肽制备溶血栓、 抗血栓、 抗炎和OH自由基清除药物的应用。 权利要求书 1/1 页

7、2 CN 104610089 B 2 Lys修饰的姜黄素衍生物、 其合成及应用 0001 本申请是2011年12月14日申请的申请号为： 201110415171.7， 发明名称为 “Lys及 Lys(Pro-Ala-Lys)修饰的姜黄素衍生物、 其合成及在医学中的应用” 的专利的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及了下式的伪肽， 本发明进一步涉及了它们的制备方法和用途。 本发明 的化合物除具有优秀的溶血栓活性、 抗血栓活性、 抗炎活性、 OH自由基清除活性以及纳米结 构。 本发明属于生物医药领域。 0003 背景技术 0004 姜黄素是姜黄的有效成分之一， 具有抗血栓、 抗炎及清除自由

8、基活性， 是安全低毒 的天然产物。 炎症反应促进凝血因子的释放与血小板活化， 同时下调天然抗凝物与抑制纤 溶活性， 血栓形成过程伴着急性炎症向漫性炎症转化的过程。 适度的炎症有利于遭受各种 损伤的机体维持自身内环境的稳定， 有利于机体维护自身结构的完整和功能的恢复。 然而， 过强的炎症反应可能加剧机体的损伤， 产生一序列的连锁反应， 造成恶性循环。 在溶栓治疗 中给与抗炎药物， 有助于提高溶栓率， 减轻组织损伤。 缺血再灌注损伤是造成溶栓后组织损 伤的一个原因， 自由基是造成再灌注损伤的一个重要因素。 在溶栓治疗中给与自由基清除 剂， 对于缺血再灌注损伤具有保护作用。 虽然姜黄素在体外抗血小板

9、聚集模型、 体外自由基 清除模型、 大鼠动静脉旁路插管抗血栓模型和小鼠耳肿胀抗炎模型上均表现出期待的活 性， 而且这些活性对脑缺血再灌注损伤、 心肌缺血再灌注损伤、 肺再灌注损伤均有保护作 用， 但是姜黄素没有溶血栓活性， 即产生缺血再灌注的前提不存在。 发明人认识到， 只有往 姜黄素中引入溶血栓寡肽才能实现它的所述保护作用。 0005 P6A(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)为纤维蛋白 链降解产物之一， 具有溶血栓活性。 发明 人在P6A的代谢研究中发现了代谢产物PAK。 在大鼠动静脉旁路插管溶血栓模型上， PAK的溶 血栓活性比母体P6A强。 按照一般的认识， 多肽在体内都会迅速降

10、解。 通过PAK的结构修饰延 缓体内降解速率和提高溶血栓活性， 是寡肽溶血栓药物研究的重要途径。 0006 按照一般的认识， 含多肽的两亲性分子， 例如脂肪醇链修饰的多肽， 在适当的条件 下通过分子间非共价键相互作用可形成纳米结构。 借助纳米结构可改善多肽在体内的输 送、 延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。 根据这些认识， 发明人提出了本发 明。 发明内容 0007 本发明的第一个内容是提供下式的伪肽。 说明书 1/13 页 3 CN 104610089 B 3 0008 0009 本发明的第二个内容是提供伪肽的制备方法， 该方法由以下步骤构成： 0010 (1)在无水K2CO3存

11、在下在无水THF中香草醛与溴乙酸乙酯反应生成3-甲氧基-4-氧 乙酰乙酯基苯甲醛； 0011 (2)在B2O3、 (nBuo)3B和nBu-NH存在下3， 4-二甲氧基苯甲醛在无水乙酸乙酯中与乙 酰丙酮缩合为6-(3， 4-二-甲氧苯基)-5， 6-己烯-2， 4-二酮； 0012 (3)在B2O3、 (nBuo)3B和nBu-NH存在下， 在无水乙酸乙酯中6-(4-甲基-3-甲氧基苯 基)-5， 6-己烯-2， 4-二酮与3-甲氧基-4-氧乙酰乙酯基苯甲醛缩合为1-(4-甲基-3-甲氧基 苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯基-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮； 0013 (4)在

12、NaOH存在下， 在丙酮中将1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯基- 3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解为1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酸基- 3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮； 0014 (5)在DCC和HOBt存在下在无水THF中1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酸基- 3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮与Lys(Boc)-OBzl缩合为1-(4-甲基-3-甲氧基苯 基)-7-(4-氧乙酰-Lys(Boc)-OBzl-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮； 0015 (6)

13、在氯化氢-乙酸乙酯溶液中1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys (Boc)-OBzl-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮脱去Boc生成1-(4-甲基-3-甲氧基苯 基)-7-(4-氧乙酰-Lys-OBzl-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮； 0016 (7)在NaOH存在下， 在甲醇中将1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys- OBzl-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解为1-(4-甲基-3-甲氧基苯基)-7-(4-氧乙 酰-Lys-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮。 0017 所述

14、步骤可以用图1的合成路线进一步描述。 0018 本发明的第三个内容是评价伪肽制备抗炎药物的应用。 0019 本发明的第四个内容是评价伪肽制备OH自由基清除药物的应用。 0020 本发明的第五个内容是评价伪肽制备溶血栓药物的应用。 0021 本发明的第六个内容是评价伪肽制备溶血栓和抗血栓药物的应用。 0022 本发明的第七个内容是评价伪肽制备溶血栓、 抗血栓和抗炎药物的应用。 0023 本发明的第七个内容是评价伪肽制备溶血栓、 抗血栓、 抗炎和OH自由基清除药物 的应用。 附图说明 0024 图1合成路线.3a-7aRH， 3b-7bRCH3。 0025 图2化合物5a纳米环的透射电镜照片。 0

15、026 图3化合物5b纳米管的透射电镜照片。 0027 图4化合物7a的纳米球透射电镜照片。 0028 图5化合物7b的纳米棒透射电镜照片。 说明书 2/13 页 4 CN 104610089 B 4 具体实施方式 0029 为了进一步阐述本发明， 下面给出一系列实施例。 这些实施例完全是例证性的， 它 们仅用来对本发明进行具体描述， 不应当理解为对本发明的限制。 0030 实施例1制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc) 0031 1)Boc-Pro-Ala的制备 0032 将1.075g(5.0mmol)Boc-Pro溶于20mL无水THF， 冰浴下向溶液中加入0.637g (5mmo

16、l)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)， 并使完全溶解。 冰浴下， 把已溶于少量无水THF的二环己 基羰二亚胺(DCC)1.236g(6.0mmol)加入反应液中。 室温搅拌7h， TLC(石油醚/乙酸乙酯， 3 1)监测Boc-Pro消失。 滤除二环己基脲(DCU)， 滤液减压浓缩除去THF。 残留物用乙酸乙酯溶 解， 溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、 饱和NaCl水溶液洗， 然后将乙酸乙酯层减压浓缩至 干、 残留物加入适量THF溶解之后再加入0.489g(5.5mmol)Ala的水溶液。 混合物用NaHCO3固 体调pH9， 室温反应12h， 反应混合物减压浓缩除去THF， 残留物加5mL

17、水溶解， 水溶液用饱和 KHSO4水溶液调pH2， 用30mL乙酸乙酯萃取5次， 合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗至 中性， 无水硫酸钠干燥。 过滤， 滤液减压浓缩至干， 得1.35g(94)标题化合物， 为无色固体。 ESI-MS(m/e)： 285M-H-。 0033 2)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl的制备 0034 将1.202g(4.2mmol)Boc-Pro-Ala溶于20mL无水THF， 冰浴下向溶液中加入0.544g (4mmol)HOBt， 完全溶解之后加入1.030g(5mmol)DCC， 得到反应液(I)， 搅拌30分钟。 把 2.168g(4.

18、0mmol)Lys(Boc)-OBzl悬浮于20mL无水THF中， 然后加入1mLN-甲基吗啉(NMM)， 调 pH9， 得到反应液(II)。 冰浴下将反应液(II)加入反应液(I)中搅拌1h之后， 室温搅拌4h， TLC(氯仿/甲醇， 15 1)显示Lys(Boc)-OBzl消失。 滤除DCU， 滤液减压浓缩除去THF。 残留物用 50mL乙酸乙酯溶解。 得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、 饱和NaCl水溶液洗、 5KHSO4 水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。 乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥， 过滤， 滤液减压浓缩至干， 得 到1.915g(75)标题化合物， 为无色粉末。 ESI

19、-MS(m/e)： 604M+H+。 0035 3)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)的制备 0036 将1.585g(3.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl溶于15mL甲醇。 冰浴下将得到的 溶液用NaOH(2N)水溶液调pH12并搅拌2h， TLC(二氯/甲醇， 15 1)显示Boc-Pro-Ala-Lys (Boc)-OBzl消失。 反应混合物用2N稀盐酸调pH2， 减压浓缩除甲醇。 残留物用乙酸乙酯萃取 3次。 合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗至中性， 无水Na2SO4干燥。 过滤， 滤液减压浓缩 至干， 得1.397g(85)标题化合物， 为无

20、色固体。 ESI-MS(m/e)： 514M-H-。 0037 实施例2制备1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酸基)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚 二烯-3， 5-二酮 0038 1)6-(3-甲氧基-4-羟苯基)-5， 6-己烯-2， 4-二酮的制备 0039 31mL(0.3mol)乙酰丙酮置于250mL三颈瓶中， 加入14.5g(0.21mol)三氧化二硼和 70mL乙酸乙酯、 70反应一小时使变为白色悬浊液， 然后加入29.5mL(0.11mol)硼酸三正丁 酯和15.2g(0.1mol)3-甲氧-4-羟基苯甲醛， 85反应0.5小时使溶液变浅黄色悬浊液、 通过 恒压漏斗滴

21、加10.88mL(0.11mol)正丁胺的乙酸乙酯溶液， 反应1小时使溶液变为红色， 降温 至50、 加入200mL1N盐酸、 反应0.5小时、 停止反应。 分出水层， 用40mL乙酸乙酯萃取三次、 说明书 3/13 页 5 CN 104610089 B 5 合并乙酸乙酯、 用无水硫酸钠干燥、 滤出硫酸钠、 滤液减压除去溶剂， 残留物用硅胶柱层析 纯化、 得到8.2g(34.6)标题化合物， 为淡黄色固体。 ESI-MS(m/e)： 235M+H+。 0040 2)3-甲氧基-4-氧乙酰乙酯基苯甲醛的制备 0041 将7 .6g(50mmol)香草醛置于250mL茄瓶内用无水THF溶解， 然后

22、加入9 .66g (70mmol)无水碳酸钾， 反应30min使混合物变为白色浑浊液。 滴加5.93mL(55mmol)溴乙酸乙 酯、 反应48h、 TLC显示香草醛消失。 滤除不溶物、 减压除去溶剂、 残留物用200mL乙酸乙酯溶 解、 用饱和碳酸氢钠水溶液洗三次、 加入无水硫酸钠干燥。 除去溶剂后得到11 .316g (95.1)标题化合物， 为无色固体。 ESI-MS(m/e)： 239M+H+。 0042 3)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5- 二酮的制备 0043 按实施例2中1)项的制备方法由1.097g(4.42m

23、mol)6-(3-甲氧基-4-羟苯基)-5， 6- 己烯-2， 4-二酮和1.088g(4.87mmol)3-甲氧基-4-氧乙酰乙酯基苯甲醛反应， 经硅胶柱层析 纯化后得到0.435g(21.0)标题化合物， 为淡黄色固体。 ESI-MS(m/e)： 455M+H+。 0044 4)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酸基-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二 酮的制备 0045 将454mg(1mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯基-3-甲氧基苯基)- 1， 6-庚二烯-3， 5-二酮置于100mL茄瓶内、 加入丙酮使溶解， 溶液黄色透明。 然

24、后滴加1mL4N 的氢氧化钠水溶液、 溶液逐渐由红变为红黑色。 5min后， 有黄色固体析出。 10min后， TLC显示 1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯基-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮消 失。 滴加2NHCl水溶液， 调节pH值到中性， 减压除去丙酮， 残留物过滤、 用自来水洗涤沉淀、 得到424mg(96.4)标题化合物， 为橙色粉末。 ESI-MS(m/e)： 439M-H-。 0046 实施例3制备1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酸基)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二 烯-3， 5-二酮 0047 1)6-(3， 4-二-甲氧苯

25、基)-5， 6-己烯-2， 4-二酮的制备 0048 按实施例2中1)项的制备方法由16.6g(0.1mol)3， 4-二-甲氧基苯甲醛和31mL (0.3mol)乙酰丙酮反应， 经柱层析纯化得到8.6g(34.6)标题化合物， 为淡黄色固体。 ESI- MS(m/e)： 235M+H+。 0049 2)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酰乙酯-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二 酮的制备 0050 按实施例2中1)项的制备方法由1.097g(4.42mmol)6-(3， 4-二-甲氧苯基)-5， 6-己 烯-2， 4-二酮和1.088g(4.87mmol)3-甲氧基

26、-4-氧乙酰乙酯基苯甲醛反应， 经硅胶柱层析纯 化后得到0.435g(21.0)标题化合物， 为淡黄色固体。 ESI-MS(m/e)： 469.6M+H+。 0051 3)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酸基-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮 的制备 0052 按实施例2中4)项的制备方法由454mg(1mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙 酰乙酯-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解得447mg(98)标题化合物， 为橙色粉 末。 ESI-MS(m/e)： 454M-H-。 0053 实施例4制备1-(3-甲氧基-4-羟苯

27、基)-7-(4-氧乙酰-Lys)-3-甲氧基苯基-1， 6- 庚二烯-3， 5-二酮(5a) 说明书 4/13 页 6 CN 104610089 B 6 0054 1)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Boc)-OBzl-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0055 按实施例1中2)项的制备方法由4.4g(10mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧 乙酸基-3-甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮和5.08g(10mmol)Lys(Boc)-OBzl反应， 得 7.02g(94)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e

28、)： 745M+H+.1HNMR(300MHz， CDCl3- d1)： /ppm7.65-7.58(m， 2H)， 7.45(d， J7.2Hz， 1H)， 7.38-7.33(m， 5H)， 7.16-7.07(m， 4H)， 6.97-6.90(m， 2H)， 6.57-6.48(m， 2H)， 5.84(s， 1H)， 5.24-5.15(m， 2H)， 4.77-4.73(m， 1H)， 4.71-4.56(m， 2H)， 4.50(bs， 0.91H)， 3.97(s， 3H)， 3.94(s， 3H)， 3.06-3.04(m， 2H)， 1.96-1.66(m， 2H)， 1.

29、45(s， 11H)， 1.33(m， 2H)。 0056 2)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys-OBzl)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二 烯-3， 5-二酮的制备 0057 将3.72g(5mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Boc)-OBzl-3-甲 氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮溶解在40mL4N的氯化氢-乙酸乙酯溶液中， 冰浴搅拌2小 时， TLC(二氯/甲醇， 15/1)显示1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys(Boc)-OBzl-3- 甲氧基苯基)-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮消失。 减压浓

30、缩除去乙酸乙酯、 残留物反复加少量乙醚 进行减压浓缩以除去氯化氢气， 最后得3.32g(98)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/ e)： 645M+H+。 0058 3)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0059 按实施例1中3)项的制备方法由2.57g(4mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧 乙酰-Lys-OBzl)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解得2.15g(93)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 555M+H+.1HNMR(300MHz

31、， DMSO-d6)： /ppm8.42-8.40(m， 1H)， 8.19(bs， 0.7H)， 7.59(s， 1H)， 7.54(s， 1H)， 7.39-7.14(m， 4H)， 6.97-6.76(m， 4H)， 6.12 (s， 1H)， 4.64(s， 2H)， 4.25(m， 1H)， 3.86(s， 3H)， 3.83(s， 3H)， 2.73-2.71(m， 2H)， 1.74(m， 2H)， 1.54(m， 2H)， 1.33(m， 2H)。 0060 实施例5制备1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚 二烯-3， 5-二

32、酮(5b) 0061 1)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Boc)-OBzl-3-甲氧基苯基-1， 6- 庚二烯-3， 5-二酮的制备 0062 按实施例1中2)项的制备方法由4.6g(10mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙 酸基)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮和5.08g(10mmol)Lys(Boc)-OBzl反应， 得 7.24g(94)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 759M+H+.1HNMR(300MHz， CDCl3- d1)： /ppm7.66-7.580(m， 2H)， 7.45(d， J7

33、.2Hz， 1H)， 7.38-7.33(m， 5H)， 7.17-7.10(m， 4H)， 6.92-6.88(m， 2H)， 6.56-6.50(m， 2H)， 5.85(s， 1H)， 5.23-5.14(m， 2H)， 4.74-4.72(m， 1H)， 4.66-4.60(m， 2H)， 4.55(bs， 1H)， 3.95(s， 3H)， 3.94(s， 3H)， 3.93(s， 3H)， 3.03(m， 2H)， 1.91-1.73(m， 2H)， 1.46(s， 11H)， 1.30(m， 2H)。 0063 2)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys-OBz

34、l)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二 烯-3， 5-二酮的制备 0064 按实施例4中2)项的制备方法由3.81g(5mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧 说明书 5/13 页 7 CN 104610089 B 7 乙酰-Lys(Boc)-OBzl)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮脱除Boc得3.45g(98)标题 化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 660M+H+。 0065 3)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5- 二酮的制备 0066 按实施例1中3)项的制备方法由261

35、mg(0.4mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧 乙酰-Lys-OBzl)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解得223mg(93)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 569M+H+.1HNMR(300MHz， DMSO-d6)： /ppm8.34-8.31(m， 0.4H)， 7.97(bs， 0.7H)， 7.61(s， 1H)， 7.56(s， 1H)， 7.39-7.28(m， 4H)， 7.03-6.82(m， 4H)， 6.13(s， 1H)， 4.64(s， 2H)， 4.25(m， 1H)， 3.87(s， 3H)， 3.83

36、(s， 3H)， 3.81(s， 3H)， 2.76-2.71 (m， 2H)， 1.74(m， 2H)， 1.54(m， 2H)， 1.33(m， 2H)。 0067 实施例6制备1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Pro-Ala-Lys)-3-甲氧 基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮(7a) 0068 1)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl-3- 甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0069 按实施例1中2)项的制备方法由5.08g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(

37、Boc)和4.4g (10mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys-Obzl)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二 烯-3， 5-二酮反应， 得7.02g(94)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 1141M+H+.1H NMR(300MHz， DMSO-d6)： /ppm7.63-7.53(m， 3H)， 7.35(s， 5H)， 7.25(bs， 0.5H)， 7.14-7.07 (m， 4H)， 6.96-6.90(m， 2H)， 6.79(m， 1H)， 6.60-6.48(m， 3H)， 5.84(s， 1H)， 5.18(s， 2H)， 4.

38、68- 4.57(m， 4H)， 4.36-4.18(m， 3H)， 3.95(s， 3H)， 3.92(s， 3H)， 3.50-3.48(m， 2H)， 3.17(m， 2H)， 3.08(m， 2H)， 2.19-1.25(m， 42H)。 0070 2)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-3-甲氧 基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0071 按实施例1中3)项的制备方法由456mg(0.4mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4- 氧乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl-3-甲氧

39、基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解得 371mg(93)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 1051M+H+。 0072 3)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Pro-Ala-Lys)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0073 按实施例4中2)的制备方法由371mg(0.36mmol)1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-7-4-氧 乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮脱除Boc得 315mg(98)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 851M

40、+H+. 1HNMR(300MHz， DMSO-d6)： /ppm8.74-8.72(m， 2H)， 8.02-7.96(m， 5H)， 8.00-6.66(m， 12H)， 6.10(s， 1H)， 4.60(s， 2H)， 4.35(m， 1H)， 4.33-4.08(m， 3H)， 3.93(s， 3H)， 3.81(s， 3H)， 3.20(m， 2H)， 3.10-2.95(m， 2H)， 2.70(m， 2H)， 2.33-2.22(m， 1H)， 1.86(m， 6H)， 1.76-1.54(m， 7H)， 1.52-1.19(m， 9H)。 0074 实施例7制备1-(3， 4

41、-二-甲氧苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Pro-Ala-Lys)-3-甲氧基 苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮(7b) 0075 1)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-4-氧乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl-3-甲 氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0076 按实施例1中2)项的制备方法由4.6g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)和5.08g 说明书 6/13 页 8 CN 104610089 B 8 (10mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-(4-氧乙酰-Lys-OBzl)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二

42、烯- 3， 5-二酮反应， 得7.24g(94)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 1155M+H+. 1HNMR (300MHz， CDCl3-d1)： /ppm7.66-7.52(m， 3H)， 7.36(m， 5H)， 7.17-7.10(m， 4H)， 6.95-6.89 (m， 2H)， 6.74(m， 1H)， 6.57-6.51(m， 3H)， 5.87(s， 1H)， 5.19(m， 2H)， 4.68-4.56(m， 3H)， 4.37- 4.16(m， 3H)， 3.96(s， 3H)， 3.95(s， 3H)， 3.93(s， 3H)， 3.49(m，

43、2H)， 3.17-3.07(m， 4H)， 2.23 (m， 2H)， 2.08(m， 2H)， 1.92-1.77(m， 5H)， 1.48-1.35(m， 30H)。 0077 2)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-4-氧乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-3-甲氧基 苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮的制备 0078 按实施例1中3)项的制备方法由465mg(0.4mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-4-氧 乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮水解得 401mg(93)标题化合

44、物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 1065M+H+。 0079 3)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-4-氧乙酰-Lys(Pro-Ala-Lys)-3-甲氧基苯基-1， 6- 庚二烯-3， 5-二酮的制备 0080 按实施例4中2)项的制备方法由213mg(0.2mmol)1-(3， 4-二-甲氧苯基)-7-4-氧 乙酰-LysBoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-3-甲氧基苯基-1， 6-庚二烯-3， 5-二酮脱除Boc得 152mg(88)标题化合物， 为黄色粉末。 ESI-MS(m/e)： 865M+H+. 1HNMR(300MHz， DMSO-d6)： /ppm8.7

45、4-8.72(m， 2H)， 8.02-7.96(m， 5H)， 8.00-6.66(m， 12H)， 6.10(s， 1H)， 4.60(s， 2H)， 4.35(m， 1H)， 4.33-4.08(m， 3H)， 3.93(s， 3H)， 3.81(s， 3H)， 3.20(m， 2H)， 3.10-2.95(m， 2H)， 2.70(m， 2H)， 2.33-2.22(m， 1H)， 1.86(m， 6H)， 1.76-1.54(m， 7H)， 1.52-1.19(m， 9H)。 0081 实施例8通式1的化合物静脉注射的溶血栓活性 0082 1)评价方法 0083 将200-220g雄

46、性SD大鼠用20乌拉坦溶液(6mL/kg， i.p.)进行麻醉。 麻醉大鼠仰 卧位固定， 分离右颈总动脉， 于近心端夹动脉夹， 近心端和远心端分别穿入手术线， 将远心 端的手术线于皮毛用止血钳夹紧， 在远心端插管， 松开动脉夹， 放出约1mL动脉血并装在1mL 的EP管中。 往垂直固定的玻璃管(长15mm， 内径2.5mm， 外径5.0mm， 管底用胶塞密封)中注入 0.1mL大鼠动脉血液， 往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。 该血栓固定螺旋用 直径为0.2mm的不锈钢丝绕成， 螺旋部分长12mm， 含15个螺圈， 螺圈的直径为1.0mm， 托柄与 螺旋相连， 长7.0mm， 呈问号

47、型。 血液凝固15min后， 打开玻璃管底部的胶塞， 用镊子固定血栓 固定螺旋的托柄， 从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋， 精确称重。 0084 旁路插管由3段构成， 中段为聚乙烯胶管， 长60mm， 内径3.5mm， 两端为相同的聚乙 烯管， 长100mm， 内径1mm， 外径2mm， 该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)， 外 径1mm， 另一端的外部套一段长7mm， 外径3.5mm的聚乙烯管(加粗， 用于插入中段的聚乙烯胶 管内)。 3段管的内壁均硅烷化。 将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内， 胶管的 两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。 用注射器通过尖管端将管中

48、注满肝素生理盐水溶液 (50IU/kg)备用。 0085 分离大鼠的左颈外静脉， 近心端和远心端分别穿入手术线， 结扎远心端， 在暴露的 左颈外静脉上小心地剪一斜口， 将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开 口的近心端， 同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。 用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)， 此时注射器不撤离聚 说明书 7/13 页 9 CN 104610089 B 9 乙烯管， 用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。 在右颈总动脉的近心端用动脉夹止 血， 在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。 从聚乙烯管

49、的尖部拔出注射器， 将聚 乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。 旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。 0086 用头皮针将生理盐水， 尿激酶的生理盐水溶液或不同浓度化合物的生理盐水溶液 通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)， 刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处， 打 开动脉夹， 使血流通过旁路管道从动脉流向静脉， 此即大鼠动静脉旁路溶栓模型， 缓慢将注 射器中的液体注入到血液中(约6min)， 使生理盐水， 尿激酶或本发明的化合物通过血液循 环， 按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。 从开始注射时计时， 1h后从旁路管道中取出血 栓固定螺旋， 精确称重。 计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差， 统计并 评价化合物的体内溶栓活性。 血栓减重用均值和标准差表示。 0087 2)给药剂量 0088 生理盐水(空白对照)剂量为3mL/kg， 尿激酶(阳性对照)剂量为20000U/kg相当于 1.68mg/kg， 通式I的化合物5a和5b的剂量为10nmol/kg， 通式I的化合物7a和7b的剂量为 1.0nmol/kg。 0089 3)评价结果见表1。 结果表明通式I的化合物5a， 5b， 7a和7b都有优秀的溶血栓活 性。 0090 表1化合物经静脉注射给药的溶血栓活性a 0091 0092 a)n10； b)与生理盐水组