磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410420380.4 (22)申请日 2014.08.25 C12N 11/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) (71)申请人 姜丹宁 地址 110179 辽宁省沈阳市浑南新区学成路 2 号雍熙金园 F0511 (72)发明人 姜丹宁 (54) 发明名称 磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化 载体 (57) 摘要 磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化 载体。本发明以戊二醛为交联剂制备了磁性壳聚 糖微球 , 并对其形貌和结构分别进行了观察和分 析 , 其具有较好的球形形貌 , 表面平滑 , 单分散 性

2、较好 , 粒径分布范围窄 , 平均粒径为 019m。 以磁性壳聚糖微球为载体固定漆酶。固定化漆 酶最适温度分别为 10 和 55 , 均比游离酶降 低 5 , 最适 pH 值为 3102。在 60条件下保温 210min,固定化酶保留酶活力74%,而在相同条件 下游离酶酶活力仅保留 1914%。固定化酶连续进 行10次操作后,酶活力仍保持80%以上,漆酶使 用效率明显提高 , 且该固定漆酶具有良好的存储 稳定性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 CN 105462953 A 2016.04.06 CN 1

3、05462953 A 1/1 页 2 1. 磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 磁性壳聚糖微球的制备 ; 取 5 mL 磁流体与 20 mL 215% 的壳聚糖乙酸溶液混合 , 在搅拌下缓慢加入到 80 mL 液体石蜡和 4 mL Span280 的混合溶剂中 , 常温下充分搅拌 30 min, 加入 10 mL 8% 的戊二醛 , 在 40 的水浴中反应 60 min 后 , 用 1 mol/L 的 NaOH 溶 液将其 pH 值调至 9 10, 于 70 水浴继续反应 2 h, 得到产物用磁铁收集 , 再依次用石 油醚 , 丙酮 , 蒸馏水充分

4、洗涤 , 抽滤 , 60 真空干燥 , 得到磁性壳聚糖微球 ； （2） 漆酶的固定化 ; 取50 mg 磁性壳聚糖微球 , 加入 5 mL 116 10- 3 g/mL 的漆 酶磷酸盐缓冲液 (011 mol/L, pH = 7) , 25 缓慢搅拌 1 h, 在 4 静置 2 h, 倒掉上清 液 , 用 pH = 7 磷酸盐缓冲液反复洗涤 , 抽滤 , 得到的固定化酶在 4 下保存 ； （3） 酶活力测定 ; 游离漆酶活力的测定 : 取 3 mL 含 0105 mmol/L ABTS 的酒石酸缓冲 液中加入 8L 适当稀释的酶液 , 在 55 用紫外可见分光光度计测定反应体系 5 min 内

5、 420 nm 处的吸光度变化 , 求出反应初速度 ； 固定化漆酶活力的测定 : 3 mL 含 0105 mmol/ L ABTS 的酒石酸缓冲液中加入 20 mg 固定化酶 , 在 55用紫外可见分光光度计测定反应 体系 5 min 内 420 nm 处的吸光度变化 , 求出反应初速度 ； ABTS 消光系数为 = 36 000 L / (molcm) , 将每分钟氧化 1molABTS 的酶量定义为 1 个酶活力单位。 权 利 要 求 书 CN 105462953 A 2 1/2 页 3 磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体 技术领域 0001 本发明应用在废水处理、 造纸、 芳香化

6、合物转化、 环境监测、 生物传感器构建等方 面， 具体地是涉及磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体。 背景技术 0002 漆酶是一类含铜的多酚氧化酶 (Laccase, p2diphenoloxidase, E. C. 1. 10. 3. 2) , 可分为真菌漆酶和漆树漆酶两大类。由于漆酶具有较好的底物专一性和稳定性 , 在废水处理、 造纸、 芳香化合物转化、 环境监测、 生物传感器构建等方面具有重要应用价值。 但游离漆酶在使用过程中易随环境的变化变性失活 , 且不易从反应体系中分离达到重复 使用的目的 , 在一定程度上限制了漆酶的工业化应用。酶固定化技术是实现酶重复连续使 用和改善稳定

7、性的有效手段。 0003 目前对漆酶所使用的固定化载体主要有特制的多孔性玻璃 , 环氧乙烷丙烯酸颗 粒和亲水性微滤膜等 , 但未见到用磁性壳聚糖微球为载体来固定漆酶的报道。以壳聚糖 (Chitosan,21, 4222 氨基葡萄糖 ) 作为固定化酶的载体具有良好的机械性能、 化学稳定 性、 耐热性能以及使酶免受金属离子干扰等优点。用壳聚糖微球固定L 2 天门冬酰胺酶 , 固定化酶的活力回收率较高 , 且稳定性得到提高 ; 用壳聚糖膜固定脲酶 , 显现出良好的操 作稳定性;将过氧化物酶固定在壳聚糖微球上,可用于微量H2O2 的荧光检测,并且该固定 化酶具有很好的重复使用性。 0004 以戊二醛为

8、交联剂,利用反相悬浮法制备磁性壳聚糖微球,以其为载体固定化血 红密孔菌漆酶 , 研究了固定化漆酶的性质。在提高固定化漆酶稳定性的同时 , 还具有易分 离,可连续重复使用和提高固定化酶催化效率等优点,可以实现生产工艺和检验操作的连 续化和工业化。 基于漆酶催化的耗氧型光纤生物传感器在临床医学检测和早期疾病诊断等 方面具有十分重要的应用前景 , 使用该固定化漆酶可望提高这类传感器的性能。 发明内容 0005 本发明就是针对上述问题， 提出磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载 体。 0006 为实现本发明的上述目的， 本发明采用如下技术方案。 0007 磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体

9、包括如下步骤 ： （1） 磁性壳聚糖微球的制备 ; 取 5 mL 磁流体与 20 mL 215% 的壳聚糖乙酸溶液混合 , 在搅拌下缓慢加入到 80 mL 液体石蜡和 4 mL Span280 的混合溶剂中 , 常温下充分搅拌 30 min, 加入 10 mL 8% 的戊二醛 , 在 40 的水浴中反应 60 min 后 , 用 1 mol/L 的 NaOH 溶 液将其 pH 值调至 9 10, 于 70 水浴继续反应 2 h, 得到产物用磁铁收集 , 再依次用石 油醚 , 丙酮 , 蒸馏水充分洗涤 , 抽滤 , 60 真空干燥 , 得到磁性壳聚糖微球。 0008 （2） 漆酶的固定化 ; 取

10、50 mg 磁性壳聚糖微球 , 加入 5 mL 116 10- 3 g/mL 的漆酶磷酸盐缓冲液 (011 mol/L, pH = 7) , 25 缓慢搅拌 1 h, 在 4 静置 2 h, 倒掉 说 明 书 CN 105462953 A 3 2/2 页 4 上清液 , 用 pH = 7 磷酸盐缓冲液反复洗涤 , 抽滤 , 得到的固定化酶在 4 下保存。 0009 （3） 酶活力测定 ; 游离漆酶活力的测定 : 取 3 mL 含 0105 mmol/L ABTS 的酒石酸 缓冲液中加入 8L 适当稀释的酶液 , 在 55 用紫外可见分光光度计测定反应体系 5 min 内420 nm处的吸光度变

11、化,求出反应初速度 ； 固定化漆酶活力的测定: 3 mL含0105 mmol/ L ABTS 的酒石酸缓冲液中加入 20 mg 固定化酶 , 在 55用紫外可见分光光度计测定反应 体系 5 min 内 420 nm 处的吸光度变化 , 求出反应初速度 ； ABTS 消光系数为 = 36 000 L / (molcm) , 将每分钟氧化 1molABTS 的酶量定义为 1 个酶活力单位。 0010 本发明的有益效果是。 0011 本发明以戊二醛为交联剂制备了磁性壳聚糖微球 , 并对其形貌和结构分别进行 了观察和分析 , 结果表明 , 其具有较好的球形形貌 , 表面平滑 , 单分散性较好 , 粒径

12、分布 范围窄 , 平均粒径为 019m。以磁性壳聚糖微球为载体固定漆酶。固定化漆酶最适温度 分别为 10 和 55 , 均比游离酶降低 5 , 最适 pH 值为 3102。在 60 条件下保温 210 min, 固定化酶保留酶活力 74% , 而在相同条件下游离酶酶活力仅保留 1914%。固定化酶连 续进行 10 次操作后 , 酶活力仍保持 80% 以上 , 漆酶使用效率明显提高 , 且该固定漆酶具 有良好的存储稳定性。 附图说明 0012 图 1 是本发明磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体的磁流体 （a） 、 壳 聚糖 (b) 与磁性壳聚糖微球 (c) 的红外光谱图。 具体实施方式

13、0013 磁性壳聚糖微球的制备及其用作漆酶固定化载体包括如下步骤 ： （1） 磁性壳聚糖微球的制备 ; 取 5 mL 磁流体与 20 mL 215% 的壳聚糖乙酸溶液混合 , 在搅拌下缓慢加入到 80 mL 液体石蜡和 4 mL Span280 的混合溶剂中 , 常温下充分搅拌 30 min, 加入 10 mL 8% 的戊二醛 , 在 40 的水浴中反应 60 min 后 , 用 1 mol/L 的 NaOH 溶 液将其 pH 值调至 9 10, 于 70 水浴继续反应 2 h, 得到产物用磁铁收集 , 再依次用石 油醚 , 丙酮 , 蒸馏水充分洗涤 , 抽滤 , 60 真空干燥 , 得到磁性

14、壳聚糖微球。 0014 （2） 漆酶的固定化 ; 取50 mg 磁性壳聚糖微球 , 加入 5 mL 116 10- 3 g/mL 的漆酶磷酸盐缓冲液 (011 mol/L, pH = 7) , 25 缓慢搅拌 1 h, 在 4 静置 2 h, 倒掉 上清液 , 用 pH = 7 磷酸盐缓冲液反复洗涤 , 抽滤 , 得到的固定化酶在 4 下保存。 0015 （3） 酶活力测定 ; 游离漆酶活力的测定 : 取 3 mL 含 0105 mmol/L ABTS 的酒石酸 缓冲液中加入 8L 适当稀释的酶液 , 在 55 用紫外可见分光光度计测定反应体系 5 min 内420 nm处的吸光度变化,求出反应初速度 ； 固定化漆酶活力的测定: 3 mL含0105 mmol/ L ABTS 的酒石酸缓冲液中加入 20 mg 固定化酶 , 在 55用紫外可见分光光度计测定反应 体系 5 min 内 420 nm 处的吸光度变化 , 求出反应初速度 ； ABTS 消光系数为 = 36 000 L / (molcm) , 将每分钟氧化 1molABTS 的酶量定义为 1 个酶活力单位。 说 明 书 CN 105462953 A 4 1/1 页 5 图 1 说 明 书 附 图 CN 105462953 A 5