Trichoderma reesei木聚糖酶.pdf

1、(48)更正文献出版日 2012.12.26 (10)授权公告号 CN 1415016 B9 (45)授权公告日 2012.07.11 CN 1415016 B9 *CN1415016B9* (21)申请号 00817933.6 (22)申请日 2000.09.11 C12N 15/56(2006.01) C12N 9/24(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C07K 16/40(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/885(2006.01) C12R 1/66(2006.01) C12R 1/80(2006.01) C12R 1/645(

2、2006.01) (73)专利权人 金克克国际有限公司 地址 美国加利福尼亚 (72)发明人 MLA萨洛海默 M希卡 - 奥 M坦卡南 ME潘提拉 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 唐伟杰 作者 :Xu J et al. 标题 :A third xylanase from Trichoderma reesei PC-3-7. Appl Microbiol Biotechnol 卷号 ： 49 期 号 ： .1998,49718-724. (54) 发明名称 Trichoderma reesei 木聚糖酶 (57) 摘要 本发明涉及新的木聚糖酶 (

3、 称之为 XYL-IV) 并且涉及编码那些木聚糖酶的核酸分子。这里还 提供了包括那些核酸序列的载体和宿主细胞， 与 本发明的木聚糖酶结合的抗体， 制备本发明的木 聚糖酶的方法， 和应用本发明的木聚糖酶的方法。 (85)PCT申请进入国家阶段日 2002.06.28 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2000/024747 2000.09.11 (87)PCT申请的公布数据 WO01/49859 EN 2001.07.12 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 宋智刚 权利要求书 1 页 说明书 24 页 序列表 3 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (

4、12)发明专利 (全文更正) CN 1415016 B91/1 页 2 1. 分离的 DNA 分子， 其编码氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 2. 权利要求 1 的分离的 DNA 分子， 其中所述 DNA 分子由 SEQ ID NO ： 1 的核苷酸序列构 成。 3. 权利要求 1 的分离的 DNA 分子， 其中所述 DNA 分子来自真菌或细菌。 4. 权利要求 3 的分离的 DNA 分子， 其中所述真菌是丝状真菌。 5.权利要求4的分离的DNA分子， 其中所述丝状真菌选自木霉属(Trichoderma spp.)， 腐质霉属(Humicola spp.)， 链孢霉属(Neur

5、ospora spp.)， 曲霉属(Aspergillus spp.)， 镰 孢属 (Fusariumspp.)， 青霉属 (Penicillium spp.) 和胶霉属 (Gliocladium spp.)。 6. 权利要求 4 的分离的 DNA 分子， 其中所述丝状真菌是 Trichoderma reesei。 7. 包含权利要求 1-6 任一项的 DNA 分子的载体。 8. 用权利要求 7 的载体转化的宿主细胞。 9. 权利要求 8 的宿主细胞， 其中宿主细胞是丝状真菌。 10.权利要求9的宿主细胞， 其中所述丝状真菌选自木霉属(Trichoderma spp.)， 腐质 霉属(Humi

6、cola spp.)， 链孢霉属(Neurospora spp.)， 曲霉属(Aspergillus spp.)， 镰孢属 (Fusariumspp.)， 青霉属 (Penicillium spp.) 和胶霉属 (Gliocladium spp.)。 11. 权利要求 10 的宿主细胞， 其中所述丝状真菌是 Trichodermareesei。 12. 分离的 XYL-IV 蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 13. 产生 XYL-IV 蛋白质的方法， 包括 ： (a) 获得已用包含权利要求 1-6 任一项的 DNA 分子的载体转化的宿主细胞 ； (b) 在适合表达

7、XYL-IV 蛋白质的条件下培养宿主细胞 ； (c) 回收 XYL-IV 蛋白质。 14. 改变含有木聚糖的底物的性质的方法， 包括 a) 获得已用包含权利要求 1-6 任一项的 DNA 分子的载体转化的宿主细胞 ； b) 在适合表达 XYL-IV 蛋白质的条件下培养该宿主细胞 ； 回收 XYL-IV 蛋白质， 和 c) 使含有木聚糖的底物接触包括该 XYL-IV 蛋白质的组合物。 15. 权利要求 14 的方法， 其中所述底物选自动物饲料和食品及植物材料， 而所述方法 改变动物饲料和食品及植物材料的处理性质。 16. 权利要求 14 的方法， 其中所述底物是木纸浆或其衍生物， 而所述方法改变

8、在造纸 过程中木纸浆或者其衍生物的性质。 17. 权利要求 14 的方法， 其中所述底物是含有木聚糖的生物质， 而所述方法改变在含 有木聚糖的生物质还原为葡萄糖的过程中含有木聚糖的生物质的性质。 权 利 要 求 书 CN 1415016 B91/24 页 3 Trichoderma reesei 木聚糖酶 0001 政府赞助的研究和发展 0002 不适用。 0003 发明背景 0004 木材的复杂结构包括纤维素， 半纤维素和木质素， 以及其它次要成分。 木质素和纤 维素与半纤维素相结合， 并且可能部分共价键合纤维素与半纤维素两者。 在造纸工艺中， 通 常从木浆中去除木质素， 因为其带来褐色，

9、降低了强度并且给最终产品带来其它不期望的 特征。能够用很多方法实现木质素的去除。 0005 通过化学制浆 ( 例如 Kraft 方法 ) 最初从木浆中去除大部分木质素。在接下来的 漂白过程中， 化学纸浆常常与氯和其它去木质化学品反应进一步去除木质素， 并且然后与 漂白剂反应来修饰来自纸浆的木质素， 给出稳定的变白的纸浆。 但是， 从环境角度出发不期 望用氯处理， 因为产生的排放物含有大量有毒化合物(例如氯化酚类)。 考虑到用含氯化学 品漂白的纸浆引起的环境有害作用， 驱使工业寻求可替代的漂白方法。 0006 文献中描述过利用木聚糖酶和来自真菌和细菌来源的其它酶来增强去木质作用 和增白 (bri

10、ghtening)， 同时减少或消除氯化合物的使用的尝试。但是， 现有酶体系通常不 容易实现半纤维素的降解或去木质作用达到充分的程度。 通过应用另外的木聚糖酶可以提 高半纤维素的降解和去木质作用的程度， 所述另外的木聚糖酶以不同的方式裂解木聚糖或 者与其它木聚糖酶， 半纤维素酶， 其它酶， 或者甚至化学品协同作用。 0007 已经鉴定和表征了多种来自真菌和细菌微生物的木聚糖酶 ( 参见， 例如， 美国专 利 5,437,992 ； Coughlin， M.P. 上文 ； Biely， P. 等， Proceedings of the second TRICEL symposium on Tri

11、choderma reesei Cellulases and Other Hydrolases， Espoo 1993， P.Souminen 和 T.Reinikainen 编 著， Foundation for Biotech nical and Industrial Fermentation Research 8 ： 125-135(1993)。特别地， 已经在 T.reesei 中鉴定了三种具 体的木聚糖酶 (XYL-I， XYL-II， 和 XYL-III)(Tenkanen， 等， Enzyme Microb.Technol.14 ： 566(1992) ；等， Bio/Techn

12、ology 10 ： 1461(1992) ； 和Xu， 等， Appl.Microbiol. Biotechnol.49 ： 718(1998)。 0008 尽管文献中描述过很多种木聚糖酶， 但是依然存在鉴定在与动物饲料， 谷物加工， 生物燃料， 洗涤， 织物护理， 化学品， 植物加工， 和对纸浆和纸去木质和增白相关的应用中更 有效的新的木聚糖酶的需要。 0009 发明概述 0010 申请人鉴定了 cDNA 克隆， 其编码这里指定为 XYL-IV 的新的木聚糖酶并且与前面 描述的木聚糖酶具有一定序列同一性。 0011 在一个实施方案中， 本发明提供了包括编码 XYL-IV 的 DNA 的分离

13、的核酸分子。在 某些方面， 所述分离的核酸包括编码具有图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO ： 2)的XYL-IV的 DNA， 或者与这样的编码核酸序列互补。优选地， 编码 XYL-IV 蛋白质的 DNA 来自微生物， 优 选来自真菌或细菌。优选地， 所述 DNA 来自丝状真菌例如木霉属 (Trichoderma spp.)， 腐 质霉属 (Humicola spp.)， 链孢霉属 (Neurospora spp.)， 曲霉属 (Aspergillus spp.)， 镰 说 明 书 CN 1415016 B92/24 页 4 孢属 (Fusarium spp.)， 青霉属 (Penicill

14、ium spp.)， 或者胶霉属 (Gliocladium spp.)， 更 优选来自木霉属 (Trichoderma spp)。还优选所述 DNA 包括 SEQ ID NO ： 1 的核苷酸序列。 或者， 所述 DNA 与 SEQ ID NO ： 1 的核苷酸序列具有至少 50， 60， 或 70， 优选至少 85 或 90的序列同一性， 或者包括 SEQ ID NO ： 1 核苷酸序列的衍生物， 其中所述 DNA 编码裂 解木聚糖， 支化木聚糖或木寡糖 (xylooligosaccharides) 的 XYL-IV 蛋白质。包括这样的 DNA 的载体， 转化有这样的载体的宿主细胞， 以及这

15、样的转化的宿主细胞产生的发酵肉汤也 在本发明的范围内。 0012 本发明的另一个实施方案提供了部分或全部分离的 XYL-IV 蛋白质。优选地， 所 述 XYL-IV 来自微生物， 优选来自真菌或细菌。优选地， 所述 XYL-IV 来自丝状真菌， 更优 选来自丝状真菌例如木霉属 (Trichoderma spp.)， 腐质霉属 (Humicola spp.)， 链孢霉 属 (Neurospora spp.)， 曲霉属 (Aspergillus spp.)， 镰孢属 (Fusarium spp.)， 青霉属 (Penicillium spp.)， 或者胶霉属 (Gliocladium spp.)，

16、 最优选来自木霉属 (Trichoderma spp)。特别地， 本发明提供了分离的天然序列 XYL-IV， 其在一个实施方案中， 包括包含图 2 的第1-465位残基(SEQ ID NO ： 2)的氨基酸序列。 在本发明的优选实施方案中， 所述XYL-IV 包括SEQ ID NO ： 2的氨基酸序列， 与SEQ ID NO ： 2的氨基酸序列具有至少50或70， 优选 至少 85或 90序列同一性， 或者包括 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的衍生物， 其中 XYL-IV 裂解木聚糖。 0013 本发明的另一个实施方案提供了制备 XYL-IV 蛋白质的方法， 包括步骤 (a) 获得

17、用包括编码 XYL-IV 蛋白质的 DNA 的载体转化的宿主细胞 ； (b) 在适合表达并且任选地适合 XYL-IV 蛋白质分泌的条件下培养宿主细胞 ； 和 (c) 从含有 XYL-IV 蛋白质的发酵肉汤回收。 0014 在另一个实施方案中， 本发明提供了与 XYL-IV 蛋白质或者其结构域特异性结合 的抗体。 任选地， 所述抗体是单克隆抗体。 在另一个实施方案中， 本发明提供了使用XYL-IV 蛋白质或者编码 XYL-IV 蛋白质的 DNA 的方法。 0015 附图的简要描述 0016 图 1 说明在混合碳源上培养之后从 Trichoderma reesei RNA 获得的 cDNA 克隆的

18、 核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 1)。 0017 图2说明来自Trichoderma reese的新XYL-IV的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO ： 2)。 0018 图 3 说明沿着图 1 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 1) 限制酶切位点的位置。 0019 图 4 说明 HexA3Xyl3的有效水解。数值来自表 5。 0020 图 5 说明通过 XYL-IV 自木聚糖， MeGIcA- 木聚糖和黑麦的阿拉伯木聚糖 (arabinoxylan)产生还原糖。 每一种木聚糖以5g/L存在， 并且反应在40和pH 4下进行。 0021 图 6a 和 6b 说明 XYL-IV

19、和 XYL-I 及 -II 每一种的协同作用。 0022 作为还原糖 ( 图 6a) 和游离的木糖 ( 图 6b) 测定产物。数值来自表 6。 0023 图 7a-d 说明 XYL-I 和 XYL-IV 逐步作用中的协同作用。在图 7a 和 7b 中， 底物是 MeGIcA- 木聚糖。在图 7c 和 7d 中， 底物是黑麦阿拉伯木聚糖。数值来自表 7。 0024 本发明的详细描述 0025 定义 0026 应该注意， 如在该说明书和附加的权利要求书中使用的， 除非另有明确说明， 单数 说 明 书 CN 1415016 B93/24 页 5 形式 “一个” ，“一” 和 “这个” 包括复数指示物

20、。因此， 例如， 关于含有 “化合物” 的组合物包 括两种或多种化合物的混合物。还应该注意， 除非另有明确说明， 术语 “或者” 一般以其包 括 “和 / 或” 的意义被使用。 0027 “木聚糖酶” 指来自微生物例如真菌， 细菌， 或者来自植物或动物的蛋白质或多肽 的蛋白质或多肽结构域， 并且其具有在木聚糖碳水化合物骨架 ( 包括支化的木聚糖和木寡 糖 ) 的一个或多个不同的位点催化裂解木聚糖的能力。在一定条件下， 木聚糖酶也可以催 化从较小的单元合成糖例如木聚糖或木寡糖。文献中已知来自 T.Reesei 的三种具体的木 聚糖酶。 0028 如这里所使用的，“XYL-IV” 指具有木聚糖酶活

21、性的酶， 并且其一般在其天然或野 生形式没有纤维素结合域。本发明的 XYL-IV 包括包含图 2 的第 1-465 位残基 (SEQ ID NO ： 2) 的蛋白质， 与 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列具有至少 50或 70， 优选至少 85或 90 序列同一性的蛋白质， 或者 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的衍生物， 其中 XYL-IV 裂解木聚 糖。本发明提供的 XYL-IV 具体排除三种已知的 T.Reesei 木聚糖酶， 它们被称为 XYL-I， XYL-II( 属于糖基水解酶家族 11)， 和 XYL-III( 属于糖基水解酶家族 10)， 并且描述于 等和Xu，

22、 等， 上文。 相信XYL-IV以和三种已知的T.Reesei木聚糖酶不同的方 式作用于木聚糖， 但是也可以裂解某些相同的位置。 0029 这里考虑 XYL-IV 可以来自各种各样的任何来源， 包括微生物， 例如真菌或细菌， 植物， 或动物。具体地说， 预计具有纤维素溶解能力的微生物将是极好的 XYL-IV 蛋白质的 来源。在本发明特别优选的实施方案中， XYL-IV 来自木霉属 (Trichoderma spp.)， 特别是 Trichoderma reesei。但是， 还优选地， 根据本发明的 XYL-IV 和 / 或编码 XYL-IV 的 DNA 来 自真菌， 例如， 犁头霉属(Absi

23、dia spp.) ； 支顶孢属(Acremonium spp.) ； 蘑菇属(Agaricus spp.) ； Anaeromyces spp. ； 曲霉属 (Aspergillus spp.)， 包括棘孢曲霉 (A.aculeatus)， 泡盛曲霉 (A.awamori)， 黄色曲霉 (A.flavus)， 臭曲霉 (A.foetidus)， 丁烯二酸曲霉 (A.fumaricus)， 烟曲霉 (A.fumigatus)， 构巢曲霉 (A.nidulans)， 黑色曲霉 (A.niger)， 米 曲霉(A.oryzae)， 土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor)

24、 ； Aeurobasidium spp. ； 头孢属(Cephalosporium spp.) ； 毛壳霉属(Chaetomium spp.) ； Coprinus spp. ； Dactyllum spp. ； 镰孢属 (Fusarium spp.)， 包括 F.conglomerans， 多隔镰孢 (F.decemcellulare)， 爪哇镰孢 (F.javanicum)， 亚麻镰孢 (F.lini)， 尖孢镰孢 (F.oxysporum) 和茄病镰孢 (F.solani) ； 胶霉属 (Gliocladium spp.) ； 腐质霉属 (Humicola spp.)， 包括 H.in

25、solens 和 H.lanuginosa ； 毛霉属 (Mucor spp.) ； 链孢霉属 (Neurospora spp.)， 包括粗糙链孢霉 (N.crassa) 和嗜食链孢霉 (N.sitophila) ； Neocallimastix spp. ； Orpinomyces spp. ； 青 霉属 (Penicillium spp) ； Phanerochaete spp. ； 射脉菌属 (Phlebia spp.) ； Piromyces spp. ； 根霉属 (Rhizopus spp.) ； 裂褶菌属 (Schizophyllum spp.) ； 栓菌属 (Trametes s

26、pp.) ； 木霉属 (Trichoderma spp.)， 包括 T.reesei， T.reesei(longibrachiatum) 和绿色 木霉 (T.viride) ； 和接霉属 (Zygorhynchus spp.)。 0030 优选地， 根据本发明的 XYL-IV 蛋白质是分离的或纯化的。所谓纯化或分离指通过 将 XYL-IV 与其自然界相关的天然存在成分的一些或全部分开而从其自然状态改变 XYL-IV 蛋白质。 这样的分离或纯化可以通过本领域公知的分离技术来实现， 例如离子交换层析， 亲 和层析， 疏水分离， 透析， 蛋白酶处理， 硫酸铵沉淀或者其它蛋白质盐沉淀， 离心， 大小

27、排阻 说 明 书 CN 1415016 B94/24 页 6 层析， 过滤， 微过滤， 凝胶电泳或者梯度分离来去除全部的细胞， 细胞碎屑， 杂质， 外来蛋白 质， 或者最终组合物中不期望的酶。然后还可以向含有 XYL-IV 的组合物中加入提供另外的 益处的成分， 例如， 活化剂， 抗抑制剂， 期望的离子， 控制 pH 的化合物或者其它酶。优选地， 通过重组方法制备根据本发明的 XYL-IV 蛋白质。 0031 如这里所使用的，“微生物” 指细菌， 真菌， 病毒， 原生动物， 和其它微生物或微生物 体。如这里所使用的，“植物” 指植物界的任何成员。如这里所使用的，“动物” 指动物界的 任何成员。

28、动物可以是单细胞动物或多细胞动物。 0032 如这里所使用的，“衍生物” 指通过在 C- 末端和 N- 末端之一或两端加上一个或多 个氨基酸， 在氨基酸序列的一个或多个不同的位点替代一个或多个氨基酸， 在蛋白质的一 端或两端或者在氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸， 或者在氨基酸序列 的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而从前体蛋白质(例如天然蛋白质)衍生的蛋白 质。优选通过修饰编码天然蛋白质的 DNA 序列， 将该 DNA 序列转化到合适的宿主中， 并且表 达该经修饰的 DNA 序列， 形成衍生的 XYL-IV， 实现 XYL-IV 衍生物的制备。 0033 本发明的 “衍生物”

29、 包括其中肽保留了前体 XYL-IV 的特征性 XYL-IV 特性但是在 某些具体方面具有改变的性质的与前体氨基酸序列 ( 例如， 野生型或天然状态 XYL-IV) 相 比包括改变的氨基酸序列的肽。例如， 所述 XYL-IV 衍生物可以具有提高的最适 pH 值或提 高的温度或氧化稳定性但是保留其特征性木聚糖修饰活性。类似地， 根据本发明的衍生物 包括纤维素结合域， 其可以以这样的方式被加入， 去除或修饰， 使得显著削弱或增强其纤维 素结合能力。根据本发明的衍生物包括木聚糖或者其它底物的结合域， 其已经被加入或修 饰来改变其底物结合能力。还考虑根据本发明的衍生物衍生自其中保留表达的 XYL-IV

30、 衍 生物的功能活性的编码 XYL-IV 衍生物的 DNA 片段。衍生物进一步包括改变 XYL-IV 特征的 化学修饰。 0034 通常， XYL-IV 衍生物与图 2 的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2) 具有至少大约 50， 70， 或 85的氨基酸序列同一性， 优选至少大约 85氨基酸序列同一性， 更优选至少大 约 90氨基酸序列同一性， 甚至更优选至少大约 95氨基酸序列同一性， 和更优选 98氨 基酸序列同一性。优选地， 所有的氨基酸替代是使用 L- 氨基酸的 “保守型氨基酸替代” ， 其 中一个氨基酸被另一个生物学类似氨基酸替代。 保守型氨基酸替代是保持被替代的氨基酸 的总

31、电荷， 疏水性 / 亲水性， 和 / 或空间位阻的那些。保守型替代的例子是下面各组中的那 些 ： Gly/Ala， Val/Ile/Leu， Lys/Arg， Asn/Gln， Glu/Asp， Ser/Cys/Thr， 如 Phe/Trp/Tyr。衍 生物的不同可以在于， 例如， 1-10 个这样少的氨基酸残基， 例如 6-10 个， 象 5 这样少， 象 4， 3， 2 这样少， 或者甚至 1 个氨基酸残基。 0035 如这里使用的，“天然序列 XYL-IV” 包括具有和从自然得到的 XYL-IV 相同的氨基 酸序列的多肽。这样的天然序列 XYL-IV 可以从自然界分离或者可以通过重组或合

32、成方法 制备。术语天然序列 XYL-IV具体包括天然存在的 XYL-IV 的截短或分泌形式和 XYL-IV 的天然存在的变体形式 ( 例如， 不同剪接形式 )。在本发明的一个实施方案中， 天然序列 XYL-IV 包括图 2 的第 1-465 位氨基酸 (SEQ ID NO ： 2)。 0036 如这里使用的， 与这里鉴定的氨基酸或核苷酸序列的 “百分 ( ) 序列同一性” 定 义为为了实现最大百分比序列同一性将序列比对并且， 如果需要， 引入间隙之后， 而且不考 虑所有的保守型替代作为序列同一性一部分， 在候选序列中与 XYL-IV 序列中的氨基酸残 说 明 书 CN 1415016 B95/

33、24 页 7 基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。 0037 进行序列比对并且测定序列同一性的方法是本领域技术人员公知的， 可以进行 而不需要过多的实验， 并且可以明确获得同一性值的计算。参见， 例如， Ausubel 等， 编著 (1995)， Current Protocols in Molecular Biology， 第 19 章 (Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York) ；和 ALIGN 程 序 (Dayhoff(1978)， Atlas of Protein Sequence and Structure 5 ：

34、 Suppl.3(National Biomedical Research Foundation， Washington， D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法， 包括， 例如， Needleman 等 (1970)J.Mol.Biol.48 ： 443 的 同 源 性 比 对 算 法 ； Smith 等 (1981)Adv.Appl.Math.2 ： 482 的局部同源性算法 ； Pearson 等 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 2444 的相似性搜索 方 法 ； Smith-Waterman 算 法 (Meth.Mol.Biol.70 ： 173

35、-187(1997) ；和 BLASTP， BLASTN， 和 BLASTX 算法 ( 参见 Altschul 等 (1990)J.Mol.Biol.215 ： 403-410)。利用这些算法 的计算机程序也是可获得的， 并且包括但不限于 ： ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 软件， 或 者 WU-BLAST-2(Altschul 等， Meth.Enzym.， 266 ： 460-480(1996) ；或 者 GAP， BESTFIT， BLAST Altschul 等， 上文， FASTA， 和 TFASTA， 在 Genetics Computing Group(GCG

36、) 包， 8 版， Madison， Wisconsin， USA 中可获得 ； 和 Intelligenetics， Mountain View， California 提 供的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL。本领域那些熟练技术人员能够确定用于测定比对的合适 的参数， 包括需要在要比较的序列的长度上实现最大比对所需的算法。 优选地， 使用程序确 定的默认参数测定序列同一性。具体地说， 通过 MSPRCH 程序 (Oxford Molecular) 中实施 的Smith-Waterman同源性搜索算法(Meth.Mol.Biol.70 ： 173-187(1997)能够测定序列同

37、一性， 采用下面的搜索参数使用亲族间隙搜索 (affine gap search) ： 间隙开放损失 12， 间 隙扩展损失 1。优选地， 利用 Genetics Computer Group， Inc.， Madison， Wisconsin 的 GCG 序列分析软件包的GAP程序， 应用blosum62氨基酸替代矩阵， 间隙权重12并且长度权重2， 可以进行成对氨基酸比较。 0038 关于两个氨基酸序列的最佳比对， 变体氨基酸序列的连续片段可以相对参照氨基 酸序列具有另外的氨基酸残基或者缺失的氨基酸残基。 用于与参照氨基酸序列相比较的连 续区段包括至少 20 个连续的氨基酸残基， 并且可以

38、是 30， 40， 50， 或者更多的氨基酸残基。 通过指定间隙损失可以对与包括衍生物氨基酸序列中间隙相关的提高的序列同一性进行 校正。 0039 如这里使用的，“表达载体” 指包括与在合适的宿主中能实现 DNA 表达的合适的调 控序列可操作地连接的 DNA 序列的 DNA 构建体。这样的调控序列可以包括实现转录的启动 子， 任选的调控转录的操纵基因序列， 编码 mRNA 上合适的核糖体结合位点的序列， 和控制 转录和翻译终止的序列。针对不同的细胞类型优选使用不同的表达载体。枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 中使用的载体的优选的启动子是 AprE 启动子 ； 大肠杆菌 (E

39、.coli) 中使用的优选的启动子是 Lac 启动子， 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中使用 的优选的启动子是 PGK1， 黑曲霉 (Aspergillus niger) 中使用的优选的启动子是 glaA， Trichoderma reesei 中使用的优选的启动子是 cbhI。所述载体可以是质粒， 噬菌体粒， 或 者简单地是潜在的基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中， 该载体可以独立于宿主基因 组而复制和发挥功能， 或者可以， 在合适的条件下， 整合到基因组本身中。在本申请说明书 中， 质粒和载体有时互换使用。 但是， 本发明意在包括本领域公知的或者变为公知

40、的起着等 说 明 书 CN 1415016 B96/24 页 8 价功能的其它形式表达载体。因此， 在本发明表达 DNA 序列时可以使用多种宿主 / 表达载 体组合。有用的表达载体， 例如， 可以由染色体， 非染色体和合成的 DNA 序列组成， 例如各种 已知的 SV40 的衍生物和已知的细菌质粒， 例如， 来自大肠杆菌的质粒， 包括 col E1， pCRl， pBR322， pMb9， pUC 19 和它们的衍生物， 宽宿主范围质粒， 例如， RP4， 噬菌体 DNAs， 例如， 噬 菌体 的多种衍生物， 例如， NM989， 和其它 DNA 噬菌体， 例如， M13 和丝状单链 DNA

41、噬菌体， 酵母质粒， 例如 2 质粒或者其衍生物， 真核细胞中有用的载体， 例如在动物细胞中使用的 载体和从质粒和噬菌体 DNA 的组合衍生的载体， 例如经修饰应用噬菌体 DNA 或其它表达调 控序列的质粒。使用本发明的表达载体的表达技术是本领域公知的并且一般性描述于， 例 如， Sambrook， 等， MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL， SECOND EDITION， 冷泉港出 版社 (1989)。经常地， 通过整合事件直接插入到特定物种的基因组中而将包括本发明 DNA 序列的这样的表达载体转化到单细胞宿主中 ( 参见， 例如， Bennett

42、 & Lasure， MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI， Academic Press， San Diego， pp.70-76(1991) 和这里引用的描 述真菌宿主定向基因组插入的文章 )。 0040 如这里使用的，“宿主菌株” 或者 “宿主细胞” 指用于包括本发明 DNA 的表达载体的 合适的宿主。本发明中有用的宿主细胞一般是原核宿主或真核宿主， 包括其中能够实现表 达的任何可转化微生物。具体地说， 宿主菌株可以是枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)， 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)， Trichoderma rees

43、ei，酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) 或者黑曲霉 (Aspergillus niger)。用应用重组 DNA 技术构建的载体转化或 转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞能复制编码 XYL-IV 及其衍生物或变体 ( 突变体 ) 的 载体或者表达期望的肽产物。在根据本发明的优选实施方案中，“宿主细胞” 指从木霉属 (Trichoderma sp.) 细胞和其产生的原生质体。 0041 如这里使用的，“信号序列” 指有利于在细胞外分泌成熟形式蛋白质的、 与蛋白质 的 N- 末端部分键合的氨基酸序列。信号序列的该定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟 形式没有信号序列，

44、 其在分泌过程之中被裂解。 0042 如这里使用的，“功能性连接” 或者 “可操作地连接” 指， 调控区， 例如启动子， 终止 子， 分泌信号或增强子区附加或连接于结构基因并且控制该基因的表达。 0043 本领域技术人员容易确定杂交反应的 “严紧性” ， 并且一般是根据探针长度， 洗涤 温度， 和盐浓度的经验计算值。一般情况下， 越长的探针要求适当退火的温度越高， 而越短 的探针需要越低的温度。当互补链存在于低于它们的熔解温度的环境中时， 杂交作用一般 取决于变性的 DNA 重新退火的能力。探针和杂交序列之间的预期同源性程度越高， 可以使 用的相对温度越高。作为结果， 得出较高的相对温度趋向于

45、使反应条件更严紧， 而较低温 度严紧性较低。有关杂交反应严紧性的进一步详细描述和解释参见 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers， 1995)。 0044 如这里使用的，“严紧条件” 或者 “高严紧条件” 可以鉴定为 ： (1) 对于洗涤使用低 离子强度和高温度， 例如， 50下 0.015M 氯化钠 /0.0015M 柠檬酸钠 /0.1十二烷基硫酸 钠 ； (2) 杂交期间使用变性剂， 例如甲酰胺， 例如， 42下， 含有 0.1牛血清白蛋白 /0.1 Ficoll/0.1

46、聚乙烯吡咯烷酮 /50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 6.5) 和 750mM 氯化钠， 75mM 柠檬 酸钠的 50 (v/v) 甲酰胺 ； 或者 (3)42下， 使用 50甲酰胺， 5x SSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH6.8)， 0.1焦磷酸钠， 5x Denhardt s 溶液， 超声处理的鲑精 说 明 书 CN 1415016 B97/24 页 9 DNA(50g/ml)， 0.1SDS， 和10硫酸葡聚糖， 在42下用0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠) 和在55下用50甲酰胺洗涤， 接着55下用含有EDTA的0.1x SSC组成的

47、洗液高严紧性 洗涤。 0045 如这里使用的，“中等严紧条件”可以根据 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 纽约 ： 冷泉港出版社， 1989) 定义， 并且包括使用比上面描述的那些严 紧性低的洗涤溶液和杂交条件 ( 例如， 温度， 离子强度， 和 SDS)。中等严紧条件的一个例 子是 37下在下面的溶液中过夜温育， 所述溶液包括 ： 20甲酰胺， 5x SSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸三钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)， 5x Denhardt s 溶液， 10硫酸葡聚糖， 和 20mg/ mL

48、 变性剪切鲑精 DNA， 接着在大约 37-50下用 1x SSC 洗涤滤膜。本领域技术人员明白怎 样根据需要调节温度， 离子强度， 等适应象探针长度等这样的因素。 0046 如这里使用的， 从微生物 “来源的” 物质 ( 例如多核苷酸或蛋白质 ) 指对微生物是 天然产生的物质。 0047 XYL-IV 特异性 0048 一般来说， XYL-IV 表现出不同于 11 家族或 10 家族糖基水解酶的特异性。特别 地， XYL-IV 表现出的底物特异性不同于 - 阿拉伯呋喃糖苷酶， - 半乳糖苷酶， - 木糖 苷酶， - 甘露糖苷酶的底物特异性。更特别地， XYL-IV 以不同于 XYL-1 或

49、-II 或 -III 的 特异性裂解底物。即， XYL-IV 可以在和这些其它的木聚糖酶相同位置中的一些处裂解木聚 糖， 但是它也在不同的位置处裂解。 0049 在一个实施方案中， 在典型反应条件下， 与 XYL-I 或 XYL-II 相比， XYL-IV 表现 出更大的对没有取代的木聚糖或者乙酰化 MeGIcA- 木聚糖的活性。XYLs-IV 和 -II 两者 都能水解脱乙酰 MeGIcA- 木聚糖。XYL-II 一般表现出比 XYL-IV 更大的对阿拉伯木聚糖 (arabinoxylan) 的活性。在裂解没有取代的木聚糖或乙酰化 MeGIcA- 木聚糖中， XYL-IV 产 生木糖作为其主要产物， 有较少量的木二糖和取代的木寡糖。其它两种木聚糖酶产生不同 的产物。与 XYL-I 或 -II 相比， XYL-IV 一般在更接近于取代的木糖单元处裂解。 0050 XYL-IV 和 XYLs-I 和 -II 之间的特异性中的差异能够在这些酶的组合物或混合物 对产物的裂解中产生协同作用。例如， XYL-IV 与 XYL-I 和 / 或 XYL-II 的混合物对底物的 裂解能够导致与更少的这些酶的裂解相比底物裂解速度和 / 或程度的大于加和性相加的 提高的结果。类似地， 不同的 XYL 或者 XYL-I， -II 和 / 或 -IV 的组合裂解之