N(2)L丙氨酰L谷氨酰胺的制备方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611257271.0 (22)申请日 2016.12.30 (71)申请人 山东辰龙药业有限公司 地址 272300 山东省济宁市鱼台县张黄工 业园 (72)发明人 周霞李亭李德坤郭维韩冉 聂重重 (74)专利代理机构 青岛发思特专利商标代理有 限公司 37212 代理人 耿霞 (51)Int.Cl. C12P 21/02(2006.01) C07K 5/062(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/3

2、0(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (54)发明名称 N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺的制备方法， 属于药品的合成制备技术领 域， 包括N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备、 N-邻苯 二甲酰-L-丙氨酰氯的制备、 酶促合成N(2)-L-丙 氨酰-L-谷氨酰胺、 酶的灭活和粗品精制， 最后制 得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精品。 该方法， 采 用酶法制备的工艺生产N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺， 对N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备的合成 工序采用高温熔融的方法， 减少甲苯、 三乙胺、

3、 盐 酸等溶剂的使用， 酶促合成工艺采用吸附法对肽 基转移酶进行固定， 同时用海藻酸钠壳聚糖对肽 基转移酶进行包埋形成微囊化固定化酶， 并考察 了改固定化酶的活性， 可以证明该固定化酶通透 性良好， 包埋后使用效率有了较大提升， 提高N (2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺收率、 降低生产成本。 权利要求书1页 说明书5页 CN 106701869 A 2017.05.24 CN 106701869 A 1.一种N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于， 采用酶法制备的工艺生 产N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 具体步骤如下： 1)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备： L-丙氨

4、酸、 邻苯二甲酸酐加入反应釜中， 在高温熔 融状态下进行合成反应， 生成N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸； 2)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯的制备： 以甲苯为溶剂， 投入N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸， 加 入氯化亚砜， 进行升温至45-55， 回流1-1.2小时， 然后保温反应3-3.5小时， 再进行减压蒸 馏3-3.5小时， 真空抽带降温， 得到N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯； 3)酶促合成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺： 将步骤2)制备的N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯 投入水中， 用氢氧化钠调节pH至7.5-8.0， 投入谷氨酰胺， 将固定化肽基转移酶加入到反应 中， 过程中加入碳酸氢钠调节pH至

5、7.5-8.0， 搅拌， 反应溶液经离心得N(2)-L-丙氨酰-L-谷 氨酰胺溶液； 4)酶的灭活： 将收集到的上述N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液加入到甲醇溶剂中， 析 晶后离心得固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 再将固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺投入水 中， 加热至55-65， 加入活性炭吸附过滤， 再使用酸性阳离子交换树脂吸附、 水洗， 氢氧化 钠调节pH至7.5-8.0， 得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粗品水溶液； 5)粗品精制： 向N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粗品水溶液中加入1.5倍重量的水， 加药用 炭升温至40-45， 脱色1-1.2小时， 使

6、用精密过滤器进行过滤， 滤液加入甲醇析晶， 离心后 干燥粉碎， 得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精品。 2.根据权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于： 步骤1) 中L-丙氨酸、 邻苯二甲酸酐的质量比为10:16-18。 3.根据权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于： 步骤1) 中的反应温度为140-150。 4.根据权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于： 步骤2) 中N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸与甲苯溶剂的质量比为135:190-210。 5.根据权利要求1所述的N(2)-L-丙

7、氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于： 步骤3) 中肽基转移酶与溶液的体积比为1:30-35。 6.据权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于： 步骤3)中 使用的肽基转移酶酶采用吸附法对其进行固定， 同时用海藻酸钠壳聚糖对其进行包埋形成 微囊化固定化酶。 7.据权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其特征在于： 步骤3)中 的反应温度为40-45。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106701869 A 2 N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法 技术领域 0001 本发明属于药品的合成制备技术领域， 具体涉及一种N(

8、2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 的制备方法。 背景技术 0002 N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(俗称二肽)是一种氨基酸类药物,是肠外营养的一个 重要组成部分， 适用于需要补充谷氨酰胺的病人， 包括处于分解代谢和高代谢状况的病人。 谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸， 是生物体合成核酸、 蛋白质、 嘌呤、 嘧啶等的重要前体物 质， 也是蛋白质合成与分解的调节物。 但谷氨酰胺本身由于不稳定、 水溶性低而不能直接作 为药物， 将其转化为N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺能够充分发挥谷氨酰胺对人体的作用。 0003 目前市场上该种药物主要生产工艺为化学合成， 其中又分为氨解工艺和肼解工 艺， 氨解工艺

9、主要是使N-(2-氯)-丙酰基-谷氨酰胺与氨水进行反应， 然后通过加热浓缩、 调 酸、 电渗析除盐等工序得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺； 肼解工艺主要是邻苯二甲酰N(2)-L- 丙氨酰-L-谷氨酰胺在水合肼的作用下分解、 然后通过水溶解分离等工序的N(2)-L-丙氨 酰-L-谷氨酰胺。 上述两种工艺存在生产过程中存在污染气体、 产生固废等短板， 在国家环 保监管日趋严厉的情况下不利于大规模生产。 发明内容 0004 本发明提供了一种N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 其目的在于， 采用酶 法制备的工艺生产N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 其中包括N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰

10、氯合成 引入保护基， 酶促合成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺包括肽键合成、 脱保护基工序， 对N-邻苯 二甲酰-L-丙氨酸的制备的合成工序采用高温熔融的方法， 减少甲苯、 三乙胺、 盐酸等溶剂 的使用， 酶促合成工艺采用吸附法对肽基转移酶进行固定， 同时用海藻酸钠壳聚糖对肽基 转移酶进行包埋形成微囊化固定化酶， 并考察了改固定化酶的活性， 可以证明该固定化酶 通透性良好， 包埋后使用效率有了较大提升， 提高N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺收率、 降低生 产成本。 0005 本发明N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 采用酶法制备的工艺生产N(2)- L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，

11、具体步骤如下： 0006 1)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备： L-丙氨酸、 邻苯二甲酸酐加入反应釜中， 在高 温熔融状态下进行合成反应， 生成N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸； 0007 说明书 1/5 页 3 CN 106701869 A 3 0008 2)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯的制备： 以甲苯为溶剂， 投入N-邻苯二甲酰-L-丙氨 酸， 加入氯化亚砜， 进行升温至45-55， 回流1-1.2小时， 然后保温反应3-3.5小时， 再进行 减压蒸馏3-3.5小时， 真空抽带降温， 得到N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯； 0009 0010 3)酶促合成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺： 将步

12、骤2)制备的N-邻苯二甲酰-L-丙氨 酰氯投入水中， 用氢氧化钠调节pH至7.5-8.0， 投入谷氨酰胺， 将固定化肽基转移酶加入到 反应中， 过程中加入碳酸氢钠调节pH至7.5-8.0， 搅拌， 反应溶液经离心得N(2)-L-丙氨酰- L-谷氨酰胺溶液； 0011 0012 4)酶的灭活： 将收集到的上述N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液加入到甲醇溶剂 中， 析晶后离心得固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 再将固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 投入水中， 加热至55-65， 加入活性炭吸附过滤， 再使用酸性阳离子交换树脂吸附、 水洗， 氢氧化钠调节pH至7.5-8.0， 得到

13、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粗品水溶液； 0013 5)粗品精制： 向N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粗品水溶液中加入1.5倍重量的水， 加 药用炭升温至脱色1-1.2小时， 使用精密过滤器进行过滤， 滤液加入甲醇析晶， 离心后干燥 粉碎， 得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精品。 0014 步骤1)中L-丙氨酸、 邻苯二甲酸酐的质量比为10:16-18。 0015 步骤1)中的反应温度为140-150。 0016 步骤2)中N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸与甲苯溶剂的质量比为135:190-210。 0017 步骤3)中肽基转移酶与溶液的体积比为1:30-35。 0018 步骤3)中使用

14、的肽基转移酶酶采用吸附法对其进行固定， 同时用海藻酸钠壳聚糖 对其进行包埋形成微囊化固定化酶。 0019 步骤3)中的反应温度为40-45。 0020 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 本发明N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制 备方法， 采用酶法制备的工艺生产N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 其中包括N-邻苯二甲酰-L- 丙氨酰氯合成引入保护基， 酶促合成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺包括肽键合成、 脱保护基 工序， 对N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备的合成工序采用高温熔融的方法， 减少甲苯、 三乙 胺、 盐酸等溶剂的使用， 酶促合成工艺采用吸附法对肽基转移酶进行固定， 同时

15、用海藻酸钠 壳聚糖对肽基转移酶进行包埋形成微囊化固定化酶， 并考察了改固定化酶的活性， 可以证 明该固定化酶通透性良好， 包埋后使用效率有了较大提升， 提高N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰 说明书 2/5 页 4 CN 106701869 A 4 胺收率、 降低生产成本。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本领域专业人员做进一步 了解， 但并不因此限制本发明。 0022 实施例1 0023 本发明N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 采用酶法制备的工艺生产N(2)- L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 具体步骤如下： 0024 1)N-邻苯二甲酰-L-

16、丙氨酸的制备： 0025 打开排气， 向5000L反应釜中加入850kg邻苯二甲酸酐， 升温使反应温度140至熔 解， 开启搅拌， 投入500kgL-丙氨酸， 反应5.5小时， 生成N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸； 0026 2)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯的制备： 0027 分两次投料， 2000L反应釜中加入甲苯溶液1000kg， 投入N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸， 开启真空， 将氯化亚砜300kg加入2000L反应釜,进行升温至45， 回流1小时， 然后保温反应 3小时， 再进行减压蒸馏3小时， 真空抽带降温， 得到N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯甲苯溶液； 0028 3)酶促合成N(2)-L-丙

17、氨酰-L-谷氨酰胺： 0029 向3000L反应釜中加入900kg水， 用氢氧化钠调节pH至7.5， 降温至0， 将上述制备 的N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯投入水中， 投入谷氨酰胺600kg， 将处理后的固定化肽基转移 酶60L加入到反应中， 反应温度40， 过程中加入碳酸氢钠调节pH至7.5， 搅拌， 反应溶液经 离心的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液； 0030 4)酶的灭活： 0031 向3000L反应釜中加入甲醇1660kg， 将收集到的上述溶液加入到甲醇溶剂中， 降温 0， 析晶后离心得固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 再将固体丙氨酰丙氨酰胺投入水中， 加热至55， 加

18、入活性炭吸附过滤， 再使用酸性阳离子交换树脂吸附、 水洗， 氢氧化钠调节 pH至7.5； 0032 5)粗品精制： 0033 向2000L反应釜中投入收集到的上述N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液， 补充1.5 倍重量的水， 加药用炭升温40， 脱色1小时， 使用钛过滤器以及精密过滤器进行过滤转移 至D级洁净区的3000L反应釜； 向3000L反应釜中加入甲醇1600L,加药用炭升温40， 脱色1 小时,使用钛过滤器以及精密过滤器进行过滤转移至D级洁净区500L暂存罐， 滤液加入甲醇 进行析晶， 降温0离心， 使用热风循环烘箱干燥至恒重， 干燥温度50， 粉碎， 得N(2)-L-丙 氨酰

19、-L-谷氨酰胺精品。 0034 实施例2 0035 本发明N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 采用酶法制备的工艺生产N(2)- L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 具体步骤如下： 0036 1)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备： 0037 打开排气， 向5000L反应釜中加入850kg邻苯二甲酸酐， 升温使反应温度150至熔 解， 开启搅拌， 投入500kgL-丙氨酸， 反应6个小时， 生成N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸； 0038 2)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯的制备： 说明书 3/5 页 5 CN 106701869 A 5 0039 分两次投料， 2000L反应釜中加入甲苯溶液1000

20、kg， 投入N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸， 开启真空， 将氯化亚砜350kg加入2000L反应釜， 进行升温至55， 回流1小时， 然后保温反应 3.5小时， 再进行减压蒸馏3小时， 真空抽带降温， 得到N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯甲苯溶液； 0040 3)酶促合成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺： 0041 向3000L反应釜中加入900kg水， 用氢氧化钠调节pH至8.0， 降温至10， 将上述制 备的N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯投入水中， 投入投入谷氨酰胺600kg， 将处理后的固定化肽 基转移酶60L加入到反应中， 反应温度45， 过程中加入碳酸氢钠调节pH至8.0， 搅拌， 反应 溶

21、液经离心的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺； 0042 4)酶的灭活： 0043 向3000L反应釜中加入甲醇1660kg， 将收集到的上述溶液加入到甲醇溶剂中， 降温 10， 析晶后离心得固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 再将固体丙氨酰丙氨酰胺投入水中， 加热至65， 加入活性炭吸附过滤， 再使用酸性阳离子交换树脂吸附、 水洗， 氢氧化钠调节 pH至8.0； 0044 5)粗品精制： 0045 向2000L反应釜中投入收集到的上述N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液， 补充1.5 倍重量的水， 加药用炭升温45， 脱色1.2小时， 使用钛过滤器以及精密过滤器进行过滤转 移至D级

22、洁净区的3000L反应釜； 向3000L反应釜中加入无水乙醇1200L,加药用炭升温45， 脱色1.2小时,使用钛过滤器以及精密过滤器进行过滤转移至D级洁净区500L暂存罐， 滤液 加入无水乙醇进行析晶， 降温10离心， 使用热风循环烘箱干燥至恒重， 干燥温度60， 粉 碎， 得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精品。 0046 实施例3 0047 本发明N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法， 采用酶法制备的工艺生产N(2)- L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 具体步骤如下： 0048 1)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸的制备： 0049 打开排气， 向5000L反应釜中加入850kg邻苯二甲酸

23、酐， 升温使反应温度145至熔 解， 开启搅拌， 投入500kgL-丙氨酸， 反应5.8小时， 生成N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸； 0050 2)N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯的制备： 0051 分两次投料， 2000L反应釜中加入甲苯溶液1000kg， 投入N-邻苯二甲酰-L-丙氨酸， 开启真空将氯化亚砜330kg加入2000L反应釜,进行升温回流1.1小时， 反应温度控制在50 ， 然后保温反应3.3小时， 再进行减压蒸馏3.2小时， 真空抽带降温， 得到N-邻苯二甲酰-L- 丙氨酰氯甲苯溶液； 0052 3)酶促合成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺： 0053 向3000L反应釜中加入90

24、0kg水， 用氢氧化钠调节pH至7.8， 降温至5， 将上述制备 的N-邻苯二甲酰-L-丙氨酰氯投入水中， 投入谷氨酰胺600kg， 将处理后的固定化肽基转移 酶60L加入到反应中， 反应温度40-45， 过程中加入碳酸氢钠调节pH至7.8， 搅拌， 反应溶液 经离心的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺； 0054 4)酶的灭活： 0055 向3000L反应釜中加入甲醇1660kg， 将收集到的上述溶液加入到甲醇溶剂中， 降温 5， 析晶后离心得固体N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺， 再将固体丙氨酰丙氨酰胺投入水中， 说明书 4/5 页 6 CN 106701869 A 6 加热至60， 加

25、入活性炭吸附过滤， 再使用酸性阳离子交换树脂吸附、 水洗， 氢氧化钠调节 pH至7.8； 0056 5)粗品精制： 0057 向2000L反应釜中投入收集到的上述N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液， 补充1.5 倍重量的水， 加药用炭升温42， 脱色1小时， 使用钛过滤器以及精密过滤器进行过滤转移 至D级洁净区的3000L反应釜； 向3000L反应釜中加入甲醇1800L,加药用炭升温43， 脱色 1.1小时,使用钛过滤器以及精密过滤器进行过滤转移至D级洁净区500L暂存罐， 滤液加入 甲醇进行析晶， 降温5离心， 使用真空干燥箱进行干燥至恒重， 真空度0.06Mpa,干燥温度 70， 粉碎， 得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精品。 说明书 5/5 页 7 CN 106701869 A 7