一种提取黑芥子苷的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410571922.8 (22)申请日 2014.10.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104327132 A (43)申请公布日 2015.02.04 (73)专利权人 桂林莱茵生物科技股份有限公司 地址 541199 广西壮族自治区桂林市临桂 县西城南路秧塘工业园 (72)发明人 赵军杨文国李杰李元元 罗勇为黄华凤 (74)专利代理机构 桂林市持衡专利商标事务所 有限公司 45107 代理人 唐智芳 (51)Int.Cl. C07H 15/14(2

2、006.01) C07H 1/08(2006.01) 审查员 耿元硕 (54)发明名称 一种提取黑芥子苷的方法 (57)摘要 本发明公开了一种提取黑芥子苷的方法， 包 括以下步骤： 1)以十字花科芸苔属植物芥菜、 甘 蓝或西兰花为原料， 用乙醇提取， 获得提取液， 提 取液回收乙醇后离心， 收集上清液； 2)上清液用 混合溶剂进行萃取， 收集有机相， 然后减压回收 溶剂， 得到浓缩液； 所述的混合溶剂为选自乙酸 乙酯、 乙醚和石油醚中的一种与甲醇或丙酮以的 56： 1的体积比的组合； 3)浓缩液上阴离子交换 树脂柱层析， 先水洗树脂柱至流出液澄清， 然后 用碱液洗脱， 洗脱液浓缩， 干燥， 得

3、到纯度70 的黑芥子苷提取物。 本发明采用特殊配比的混合 溶剂对上清液进行萃取、 结合特定的700A或700B 阴离子交换树脂层析工艺， 可以获得纯度70 的黑芥子苷提取物。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 104327132 B 2017.03.15 CN 104327132 B 1.一种提取黑芥子苷的方法， 包括以下步骤： 1)以十字花科芸苔属植物芥菜、 甘蓝或西兰花为原料， 用乙醇提取， 获得提取液， 提取 液回收乙醇后离心， 收集上清液； 2)上清液用混合溶剂进行萃取， 收集有机相， 然后减压回收溶剂， 得到浓缩液； 所述的 混合溶剂为选自乙酸乙酯、 乙醚和石油醚中的一种与

4、甲醇或丙酮的组合， 其中乙酸乙酯、 乙 醚或石油醚中与甲醇或丙酮的体积比为56： 1； 3)取浓缩液上阴离子交换树脂柱层析， 先水洗树脂柱至流出液澄清， 然后用碱液洗脱， 收集碱液洗脱液， 浓缩， 干燥， 得到黑芥子苷含量70的黑芥子苷提取物； 其中， 所述的阴 离子交换树脂的型号为700A或700B， 所述的碱液为0.53w/w的氢氧化钠水溶液或0.5 3w/w的氢氧化钙水溶液。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 该方法还包括纯化步骤， 所述的纯化步骤 是取黑芥子苷提取物与选自甲醇、 乙醇、 丙酮和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合混合 均匀， 调节体系的pH45， 于低温条件下进

5、行放置结晶， 分离晶体， 干燥， 得到黑芥子苷含 量95的黑芥子苷产品。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于： 将体系置于04条件下进行放置结晶。 4.根据权利要求13中任一项所述的方法， 其特征在于： 提取用乙醇的浓度为50 80v/v。 5.根据权利要求13中任一项所述的方法， 其特征在于： 洗脱用的碱液的浓度为1 2w/w。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104327132 B 2 一种提取黑芥子苷的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物中活性成分的制备方法， 具体涉及一种提取黑芥子苷的方法。 背景技术 0002 已有的研究表明， 富含十字花科蔬菜的饮食， 如西兰花、 花椰

6、菜、 甘蓝、 芥菜等能减 小许多癌症的发病率。 目前一致认为， 十字花科植物的重要抗癌活性成分前体是硫代葡萄 糖苷(Glucosinolates)。 在天然植物中已发现120多种不同的硫代葡萄糖苷， 它们存在于11 个不同种属的双子叶被子植物中， 最重要的是十字花科， 所有的十字花科植物都能够合成 硫代葡萄糖苷。 硫代葡萄糖苷存在于这些植物的根、 茎、 叶和种子中， 但主要存在于种子中。 0003 黑芥子苷也称黑芥子甙(Sinigrin)是其中脂肪族硫代葡萄糖苷中研究得较多的 一种， 黑芥子苷的R基团是烯丙基， 因此黑芥子苷也叫烯丙基硫代葡萄糖苷。 本申请人之前 申请的公开号为CN102048

7、791A的发明专利公开了一种黑芥子甙提取物的制备方法， 它包括 以下步骤： 1)以十字花科芸苔属植物芥菜、 甘蓝或西兰花为原料用乙酸提取， 提取液离心， 得上清液； 2)向上清液中加入乙醇， 调节其中乙醇浓度为8085， 放置11.5小时， 离心， 收集二次离心液； 3)二次离心液浓缩至无醇味， 所得浓缩离心液过0.5 m的陶瓷膜， 透过液 浓缩至原料重量的23倍， 得浓缩透过液； 4)浓缩透过液进大孔树脂柱， 收集流出液， 用2 3倍树脂重量的水洗脱， 收集洗脱液， 合并流出液和洗脱液， 浓缩， 冷冻干燥， 即得黑芥子甙 提取物。 由该方法制得的产品中黑芥子甙含量为2040， 黑芥子甙的含量

8、较低， 而且低含 量的产品放置时间较长容易自身发生变化使含量降低， 而高含量的产品相对来说比较稳 定， 放置较长时间时含量基本没有变化。 现有技术中， 由于黑芥子苷本身的性质以及在提取 纯化过程中黑芥子苷容易被破坏(黑芥子苷是硫苷， 在酸碱中不稳定， 很容易分解或破坏， 同时在有其他金属离子(如铁， 锌， 铜等)存在情况， 也容易破坏， 温度对其的分解也有很大 程度的影响)导致很难分离纯化得到高含量的黑芥子苷。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是针对现有技术中的不足， 提供一种提取黑芥子苷的方 法。 采用该方法可以获得黑芥子苷含量70的黑芥子苷提取物。 0005 本发明所述的提取黑芥

9、子苷的方法， 包括以下步骤： 0006 1)以十字花科芸苔属植物芥菜、 甘蓝或西兰花为原料， 用乙醇提取， 获得提取液， 提取液回收乙醇后离心， 收集上清液； 0007 2)上清液用混合溶剂进行萃取， 收集有机相， 然后减压回收溶剂， 得到浓缩液； 所 述的混合溶剂为选自乙酸乙酯、 乙醚和石油醚中的一种与甲醇或丙酮的组合， 其中乙酸乙 酯、 乙醚或石油醚中与甲醇或丙酮的体积比为56： 1； 0008 3)取浓缩液上阴离子交换树脂柱层析， 先水洗树脂柱至流出液澄清， 然后用碱液 洗脱， 收集碱液洗脱液， 浓缩， 干燥， 得到黑芥子苷含量70的黑芥子苷提取物； 其中， 所 述的阴离子交换树脂的型号

10、为700A或700B， 所述的碱液为0.53w/w的氢氧化钠水溶液 说明书 1/4 页 3 CN 104327132 B 3 或0.53w/w的氢氧化钙水溶液。 0009 为了进一步提高所得产品的纯度， 本发明方法还可包括一纯化步骤， 所述的纯化 步骤是取黑芥子苷提取物与选自甲醇、 乙醇、 丙酮和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合 混合均匀， 调节体系的pH45， 于低温条件下进行放置结晶， 分离晶体， 干燥， 得到黑芥子 苷含量95的黑芥子苷产品。 0010 上述纯化步骤中， 优选是将体系置于04条件下进行放置结晶。 该纯化步骤中， 用于与黑芥子苷提取物混合的溶剂的用量通常为黑芥子苷重量的36

11、倍。 通常用盐酸、 硫 酸或冰醋酸来调节体系的pH值。 0011 上述技术方案的步骤1)中， 提取用乙醇的浓度为5080v/v， 优选为5060v/ v； 提取的方式与现有常用的提取方法相同， 优选采用回流提取， 提取的次数通常为13 次， 每次提取时的料液比通常为1g： 510g(当原料为干燥原料时)， 每次提取的时间通常为 13h； 优选选用芥菜种子、 甘蓝种子或西兰花花蕾或嫩芽。 0012 上述技术方案的步骤2)中， 每次萃取时， 萃取用的混合溶剂的用量与现有常规萃 取方式时相同， 优选的， 混合溶剂与上清液体积比为68： 1。 0013 上述技术方案的步骤3)中， 碱液洗脱时， 采用薄

12、层层析跟踪检测。 申请人在实验中 发现， 可以按下述标准进行洗脱液的收集： 当流出液有苦味时收集， 流出液无苦味时停止收 集。 该步骤中， 洗脱用的碱液的浓度优选为12w/w。 0014 与现有技术相比， 本发明采用上述特殊配比的的混合溶剂对回收乙醇并离心处理 的上清液进行萃取， 可以有效去除上清液中残余的杂质(如多糖、 蛋白质、 其它容易与有效 成分发生变化的组分)， 再结合特定的700A或700B阴离子交换树脂对除杂后的浓缩液层析， 可以获得黑芥子苷含量70(HPLC法)的黑芥子苷提取物； 进一步地， 在纯化操作后可以 获得纯度95(HPLC法)的黑芥子苷产品， 填补了目前市场上尚未有工业

13、化生产得到如此 高纯度产品的空白； 而且整个方法操作简单易控， 生产成本低。 附图说明 0015 图1为本发明实施例1制得产品的高效液相图谱； 0016 图2为本发明实施例5制得产品的高效液相图谱。 具体实施方式 0017 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但 本发明并不限于以下实施例。 0018 实施例1 0019 1)取干燥的芥菜种子100kg(黑芥子苷含量为3.3， HPLC法， 下同)， 粉碎， 用相当 于原料重量8倍、 50v/v的乙醇回流提取2h， 过滤， 残渣再用相当于原料重量10倍、 50v/v 的乙醇回流提取1.5h， 过滤， 合并提取液，

14、所得提取液减压回收乙醇后离心， 收集上清液； 0020 2)上清液用混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)萃取2次， 合并收集有机相 (上层溶液)， 然后减压回收溶剂， 得到浓缩液(6波美)； 0021 3)取浓缩液上700B型阴离子交换树脂柱层析， 先水洗树脂柱至流出液澄清且无 色， 然后用1.5w/w的氢氧化钠水溶液洗脱， 薄层层析跟踪检测， 收集含目标成分的碱液洗 说明书 2/4 页 4 CN 104327132 B 4 脱液， 减压浓缩， 干燥， 得到黑芥子苷提取物4.00kg。 0022 取本实施例所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯度为74.50(HPLC法， 下同， 图谱 如图

15、1所示)， 原料黑芥子苷回收率为90.30。 0023 对比例1 0024 重复实施例1， 不同的是， 在步骤3)中， 用717#阴离子交换树脂代替700B型阴离子 交换树脂。 0025 由本对比例制得黑芥子苷提取物4.10kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为41.50， 原料黑芥子苷回收率为51.56。 0026 对比例2 0027 重复实施例1， 不同的是， 在步骤3)中， 用731型阴离子交换树脂代替700B型阴离子 交换树脂。 0028 由本对比例制得黑芥子苷提取物3.95kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为40.5， 原料黑芥子苷回收率为48.48。 00

16、29 对比例3 0030 重复实施例1， 不同的是， 在步骤3)中， 用D941型阴离子交换树脂代替700B型阴离 子交换树脂。 0031 由本对比例制得黑芥子苷提取物3.98kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为39.5， 原料黑芥子苷回收率为47.64。 0032 对比例4 0033 重复实施例1， 不同的是， 在步骤2)中， 用单独的乙酸乙酯替代原来的混合溶剂(乙 酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)。 0034 由本对比例制得黑芥子苷提取物4.20kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为58.55， 原料黑芥子苷回收率为74.52。 0035 对比例5 0036 重复实

17、施例1， 不同的是， 在步骤2)中， 用单独的丙酮替代原来的混合溶剂(乙酸乙 酯的甲醇的体积比为5:1)。 0037 由本对比例制得黑芥子苷提取物4.15kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为55.85， 原料黑芥子苷回收率为70.24。 0038 对比例6 0039 重复实施例1， 不同的是， 在步骤2)中， 用单独的乙醚替代原来的混合溶剂(乙酸乙 酯的甲醇的体积比为5:1)。 0040 由本对比例制得黑芥子苷提取物4.35kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为56.60， 原料黑芥子苷回收率为74.61。 0041 实施例2 0042 重复实施例1， 不同的是， 在

18、步骤2)中， 用体积比为1： 3的石油醚与丙酮的组合替代 原来的混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)。 0043 由本实施例制得黑芥子苷提取物4.10kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为72.50， 原料黑芥子苷回收率为90.08。 0044 实施例3 说明书 3/4 页 5 CN 104327132 B 5 0045 重复实施例1， 不同的是， 在步骤3)中， 用700A型阴离子交换树脂代替700B型阴离 子交换树脂。 0046 由本实施例制得黑芥子苷提取物4.05kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为73.80， 原料黑芥子苷回收率为90.57。 0047

19、实施例4 0048 重复实施例1， 不同的是， 在步骤3)中， 用3w/w的氢氧化钙水溶液代替1.5w/w 的氢氧化钠水溶液。 0049 由本实施例制得黑芥子苷提取物3.94kg， 对所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯 度为74.20， 原料黑芥子苷回收率为88.59。 0050 实施例5 0051 1)取干燥的芥菜种子150kg(黑芥子苷含量为3.5)， 粉碎， 用相当于原料重量8 倍、 55v/v的乙醇回流提取2h， 过滤， 残渣再用相当于原料重量7倍、 50v/v的乙醇回流提 取1h， 过滤， 残渣继续用相当于原料重量5倍、 80v/v的乙醇回流提取1h， 过滤， 合并提取 液， 所得提

20、取液减压回收乙醇后离心， 收集上清液； 0052 2)上清液用混合溶剂(乙酸乙酯的丙酮的体积比为5:1)萃取2次， 合并收集有机相 (上层溶液)， 然后减压回收溶剂， 得到浓缩液(8波美)； 0053 3)取浓缩液上700A型阴离子交换树脂柱层析， 先水洗树脂柱至流出液澄清且无 色， 然后用1.5w/w的氢氧化钙水溶液洗脱， 薄层层析跟踪检测， 收集含目标成分的碱液洗 脱液， 减压浓缩至浸膏(20波美)； 0054 4)取浸膏与相当于其4倍重量的丙酮混合均匀(也可以干燥后再与相当于干燥物4 倍重量的丙酮混合均匀)， 用盐酸调节体系的pH4.5， 于4条件下放置12h结晶， 分离晶 体， 干燥，

21、 得到黑芥子苷产品4.3kg。 0055 取本实施例所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯度为96.3(图谱如图2所示)， 原 料黑芥子苷回收率为78.8。 0056 实施例6 0057 1)取干燥的芥菜种子200kg(黑芥子苷含量为3.1)， 粉碎， 用相当于原料重量10 倍、 60v/v的乙醇回流提取3h， 过滤， 所得提取液减压回收乙醇后离心， 收集上清液； 0058 2)上清液用混合溶剂(石油醚与丙酮的体积比为5:1)萃取2次， 合并收集有机相 (上层溶液)， 然后减压回收溶剂， 得到浓缩液(6波美)； 0059 3)取浓缩液上700B型阴离子交换树脂柱层析， 先水洗树脂柱至流出液澄清且无 色， 然后用0.5w/w的氢氧化钠水溶液洗脱， 薄层层析跟踪检测， 收集含目标成分的碱液洗 脱液， 减压浓缩至浸膏(20波美)； 0060 4)取浸膏与相当于其4倍重量的乙酸乙酯混合均匀(也可以干燥后再与相当于干 燥物4倍重量的乙酸乙酯混合均匀)， 用冰醋酸调节体系的pH4， 于4条件下放置12h结 晶， 分离晶体， 干燥， 得到黑芥子苷产品4.97kg。 0061 取本实施例所得的黑芥子苷提取物进行检测， 纯度为95.9， 原料黑芥子苷回收 率为76.9。 说明书 4/4 页 6 CN 104327132 B 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 104327132 B 7