一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710317289.3 (22)申请日 2017.05.08 (71)申请人 湖北省农业科学院粮食作物研究所 地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖大 道3号 (72)发明人 刘易科高春保朱展望邹娟 佟汉文陈泠张宇庆 (74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务 所(普通合伙) 32231 代理人 高姗 (51)Int.Cl. C12Q 1/18(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法 (57)摘要

2、 一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 包 括： 一、 禾谷镰刀菌孢子悬液的制备； 二、 小麦种 室温下萌发至胚芽鞘长度为1.41.6cm； 三、 将 胚芽鞘顶端剪去2mm4mm， 取禾谷镰刀菌孢子悬 液24L， 接种于胚芽鞘伤口处； 四、 在光照培 养箱里培养7天， 测量胚芽鞘病斑长度。 本发明培 养条件简单； 小麦镰刀菌茎腐病接种简单快速， 由于胚芽鞘伤口的存在， 吸收更快， 可在较短的 时间内鉴定出小麦镰刀菌茎腐病的抗性水平， 且 不需要昂贵的仪器设备； 可一次大量重复， 而且 统计方法准确度高， 实验成本低， 省工省力， 对小 麦品种的镰刀菌茎腐病抗性鉴定效果好， 适于推 广应用。 权

3、利要求书1页 说明书3页 CN 108220385 A 2018.06.29 CN 108220385 A 1.一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 一、 禾谷镰刀菌孢子悬液的制备； 二、 将灭菌后的小麦种室温下萌发至胚芽鞘长度为1.41.6cm； 三、 将胚芽鞘顶端剪去2mm4mm， 取禾谷镰刀菌孢子悬液24 L， 接种于胚芽鞘伤口 处， 每个基因型重复接种1525株， 重复三次； 四、 在光照培养箱里培养7天， 测量胚芽鞘病斑长度， 以三次试验所有参试植株的平均 病斑长度作为该品种的抗病性量化指标。 2.如权利要求1所述的快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 其特

4、征在于， 所述的禾谷镰 刀菌孢子悬液的浓度为1*5105个/mL。 3.如权利要求2所述的快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 其特征在于， 所述的禾谷镰 刀菌孢子悬液的制备方法， 包括以下步骤： (1)禾谷镰刀菌的活化取出于-20保存的禾谷镰刀菌菌株， 接种于PDA平板， 于28， 黑暗条件下培养3天； (2)孢子的培养挑取活化的菌丝， 接种于GGH液体培养基， 于光照条件下， 28培养5天 7天， 产生分生孢子； (3)孢子的收集用无菌纱布滤去菌丝， 收集菌液于无菌三角瓶,5000r/min离心5min收 集菌体， 加入无菌水， 用血球计数板调节孢子浓度至5105个/mL； (4)孢子的保存将

5、孢子分装至1.5mL离心管， 在-20保存备用。 4.如权利要求1所述的快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 其特征在于， 所述步骤二中 小麦种灭菌的方法为： 先用70乙醇冲洗1min； 无菌水快速冲洗后， 用0.1质量分数的 HgCl2消毒5min8min； 无菌水冲洗34次， 直到去除HgCl2污染。 5.如权利要求1或4所述的快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 其特征在于， 所述步骤 二中小麦种室温下萌发时将小麦种子背部朝上， 均匀地放置于铺有湿润滤纸的塑料盒内， 于室温条件下萌发25天。 6.如权利要求1所述的快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 其特征在于， 所述步骤四中 在26， 16h光照

6、， 99相对湿度的光照培养箱里培养。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108220385 A 2 一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法 技术领域 0001 本发明属于植物保护技术领域， 具体为一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法。 背景技术 0002 小麦赤霉病是由镰刀菌引起的一种世界范围内广泛流行的真菌病害。 近年来， 由 于全球气候变暖和耕作制度、 耕作方式的改变， 小麦赤霉病呈现逐年加重和大流行的趋势， 对农业生产构成严重威胁。 小麦赤霉病除发生在穗期造成穗腐(穗腐， wheat scab)外， 还可 以在苗期发病(茎腐病， crown rot)， 引起苗枯、 基腐等症状。 目前对小麦赤霉

7、病穗腐己经进 行了广泛深入的研究， 并取得了显著的成就， 但对由镰刀菌引起的小麦苗期病害的研究在 我国尚没有引起重视， 对茎腐病的研究较少,有关抗性鉴定方法以及评价标准的研究也比 较缺乏。 0003 在国外， 天o天man和Wil天ermuth于1987年建立了一种小麦赤霉病苗期抗性(茎腐 病)鉴定方法， Wil天ermuth和Mcnamara于1994年对这种方法进行了改进， 但这两种方法均 需要进行大田接种， 由于接种量多少不同、 大田残余病原菌、 田间湿度和温度等因素干扰， 经常造成田间鉴定结果的重复性较差。 Wallwork等(2004)、 Mitter等(2006)和Li等(2008

8、) 均提出了在温室中鉴定小麦苗期茎基腐病的方法， 这些方法效果较好,但存在工序复杂， 费 时费力， 而且试验误差较大。 我国科学家在前人的研究基础上对镰刀菌引起的小麦茎腐病 的鉴定方法也进行了研究， 发现 “棉球接种法” 抗感材料间病情指数差异明显， 可以作为小 麦茎腐病的抗性鉴定方法， 但这种方法存在着接种困难， 鉴定周期长的特点。 周淼平等 (2016)对采用荧光定量PCR方法测定基部茎秆的禾谷镰刀菌天NA含量并与其茎腐病平均病 级进行相关分析， 建立了基于荧光定量PCR抗性评价方法， 但这种方法存在对仪器设备要求 高， 后期鉴定费用高的特点。 0004 目前我国小麦赤霉病的发病面积不断扩

9、大， 危害程度日益加重， 这些因素为小麦 茎腐病的大面积发生创造了条件。 因此， 建立一种快速准确的小麦镰刀菌茎腐病鉴定方法 十分必要。 发明内容 0005 为解决现有技术存在的小麦赤霉病的鉴定周期长， 步骤烦琐的缺陷， 本发明提供 一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法。 0006 一种快速鉴定小麦镰刀菌茎腐病的方法， 包括以下步骤： 0007 一、 禾谷镰刀菌孢子悬液的制备； 0008 二、 将灭菌后的小麦种室温下萌发至胚芽鞘长度为1.41.6cm； 0009 三、 将胚芽鞘顶端剪去2mm4mm， 取禾谷镰刀菌孢子悬液24 L， 接种于胚芽鞘伤 口处， 每个基因型重复接种1525株， 重复三次

10、； 0010 四、 在光照培养箱里培养7天， 测量胚芽鞘病斑长度， 以三次试验所有参试植株的 平均病斑长度作为该品种的抗病性量化指标。 说明书 1/3 页 3 CN 108220385 A 3 0011 平均病斑长度越长， 说明该品种的小麦镰刀菌茎腐病抗性越差。 0012 进一步的， 所述的禾谷镰刀菌孢子悬液的浓度为1*5105个/m L。 0013 进一步的， 所述的禾谷镰刀菌孢子悬液的制备方法， 包括以下步骤： 0014 (1)禾谷镰刀菌的活化取出于-20保存的禾谷镰刀菌菌株， 接种于PDA平板， 于28 ， 黑暗条件下培养3天； 0015 (2)孢子的培养挑取活化的菌丝， 接种于GGH液

11、体培养基， 于光照条件下， 28培养 5天7天， 产生分生孢子； 0016 (3)孢子的收集用无菌纱布滤去菌丝， 收集菌液于无菌三角瓶。 5000r/min离心 5min收集菌体， 加入无菌水， 用血球计数板调节孢子浓度至5105个/mL； 0017 (4)孢子的保存将孢子分装至1.5mL离心管， 在-20保存(备用可保存一周)。 0018 进一步的， 步骤二中小麦种灭菌的方法为： 先用70乙醇冲洗1min； 无菌水快速冲 洗后， 用0.1质量分数的HgCl2消毒5min8min； 无菌水冲洗34次， 直到去除HgCl2污染。 0019 进一步的， 所述步骤二中小麦种室温下萌发时将小麦种子背部

12、朝上， 均匀地放置 于铺有湿润滤纸的塑料盒内， 于室温条件下萌发25天。 0020 进一步的， 所述步骤四中在26， 16h光照， 99相对湿度的光照培养箱里培养。 0021 有益效果： 本发明方法方便快捷， 培养条件简单， 仅需将接种后的小麦种子在光照 培养箱里培养7天， 而现有技术中通常需要培养35天左右； 本发明的小麦镰刀菌茎腐病接种 简单快速， 仅需使用棉球或吸管吸取24 L接种于胚芽鞘伤口处， 由于胚芽鞘伤口的存在， 吸收更快， 可在较短的时间内鉴定出小麦镰刀菌茎腐病的抗性水平， 且不需要昂贵的仪器 设备； 简单， 可一次大量重复， 而且统计方法准确度高， 实验成本低， 省工省力，

13、对小麦品种 的镰刀菌茎腐病抗性鉴定效果好， 适于推广应用。 具体实施方式 0022 实施例 0023 禾谷镰刀菌孢子的准备 0024 (1)禾谷镰刀菌的活化 0025 取出保存于-20保存的禾谷镰刀菌菌株黄冈一号， 接种于铃薯葡萄糖琼脂培养 基(PDA)平板， 在28培养箱， 黑暗条件下培养3d。 0026 (2)禾谷镰刀菌孢子的培养 0027 挑取活化的禾谷镰刀菌菌丝， 接种于绿豆汤液体培养基(GGH)， 于光照条件下， 28 培养5d7d， 产生分生孢子。 期间不时用镜检方法检测孢子的浓度。 0028 (3)孢子的收集 0029 当孢子在培养基中达到一定浓度时， 用无菌纱布滤去菌丝， 收集

14、菌液于无菌三角 瓶。 用50ml离心管5000r/min离心5min收集孢子， 孢子沉淀物用无菌水稀释， 用血球计数板 将孢子浓度至工作浓度5105个/mL。 0030 (4)孢子的保存 0031 将孢子分装至灭过菌的1.5mL离心管， 放-20冰箱保存备用(一般可保存一周， 超 过一周则需要重新制备孢子液)。 0032 2苗期接种与茎腐病接种鉴定 说明书 2/3 页 4 CN 108220385 A 4 0033 (1)成熟种子进行表面消毒 0034 取苏麦3号、 鄂麦325、 鄂麦577、 郑麦9023等10个品种的种子各30粒， 先用70乙醇 冲洗1min； 无菌水快速冲洗后， 用0.1

15、HgCl2消毒5min8min； 无菌水冲洗34次， 直到去 除HgCl2污染。 0035 (2)种子萌发 0036 灭菌后， 将小麦种子背部朝上， 均匀地放置于铺有湿润滤纸的塑料盒内， 于室温条 件下萌发3d。 0037 (3)接种 0038 将萌发一致的种子胚芽鞘(长度1.5cm左右， 不一致的直接淘汰)顶端剪去2mm 4mm(根据胚芽鞘的长度适当调整)， 取预先准备好镰刀菌孢子悬浮液(5105个/m L)3 L， 接种于胚芽鞘伤口处， 每个基因型每个重复接种约20株， 分三次试验重复。 0039 (4)培养与测量 0040 在26， 16h光照， 99相对湿度的光照培养箱里培养7d， 测

16、量胚芽鞘病斑长度， 以 三次试验所有参试植株的平均病斑长度作为该品种的抗病性量化指标， 病斑长度大于5mm 的为感病品种(S),病斑长度介于3-5mm为中感品种(MS)， 病斑长度介于介于1-3mm为中抗品 种(MR),病斑长度小于1mm为高抗品种(HR)。 0041 表1参试品种小麦镰刀菌茎腐病抗性评价 0042 小麦材料名称重复1(mm)重复2(mm)重复3(mm)平均(mm)抗性评价 鄂麦5771.11.31.41.3MR 苏麦3号11.511.412.311.7S 郑麦90235.44.33.34.3MS 鄂麦3253.54.95.34.6MS 鄂麦5802.12.32.42.3MR 鄂麦5261.61.81.91.8MR 安农845510.311.410.510.7S 杨麦112.83.43.13.1MS 杨麦15810.711.611.711.3S 中国春10.512.410.111.0S 0043 研究结果表明如表1所示， 本发明的抗病鉴定结果可重复性好， 在参试品种中苏麦 3号的抗茎腐病能力最差， 而鄂麦577的抗病性最强。 说明书 3/3 页 5 CN 108220385 A 5