科罗索酸的生物催化合成方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103725743 A (43)申请公布日 2014.04.16 CN 103725743 A (21)申请号 201410006092.4 (22)申请日 2014.01.06 C12P 33/02(2006.01) C12R 1/545(2006.01) (71)申请人 遵义医学院 地址 563003 贵州省遵义市大连路 201 号 (72)发明人 付少彬 孙迪安 孟庆峰 赵长阔 (74)专利代理机构 上海衡方知识产权代理有限 公司 31234 代理人 卞孜真 林珍玉 (54) 发明名称 科罗索酸的生物催化合成方法 (57) 摘要 本发明提供了一种科罗索酸的生物催

2、化合成 方法， 包括将底物乌苏酸和微生物酶催化剂在适 当培养基及适当的条件下共培养发酵， 经分离纯 化得到科罗索酸， 其中所述微生物酶催化剂为菌 株 Streptomyces griseus subsp.griseus ； 反应 式为 ：与目前 已公开的技术相比， 本发明方法采用的原料及催 化剂便宜、 易得， 反应条件温和、 易控， 环境友好、 无污染， 能很好地满足绿色化学和可持续发展化 学的发展， 及其对现代环境保护和低碳经济的需 求。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明

3、书4页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103725743 A CN 103725743 A 1/1 页 2 1. 一种科罗索酸的生物催化合成方法， 包括将底物乌苏酸和微生物酶催化剂在适当培 养基及适当的条件下共培养发酵， 经分离纯化得到科罗索酸， 其中所述微生物酶催化剂为 菌株 Streptomyces griseus subsp.griseus ； 反应式为 ： 2. 如权利要求 1 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述菌株 Streptomyces griseus subsp.griseus 在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为 CGMCC4.18。 3.如权利要求1所述

4、生物催化合成方法， 其特征在于， 所述适当培养基选自YM培养基。 4. 如权利要求 3 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述 YM 培养基通过以下步骤 制得 ： 按照 1000mL 算， 加酵母提取物 3.0-6.0g， 优选 4.0g ； 麦芽提取物 5.0-20.0g， 优选 10.0g ； 葡萄糖 4.0-10.0g， 优选 4.0g ； 调节 pH6.5-8.0， 优选 7.3 ； 在 1215， 高温灭菌 20-30min。 5. 如权利要求 1 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 溶解所述底物的溶剂为 ： 无水乙 醇、 丙酮、 甲醇、 DMSO， 以及混合溶剂 ； 优选体积

5、比为 1:1 的无水乙醇 ： 二甲亚砜混合溶剂。 6. 如权利要求 1 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述微生物菌株培养及催化反 应温度为 25-37， 优选 28。 7.如权利要求1所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述底物浓度0.2-5mg/mL， 优选 0.5-1.5mg/mL。 8. 如权利要求 1 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述发酵时间 5-10 天。 9. 如权利要求 1 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述发酵规模为 5mL 至 2000mL。 10. 如权利要求 1 所述生物催化合成方法， 其特征在于， 所述分离纯化选自硅胶柱色 谱、 凝胶色谱及重

6、结晶中的一种或多种结合。 权 利 要 求 书 CN 103725743 A 2 1/4 页 3 科罗索酸的生物催化合成方法 技术领域 0001 本发明属于制药领域， 涉及科罗索酸(Corosolic acid， CAS No.为4547-24-4)的 生物催化合成方法 ； 科罗索酸为一种降血糖药物。 背景技术 0002 糖尿病是全球前五大致死疾病， IMS 预计未来 10-20 年糖尿病患病人数将居所有 疾病之首， 尤其是亚洲地区， 糖尿病患者人数和复合增速将快速上升。 来自最新的全球糖尿 病患病报告显示， 2011 年， 全球糖尿病患者达到 3.66 亿人， 预计 2030 将达到 5.52

7、 亿人。更 令人担忧的是， 我国近十年来糖尿病患病率增长迅猛， 患病人数逼近 1 亿大关。IMS 预测到 2020 年中国糖尿病患者人数将高达 1.5 亿， 为全球糖尿病患者最多的国家， 糖尿病及其并 发症正在给社会带来沉重负担。2010 年全球糖尿病药物市场规模高达 344.3 亿， 近五年复 合增长率为 12.7%， 显著高于其他疾病用药市场同期增速。 0003 科罗索酸 (corosolic acid) 是存在于大叶紫薇、 枇杷、 对萼猕猴桃等植物中的一 种三萜类天然产物。 研究发现， 科罗索酸具有抗炎、 降血糖、 降血脂和抗癌等多种生物活性， 其中， 人们最为关注的是科罗索酸的降血糖的

8、功能。 体内外实验结果表明， 科罗索酸通过增 加葡萄糖的转运， 促进细胞对葡萄糖的吸收和利用， 从而实现降血糖功效。 科罗索酸对葡萄 糖转运的增加作用类似于胰岛素， 因此， 科罗索酸也被称为 “植物胰岛素” (phyto-insulin 或 botanical insulin)。据报道， 科罗索酸对正常大鼠和遗传性糖尿病小鼠均有显著的降 血糖作用。科罗索酸还有减肥作用， 临床研究发现服用该药后能够调节体内胰岛素和血糖 含量， 具有明显的减肥趋势 ( 月平均减重 0.908-1.816kg)， 该过程比较缓且无需节食。目 前， 该天然产物已在美国作为营养补充剂上市， 同时进行治疗糖尿病的三期临床

9、试验， 近期 将通过 FDA 认证。其用于治疗糖尿病的作用效果与注射胰岛素相比较， 具有口服效果显著、 毒副作用小、 使用方便等优点， 作用效果与注射胰岛素相当。 科罗索酸作为纯天然植物活性 成分， 既可以作为降血糖保健品， 也可作为降血糖药物对抗糖尿病和肥胖症进行治疗。 0004 目前科罗索酸的制备方法主要有以下几种 ： 一种是从植物中提取， 由于科罗索酸 在植物中的含量很低， 含量最高的当属大叶紫薇叶子， 其热水浓缩提取物中， 科罗索酸的含 量仅为 0.01% 左右， 而在大叶紫薇叶子的醇提取的浓缩物中， 科罗索酸的含量也仅为 1% 左 右。 美国研究学者通过改进方法从植物大叶紫薇叶子和枇

10、杷叶子中分别制备了科罗索酸并 分别申请了专利。 在植物体内， 科罗索酸常常与其同分异构体山楂酸共同存在， 二者的结构 和化学性质均相似， 所以给分离、 纯化带来很大困难。 这也是从植物中提取科罗索酸不能满 足当前市场和研究需要的主要原因。第二种方法是用有机合成方法来合成科罗索酸。孙宏 斌等采用化学法合成了科罗索酸。将3- 羰基熊果酸酯经硫酸、 浓盐酸、 磷酸、 高氯酸等酸催 化的烯醇化酯化反应制得 2- 烯 -3- 乙酰氧基熊果酸酯， 将 2- 烯 -3- 乙酰氧基熊果酸酯经 硼氢化氧化反应分别制得科罗索酸酯 ； 科罗索酸酯经催化氢解反应或采用碘化锂进行卤解 反应分别制得科罗索酸。 可见化学合

11、成方法步骤比较繁琐， 条件苛刻， 所以限制了化学合成 法的广泛应用。 此外， 2012年Kim等人还首次利用植物细胞的悬浮培养物来制备科罗索酸。 说 明 书 CN 103725743 A 3 2/4 页 4 相对于从植物中提取和化学合成法， 此方法相对简单， 但是该方法的产率低、 产量不稳定， 筛选并确立植物悬浮细胞系是一项非常费时的过程， 这些都限制了此方法的进一步推广。 0005 然而， 科罗索酸作为防治型糖尿病和肥胖症的植物新药和功能性天然保健食品 医药原料， 已经成为市场的热门产品， 产品供不应求。 但是目前的制备方法都因为其方法本 身的缺点限制了其进一步推广和应用。 因此， 探索科罗

12、索酸的高效、 经济的合成新方法是一 个凾待解决的关键科学问题， 寻求科罗索酸的高效、 经济的制备方法迫在眉睫。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种新型、 经济、 简便、 符合绿色化生产科罗索酸的生物催化 合成方法。 0007 基于以上目的， 本发明选择自然界廉价、 易得的天然产物乌苏酸(又称熊果酸)为 底物， 采用条件温和、 环境友好、 立体选择性和区域选择性都很强的微生物酶为催化剂， 采 用生物催化方法只需一步反应即可制备科罗索酸。 0008 一方面， 本发明提供了一种科罗索酸的生物催化合成方法， 包括将乌苏酸和微生 物酶催化剂在适当培养基及适当的条件下共培养发酵， 经分离纯化得到科

13、罗索酸， 其中所 述微生物酶催化剂为菌株 Streptomyces griseus subsp.griseus ； 反应式为 ： 0009 0010 一种实施方式中， 所述菌株Streptomyces griseus subsp.griseus在中国普通微 生物菌种保藏管理中心的保藏号为 CGMCC4.18。 0011 一种实施方式中， 所述适当培养基选自 YM 培养基。所述 YM 培养基通过以下步骤 制得 ： 按照 1000mL 算， 加酵母提取物 3.0-6.0g， 优选 4.0g ； 麦芽提取物 5.0-20.0g， 优选 10.0g ； 葡萄糖 4.0-10.0g， 优选 4.0g ；

14、 调节 pH6.5-8.0， 优选 7.3 ； 在 1215， 高温灭菌 20-30min。 一种实施方式中， 溶解所述底物的溶剂为 ： 无水乙醇、 丙酮、 甲醇、 DMSO， 以及混合 溶剂 ； 优选体积比为 1:1 的无水乙醇 ： 二甲亚砜混合溶剂。 0012 一种实施方式中， 所述微生物菌株培养及催化反应温度为 25-37， 优选 28。 0013 一种实施方式中， 所述底物浓度 0.2-5mg/mL， 优选 0.5-1.5mg/mL。 0014 一种实施方式中， 所述发酵时间 5-10 天， 优选 7 天。 0015 一种实施方式中， 所述发酵规模为 5mL 至 2000mL。 001

15、6 一种实施方式中， 所述分离纯化选自硅胶柱色谱、 凝胶色谱及重结晶中的一种或 多种结合。 0017 与目前已公开的技术相比， 本发明的制备新方法通过氧化化合物乌苏酸， 一步法 制备目标化合物科罗索酸， 优点在于 ： (1) 选用廉价易得的天然产物乌苏酸为原料， 一步催 说 明 书 CN 103725743 A 4 3/4 页 5 化反应即可合成科罗索酸， 两者价格相差达数千倍 ； (2) 选择微生物酶为催化剂， 其三维立 体构型增加反应的区域选择性和立体选择性， 具有高度的专一性， 而且酶本身是生物体的 组成部分， 所以催化反应的条件比较温和， 通过不需要化学反应的高温、 高压以及特殊试剂

16、等条件。通过化学反应在饱和碳原子上进行羟基化反应很难， 但是在生物催化中却是很常 见的反应。 (3)环境友好， 因为反应过程无需有毒试剂、 有毒药品， 所以符合当今绿色化学的 生产需求。综述所述， 该方法采用的原料及催化剂便宜、 易得， 反应条件温和、 易控， 环境友 好、 无污染， 能很好地满足绿色化学和可持续发展化学的发展， 及其对现代环境保护和低碳 经济的需求。 附图说明 0018 图 1 显示为本发明制备得到的科罗索酸的 1H-NMR 谱。 0019 图 2 显示为本发明制备得到的科罗索酸的 13C-NMR 谱。 0020 图 3 显示为本发明制备得到的科罗索酸的 HMQC 谱。 00

17、21 图 4 显示为本发明制备得到的科罗索酸的 HMBC 谱。 0022 以下实施例仅仅是为了进一步阐明本发明， 并无将本发明局限于该具体实施例的 意图。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下， 对上述实施例进行修 饰或改变。本领域技术人员应该认识到， 本发明涵盖了权利要求书范围内的所有可能的备 选方案、 改进方案和等效方案。 具体实施方式 0023 原料及催化剂 0024 底物乌苏酸购自湖南长沙上禾天然产物提取物有限公司， 纯度 98%， 测定其 NMR， 与通过文献对比其 1H-NMR 和13C-NMR 确定其结构。 0025 微生物催化剂 Streptomyces.gris

18、eus subsp.griseus CGMCC4.18 从中国普通微 生物菌种保藏管理中心购买。 0026 0027 首先将菌株 Streptomyces.griseus subsp.griseus CGMCC4.18 在斜面培养基上 活化几代， 使处于低活力的菌株恢复活力。 0028 科罗索酸的放大发酵培养采用两步发酵法， 首先挑取活化好的斜面菌株接种于 100mL 三角瓶中 （内装 40mL 液体培养基） 在 28， 140rpm 条件下震荡培养 2-3 天， 制成种子 培养液， 再以 2%（体积） 的接种量接入放大培养基， 1000mL 三角瓶中 （内装 400mL 液体培养 基） ，

19、同样条件下培养 2-3 天后， 加入底物 600mg(DMSO ： 乙醇 =1:1 溶解 )， 7 天后用乙酸乙酯 萃取培养液， 减压蒸干得到粗提物 830mg。 说 明 书 CN 103725743 A 5 4/4 页 6 0029 将粗提物过 300-400 目的硅胶 20g， 经石油醚 - 丙酮 - 冰醋酸梯度洗脱剂， 流动相 比例从 100:2:0.1 至纯丙酮， 得到 3 个组分， 组分 A(23mg)， 组分 B(14mg) 组分 C(29mg)。组 分 A 继续用 300-400 目硅胶和纯化， 洗脱溶剂为三氯甲烷 ： 丙酮 =9:1 至 1:1， 再过 Sephadex LH-

20、20( 洗脱系统为三氯甲烷 ： 甲醇 =1:1) 后， 用丙酮 / 石油醚的混合溶剂重结晶得到化合 物科罗索酸 (6mg)， 为白色固体。产物经质谱、 1H-NMR 和13C-NMR 确定结构。质谱 ESI-MS 数 据 M-H-： 471。 0030 0031 13C-NMR(125MHz， pyridine-d 5) ： C28-180.2， C13-139.7， C3-84.2， C2-69.0， C5-56.3， C18-53.9， C17-48.5， C9-48.4， C1-48.4， C14-42.9， C8-40.4， C4-40.2， C19-39.9， C20-39.8， C

21、10-38.8， C22-37.8， C7-33.9， C21-31.5， C23-29.7， C15-29.0， C16-25.3， C27-24.3， C11-24.1， C30-21.8， C6-19.2， C24-18.1， C26-17.9， C29-17.9， C25-17.4。 0032 主要的 1H-NMR(600MHz，pyridine-d5) ： 5.49(H-12,t-like)， 3.42(H-3,d,J=9.6Hz)， 4.11(H-2,td,J=4.2,10.2Hz)， 2.65(H-18,d,J=11.4Hz)， 2.26(H-1,dd)， 1.28(H-1,o)， 1.33(H-23,s)， 1.29(H-27,s)， 0.97(H-30,d,J=6.6Hz)， 1.23(H-24,s)， 1.09(H-26,s),1.01(H-29,d,J=6.6Hz),1.07(H-25,s)。 说 明 书 CN 103725743 A 6 1/4 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103725743 A 7 2/4 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 103725743 A 8 3/4 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103725743 A 9 4/4 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 103725743 A 10