具有增强的ADCC功能的抗体.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102027009 A (43)申请公布日 2011.04.20 CN 102027009 A *CN102027009A* (21)申请号 200980116978.1 (22)申请日 2009.03.11 61/035,692 2008.03.11 US C07K 16/00(2006.01) C07K 16/28(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/569(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12N 9/24(2006.01) (71)申请人 健泰科生物技术公司 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人

2、罗伯特拜尔 里德J哈里斯 多明戈斯恩格 埃米沈 马塞拉余 李锋 埃弗伦帕西斯 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 张红春 (54) 发明名称 具有增强的 ADCC 功能的抗体 (57) 摘要 本发明关注缺乏GlcNAc转移酶I活性的哺乳 动物细胞， 其被改造成表达抗体或其片段， 由此增 强由所表达的抗体或其片段展现的抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性 (ADCC)。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.11.11 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/036855 2009.03.11 (87)PCT申请的公布数据 WO2009

3、/114641 EN 2009.09.17 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 4 页 说明书 21 页 附图 16 页 CN 102027024 A1/4 页 2 1. 一种缺乏 GlcNAc 转移酶 I 活性的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段， 或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 2. 权利要求 1 的哺乳动物细胞，其还具有增强的 -1，2- 甘露糖苷酶活性。 3. 权利要求 2 的哺乳动物细胞，其是一种细胞系。 4. 权利要求 3 的哺乳动物细胞，其是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系。 5. 权利

4、要求 3 的哺乳动物细胞，其中所述抗体或抗体片段结合选自下组的抗原 ： CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34，CD40，EGF 受体 (EGFR，HER1， ErbB1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3)， HER4(ErbB4)， LFA-1， Mac1， p150，95， VLA-4， ICAM-1， VCAM， v/3 整 联 蛋 白， CD11a， CD18， CD11b， VEGF ； IgE ；血型抗原 ；fl k2/fl t3 受体 ；肥胖 (OB) 受体 ；mpl 受体 ；CTLA-4 ；蛋白 C，DR5， EGFL7，neuropo

5、lin 及其受体，VEGF-C，肝配蛋白及其受体，导蛋白及其受体，slit 及其 受体，sema 及其受体，脑信号蛋白及其受体，robo 及其受体，和 M1。 6. 权利要求 5 的哺乳动物细胞，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。 7. 权利要求 6 的哺乳动物细胞，其中所述嵌合抗体是抗 CD20 抗体。 8. 权利要求 7 的哺乳动物细胞，其中所述抗 CD20 抗体是 rituximab 或 ocrelizumab。 9.权利要求6的哺乳动物细胞，其中所述人源化抗体是抗HER2，抗HER1，抗VEGF 或抗 IgE 抗体。 10. 权 利 要 求 9 的 哺 乳 动 物 细 胞， 其 中 所

6、述 抗 HER2 抗 体 是 trastuzumab 或 pertuzumab。 11. 权 利 要 求 9 的 哺 乳 动 物 细 胞， 其 中 所 述 抗 VEGF 抗 体 是 bevacizumab 或 ranibizumab。 12. 权利要求 9 的哺乳动物细胞，其中所述抗 IgE 抗体是 omalizumab。 13.权利要求5的哺乳动物细胞，其中所述抗体片段选自下组 ：互补决定区(CDR)片 段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体，双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗体， 和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合。 14. 一种其中 GlcNAc 转移酶

7、I 活性通过 RNAi 敲低被降低的哺乳动物细胞，其被改 造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位 点。 15.权利要求14的哺乳动物细胞，其中GlcNAc转移酶I活性通过RNAi敲低被降低， 这足以产生包含 20或更多 Man5，Man6 聚糖的碳水化合物结构。 16.权利要求14的哺乳动物细胞，其中GlcNAc转移酶I活性通过RNAi敲低被降低， 这足以产生包含 25或更多 Man5，Man6 聚糖的碳水化合物结构。 17. 权利要求 14 的哺乳动物细胞，其还具有增强的 -1，2- 甘露糖苷酶活性。 18. 权利要求 17 的哺乳动物细胞，其被改造成表

8、达抗体或其片段，或免疫粘附素或 其片段，其中所述抗体或其片段包含具有 20或更多 Man5， Man6 聚糖的碳水化合物结 构。 19. 权利要求 17 的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或 其片段，其中所述抗体或其片段包含具有 25或更多 Man5， Man6 聚糖的碳水化合物结 构。 权 利 要 求 书 CN 102027009 A CN 102027024 A2/4 页 3 20. 权利要求 17 的哺乳动物细胞，其是一种细胞系。 21. 权利要求 20 的哺乳动物细胞，其是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系。 22. 权利要求 17 的哺乳动物细胞，其中所述抗体或抗

9、体片段结合选自下组的抗原 ： CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34，CD40，EGF 受体 (EGFR，HER1， ErbB1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3)， HER4(ErbB4)， LFA-1， Mac1， p150，95， VLA-4， ICAM-1， VCAM， v/3 整 联 蛋 白， CD11a， CD18， CD11b， VEGF ； IgE ；血型抗原 ；fl k2/fl t3 受体 ；肥胖 (OB) 受体 ；mpl 受体 ；CTLA-4 ；蛋白 C，DR5， EGFL7，neuropolin 及其受体，VEGF-C，肝配蛋白及

10、其受体，导蛋白及其受体，slit 及其 受体，sema 及其受体，脑信号蛋白及其受体，robo 及其受体，和 M1。 23. 权利要求 14 的哺乳动物细胞，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。 24. 权利要求 23 的哺乳动物细胞，其中所述嵌合抗体是抗 CD20 抗体。 25.权利要求24的哺乳动物细胞，其中所述抗CD20抗体是rituximab或ocrelizumab。 26. 权利要求 23 的哺乳动物细胞，其中所述人源化抗体是抗 HER2，抗 HER1，抗 VEGF 或抗 IgE 抗体。 27. 权 利 要 求 26 的 哺 乳 动 物 细 胞， 其 中 所 述 抗 HER2 抗 体 是

11、 trastuzumab 或 pertuzumab。 28. 权 利 要 求 26 的 哺 乳 动 物 细 胞， 其 中 所 述 抗 VEGF 抗 体 是 bevacizumab 或 ranibizumab。 29. 权利要求 26 的哺乳动物细胞，其中所述抗 IgE 抗体是 omalizumab。 30. 权利要求 26 的哺乳动物细胞，其中所述抗体片段选自下组 ：互补决定区 (CDR) 片段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体，双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗 体，和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合。 31. 一种其中 GlcNAc 转移酶 I 活性通过高

12、尔基 UDP-GlcNAc 转运蛋白 RNAi 敲低被 降低的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中所 述片段包含至少一个糖基化位点。 32. 权利要求 31 的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞还具有增强的 -1，2- 甘 露糖苷酶活性。 33. 一种其中 GlcNAc 转移酶 I 活性通过高尔基 UDP-GlcNAc 转运蛋白 RNAi 敲低而 被降低，而且 GlcNAc 转移酶 I 通过 RNAi 也被敲低的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗 体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 34. 权利要求 33 的哺乳动物细胞，其中所述

13、哺乳动物细胞还具有增强的 -1，2- 甘 露糖苷酶活性。 35. 一种用于制备主要携带 Man5 聚糖的抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段的方 法，包括在使得所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段生成的条件下培养依照权利 要求 3 或权利要求 20 的哺乳动物细胞系，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 36. 权利要求 35 的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系， 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带 20或更多的 Man5 聚糖。 37. 权利要求 35 的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系， 其中所述抗体或其片段，或免疫粘

14、附素或其片段携带 25或更多的 Man5 聚糖。 权 利 要 求 书 CN 102027009 A CN 102027024 A3/4 页 4 38. 权利要求 35 的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系， 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带 30或更多的 Man5 聚糖。 39. 权利要求 35 的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系， 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带 35或更多的 Man5 聚糖。 40. 权利要求 35 的方法，其中所述抗体或抗体片段结合选自下组的抗原 ：CD3， CD4，CD8，CD19，

15、CD20，CD22，CD34，CD40，EGF 受体 (EGFR，HER1，ErbB1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3)， HER4(ErbB4)， LFA-1， Mac1， p150，95， VLA-4， ICAM-1，VCAM，v/3 整联蛋白，CD11a，CD18，CD11b，VEGF ；IgE ；血型抗 原 ；fl k2/fl t3 受体 ；肥胖 (OB) 受体 ；mpl 受体 ；CTLA-4 ；蛋白 C， DR5， EGFL7， neuropolin 及其受体， VEGF-C，肝配蛋白及其受体，导蛋白及其受体， slit 及其受体， sema 及其受体，脑信号蛋白

16、及其受体，robo 及其受体，和抗 M1。 41. 权利要求 40 的方法，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。 42. 权利要求 41 的方法，其中所述嵌合抗体是抗 CD20 抗体。 43. 权利要求 42 的方法，其中所述抗 CD20 抗体是 rituximab 或 ocrelizumab。 44. 权利要求 41 的方法，其中所述人源化抗体是抗 HER2，抗 HER1，抗 VEGF 或抗 IgE 抗体。 45. 权利要求 44 的方法，其中所述抗 HER2 抗体是 trastuzumab 或 pertuzumab。 46. 权利要求 44 的方法，其中所述抗 VEGF 抗体是 bevaciz

17、umab 或 ranibizumab。 47. 权利要求 44 的方法，其中所述抗 IgE 抗体是 omalizumab。 48. 权利要求 40 的方法，其中所述抗体片段选自下组 ：互补决定区 (CDR) 片段，线 性抗体，单链抗体分子，微型抗体，双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗体，和含有 免疫球蛋白至少一部分的多肽，该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合。 50. 权利要求 35 的方法，其包括培养所述缺乏 GlcNAc 转移酶 I 活性的哺乳动物细胞 系，该细胞系被改造成在存在 -1，2- 甘露糖苷酶下表达所述抗体，免疫粘附素，或其 片段，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶

18、，其中 Man7，8，9 聚糖被转 变成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 51.一种用于重组生产在其碳水化合物结构中具有约20至100Man5聚糖的抗体， 免疫粘附素，或其片段的方法，包括在由于 RNAi 敲低而具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活 性的哺乳动物细胞系中表达编码所述抗体或抗体片段的核酸，其中所述片段包含至少一 个糖基化位点。 52. 一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5 聚糖的抗体，免疫粘附 素，或其片段的方法，包括培养由于 RNAi 敲低而具有降低的 GcNAn 转移酶 I 活性的哺 乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫

19、粘附素，或其片段，其中 Man7， 8，9 聚糖被转变成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 53.权利要求52的方法，进一步包括在-1，2-甘露糖苷酶存在下培养由于RNAi敲 低而具有降低的 GcNAn 转移酶 I 活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗 体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7，8，9 聚糖被转变成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 54. 一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5 聚糖的抗体，免疫粘附 权 利 要 求 书 CN 102027009 A CN 1

20、02027024 A4/4 页 5 素，或其片段的方法，包括在存在毒性凝集素下培养哺乳动物细胞以选择出具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性的克隆，并改造一个或多个所述具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性的 克隆来表达所述抗体，免疫粘附素，或其片段，其中 Man7，8，9 聚糖被转变成 Man5 聚 糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 55. 权利要求 54 的方法，其中所述毒性凝集素是植物血凝素。 56. 权利要求 54 的方法，其中使用选择具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性的克隆来鉴 定其中 GlcNAc 转移酶 I 活性已经通过 RNAi 敲低被降低的细胞。 57

21、. 权利要求 54 的方法，进一步包括在存在 -1，2- 甘露糖苷酶下培养哺乳动物细 胞，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7，8，9 聚糖被转变 成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 58. 一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5 聚糖的抗体，免疫粘附 素，或其片段的方法，包括培养缺乏 UDP-GlcNAc 转运蛋白活性的哺乳动物细胞系，该 细胞系被改造成表达所述抗体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7，8，9 聚糖被转变成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至 少一个糖基化

22、位点。 59. 权利要求 58 的方法，进一步包括在存在 -1，2- 甘露糖苷酶下培养哺乳动物细 胞，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7，8，9 聚糖被转变 成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 60.权利要求58的方法，其中使用所述细胞中的内源甘露糖苷酶活性来进行抗体或其 片段的重组生产。 权 利 要 求 书 CN 102027009 A CN 102027024 A1/21 页 6 具有增强的 ADCC 功能的抗体 发明领域 0001 本发明关注具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 的抗体及其制 备方法。 0002 发明背

23、景 0003 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 是一种细胞介导的反应，其中表达 Fc 受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性细胞，和巨噬细 胞 ) 识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞溶胞。 已知在人 IgG 类的抗体中，IgG1 亚类具有最高的 ADCC 活性和 CDC 活性，而且当前临床肿瘤学实践中的大多数人源化抗 体，包括商品化的 HERCEPTIN( 曲妥单抗 ) 和 RITUXAN( 利妥昔单抗 )( 它们需要 高效应器功能来实现它们的效果 ) 是人 IgG1 亚类的抗体。 0004 为了增强治疗性抗体的效力，常常希望在效应器功能方面修饰抗

24、体，例如为 了增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 和 / 或补体依赖性细胞毒性 (CDC)。 这在肿瘤学领域会是特别有益的，其中治疗性单克隆抗体结合肿瘤细胞上的特 定抗原并诱导免疫应答，导致对肿瘤细胞的破坏。 通过增强 IgG 与携带 Fc 受体的杀伤细 胞的相互作用，能使得这些治疗性抗体更有效力。 0005 效应器功能，诸如 ADCC 的增强可以通过多种手段来实现，包括在抗体的 Fc 区 中引入一处或多处氨基酸替代。 或者 / 另外，可以在 Fc 区中引入半胱氨酸残基，由此 容许在此区域中形成链间二硫键。 如此生成的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和 / 或升高的补体介导

25、的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)。 参见 Caron et al.，J.Exp Med.176 ：1191-1195(1992) 及 Shopes，B.J.Immunol.148 ：2918-2922(1992)。 具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用异双功能交联剂来制备，如 Wolff et al.， Cancer Research 53 ：2560-2565(1993) 中所记载的。 或者，可改造抗体，其具有双重 Fc 区且可由此具有增强的补体溶解和 ADCC 能力。 参见 Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3 ：21

26、9-230(1989)。 0006 另一种增强抗体 ( 包括 IgG 类的抗体 ) 的效应器功能的办法是改造抗体 Fc 区的 糖基化样式。 IgG 分子含有 N- 连接的寡糖，其共价附着于 Fc 区中每个 CH2 结构域的保 守 Asn297。 在血清 IgG 的 Fc 区中找到的寡糖大多是复合类型的双触角聚糖。 已经报告 了多种抗体糖型对抗体效应器功能 ( 包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 具有 正影响。 如此，Fc 部分的碳水化合物成分的糖工程，特别是还原性核心岩藻糖基化，已 经报告于 Shinkawa T，et al.，J Biol Chem.2003 ；278 ：3466

27、-73 ；Niwa R，et al.，Cancer Res 2004 ；64 ：2127-33 ；Okazaki A，et al.，J Mol Biol 2004 ；336 ：1239-49 ；及Shields RL，et al.，J BiolChem 2002 ；277 ：26733-40。 0007 具有选定糖型的抗体已经通过多种手段生成，包括使用糖基化途径抑制剂，具 有缺失的或降低的糖基化途径中特定酶活性的突变细胞系，糖基化途径中的基因表达 增强或敲除的改造细胞，及用糖苷酶和糖基转移酶体外再塑。 Rothman et al.，1989 ； Molecular Immunology 26

28、：1113-1123 在存在葡萄糖苷酶抑制剂澳粟精胺和 N- 甲基脱氧 说 明 书 CN 102027009 A CN 102027024 A2/21 页 7 野艽霉素和甘露糖苷酶 I 抑制剂脱氧甘露糖野艽霉素下表达单克隆 IgG。 Umana et al.， Nature Biotechnology 1999 ；17 ：176-180 记载了表达 GNT-III 的 CHO 细胞系中表达的嵌 合 IgG1 的增强的效应器功能。 Shields et al.，2002 ；JBC 277 ：26733-26740，2002 记载 了其添加岩藻糖的能力缺陷的 Lec13 细胞系中表达的人 IgG1

29、 的增强的 ADCC。 Shinkawa et al.，2003 ；JBC 278 ：3466-3473，2003显示了YB2/0细胞中表达的抗CD20 IgG1显示 比那些由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系所生成的高超过50倍的ADCC，其中使用纯化的人 外周血单个核细胞细胞作为效应器。单糖组成和寡糖序型分析显示了与CHO生成的IgG1 的高岩藻糖 (Fuc) 含量相比，复合型寡糖的低 Fuc 含量在 YB2/0 生成的 IgG1 中是特征性 的。 Kanda et al.，2006 ；Glycobiology 17，104-118 记载了携带无岩藻糖基复合物，无岩 藻糖基杂合物，Man5，和

30、Man8，9 聚糖的利妥昔单抗中增强的 ADCC。 Yamane-Ohnuki et al.， Biotechnol Bioeng 2004 ；87 ：614-22 通过在缺乏核心岩藻糖基转移酶活性的 CHO 细胞中重组抗体表达实现了核心岩藻糖基化降低，而 Mori et al.， Biotechnol Bioeng 2004 ；88 ：901-8 使用岩藻糖基转移酶特异性短干扰 RNA(siRNA) 使所表达的抗体的效 应器功能最大化。 0008 主要携带 Man5 糖型的抗体已经记载于 Wright and Morrison ；1994， J.Exp. Med.180 ：1087-1096

31、 ；1998 ；J.Immunology 160 ：3393-3402。抗 体 在 不 具 有 活 性 GlcNAc 转移酶 I 的 lec1 细胞系中表达。 根据 J.Exp.Med. 论文的图 8 中的两阶段清除曲线 判断，看来有至少两种具有不同清除特征的不同抗体群。 清除更快速的 IgG 群大概是携 带 Man7，8，9 糖型的抗体。 0009 发明概述 0010 一方面，本发明关注一种缺乏 GlcNAc 转移酶 I 活性的哺乳动物细胞，其被改造 成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段。 在一个具体的实施方案中，所述哺乳动 物细胞还具有增强的 -1，2- 甘露糖苷酶 ( 在本文中也称作

32、 - 甘露糖苷酶 I) 活性。 0011 另一方面，本发明关注一种其中 GlcNAc 转移酶 I 活性通过 RNAi 敲低被降低的 哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段。 在一个具体的 实施方案中，所述哺乳动物细胞还具有增强的 -1，2- 甘露糖苷酶活性。 0012 另一方面，本发明关注一种其中 GlcNAc 转移酶 I 活性通过 RNAi 敲低被降低 且其还可具有增强的 -1，2- 甘露糖苷酶活性的哺乳动物细胞，这足以产生包含 5或 更多，或 10或更多，或 20或更多，或 25或更多，或 30或更多，或 35或更多 Man5， Man6 聚糖的碳水化合物结构，其被

33、改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或 其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 0013 另一方面，本发明关注一种其中 GlcNAc 转移酶 I 活性通过高尔基 UDP-GlcNAc 转运蛋白 RNAi 敲低被降低且其还可具有增强的 -1，2- 甘露糖苷酶活性的哺乳动物细 胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一 个糖基化位点。 0014 又一方面，本发明关注一种其中 GlcNAc 转移酶 I 活性通过高尔基 UDP-GlcNAc 转运蛋白 RNAi 敲低被降低且 GlcNAc 转移酶 I 通过 RNAi 也被敲低的哺乳动物细胞，其 被改造成表达抗体或

34、其片段，或免疫粘附素或其片段，其中 the 片段包含至少一个糖基化 位点。 说 明 书 CN 102027009 A CN 102027024 A3/21 页 8 0015 还有一方面，本发明关注一种用于制备主要携带 Man5 聚糖的抗体或其片段，或 免疫粘附素或其片段的方法，包括在使得所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段生 成的条件下培养依照权利要求 2 或权利要求 22 的哺乳动物细胞系。 0016 又一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中具有受控量的 Man5 聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在由于 RNAi 敲低而具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性

35、的哺乳动物细胞系中表达编码所述抗体或抗体片段的核酸。 0017 仍有一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在-1，2-甘露糖苷酶下培 养缺乏 GlcNAc 转移酶 I 活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫 粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7， 8，9 聚糖被转变成 Man5，6 聚糖。 0018 仍有一方面，本发明关注一种用于制备携带 5或更多，或 10或更多，或 20或更多，或 25或更多，或 30或更多，或 35或更多 Man5 聚糖的抗体

36、或其片 段，或免疫粘附素或其片段的方法，包括在使得所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其 片段生成的条件下培养依照权利要求 2 或权利要求 14 的哺乳动物细胞系，其中所述片段 包含至少一个糖基化位点。 0019 本发明还关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5 聚糖的抗 体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在 -1，2- 甘露糖苷酶下培养由于 RNAi 敲低而具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述 抗体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其 中 Man7，8，9 聚糖被转变成 Man5，6

37、 聚糖。 0020 另一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5 聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在毒性凝集素下培养哺乳动物细 胞系以选择出具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性的克隆，改造一个或多个所述具有降低的 GlcNAc 转移酶 I 活性的克隆来在存在 -1，2- 甘露糖苷酶下表达所述抗体，免疫粘附 素，或其片段，或者使所表达产物接触 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7，8，9 聚糖被 转变成Man5聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。在一个具体的实施方案中， 所述甘露糖苷酶是用于重组生产的细胞中内源的。 0021 还有一方面

38、，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5 聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在 -1，2- 甘露糖苷酶下 培养缺乏 UDP-GlcNAc 转运蛋白活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗 体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类 -1，2- 甘露糖苷酶，其中 Man7，8，9 聚糖被转变成 Man5 聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。 在一个 具体的实施方案中，所述甘露糖苷酶是用于重组生产的细胞中内源的。 0022 在所有方面中，所述哺乳动物细胞系可以是例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系。 0023 在所有方面中，本发明的细

39、胞系和方法可用于生产任何抗体，包括但不限于 诊断上或治疗上感兴趣的抗体，诸如结合一种或多种下述抗原的抗体 ：CD3， CD4， CD8， CD19， CD20， CD22， CD34， CD40， EGF 受 体 (EGFR， HER1， ErbB1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3)， HER4(ErbB4)， LFA-1， Mac1， p150，95， VLA-4， 说 明 书 CN 102027009 A CN 102027024 A4/21 页 9 ICAM-1，VCAM，v/3 整联蛋白，CD11a，CD18，CD11b，VEGF ；IgE ；血型抗 原 ；fl k

40、2/fl t3 受体 ；肥胖 (OB) 受体 ；mpl 受体 ；CTLA-4 ；蛋白 C， DR5， EGFL7， neuropilin 及受体，导蛋白及受体， slit 及受体， sema 及受体，脑信号蛋白及受体， robo 及受体，和 M1。 0024 所述抗体和抗体片段可以是嵌合的或人源化的，而且具体包括嵌合的和人 源化的抗 CD20 抗体，其中，在一个具体的实施方案中，所述抗体是 rituximab 或 ocrelizumab。 0025 在另一个实施方案中，所述人源化抗体是 HER2，抗 HER1，抗 VEGF 或抗 IgE 抗 体， 包 括 但 不 限 于 trastuzumab

41、， pertuzumab， bevacizumab， ranibizumab， 和 omalizumab，以及此类抗体的片段，变体和衍生物。 0026 抗体片段包括例如互补决定区 (CDR) 片段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗 体，双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗体，和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽， 该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合，前提是它们是糖基化的。 0027 附图简述 0028 图 1 描绘 N- 聚糖生物合成途径的一部分。 0029 图 2。 用于添加 N 端 FLAG标签至 GlcNAc 转移酶 I(GnT-I) 蛋白质的质粒载 体 (Stratagene)。 0030 图

42、 3。 用于表达小抑制性 RNA 的质粒载体 (Ambion，Austin.TX)。 0031 图 4。 siRNA 探针序列 (SEQ ID NO ：2-6) 及其在全长 GnT-I 基因中的相对位 置 ( 圆括号中 )。 每一种 siRNA 探针序列标有下划线 (a)。 接近 BamHI 位点的标有下划 线的序列与 GnT-I mRNA 序列互补。 两种标有下划线的序列彼此互补，导致形成发夹环 siRNA。 0032 图 5。 对来自各 siRNA 探针和带 FLAG 标签的 GnT-I 构建物的共转染的溶胞物 的 Western 印迹分析。 五种 siRNA 表达构建物以及空载体与带 F

43、LAG 标签的 GnT-I 构建 物瞬时共转染。 使用抗 FLAG抗体 (Sigma MO) 通过 Western 印迹分析含有等量细胞蛋 白质的细胞溶胞物。 0033 图 6A。 生成 ocrelizumab 的细胞系用 siRNA 表达质粒瞬时转染。 转染后第 1， 2 和 5 天收集来自每种样品条件的细胞团粒，然后分离 mRNA，供 TaqMan 分析用。 对照 的 GnT-I mRNA 表达水平设为 100。 0034 图 6B。 来自每份用所示 RNAi 载体转染的样品的转染后第 5 天的 Man5 水平。 0035 图 7。 为一项 14 天的实验，杂乱和 RNAi13 载体瞬时转

44、染入 ocrelizumab 生成细 胞系。 使用 CE- 聚糖测定所示培养期间收集的 HCCF 的 Man5 水平。 误差棒代表来自两 次运行的标准偏差。 0036 图 8A。 CHO- 甘露糖苷酶 I 的 cDNA 序列。 0037 图 8B。 CHO 和小鼠 - 甘露糖苷酶 I 之间的氨基酸序列比对。 0038 图 8C。 SV40GS.CMV.Man1.RNAi13 表达质粒的构造。 0039 图 9A。 通过 TAQMAN 测定法测定的稳定克隆中的相对 GnT-I mRNA 水平。 对照代表未转染基线中的 GnT-I 水平。 0040 图 9B。 14 天的生产运行结束时稳定克隆的

45、Man5 水平。 通过 CE- 聚糖分析测 说 明 书 CN 102027009 A CN 102027024 A5/21 页 10 定 Man5。 0041 图 10A。 培养期间各天的 Man5 水平。 通过 CE- 聚糖测定法测定 Man5 水平， 而误差棒代表标准偏差。 0042 图 10B。 22 天培养后 Man5 水平的比较。 测试基本培养基中的四种不同摩尔渗 透压浓度 (300，330，360，400mOsm)。 通过 CE- 聚糖测定法测定 Man5 水平。 0043 图 10C。 总共 14 天的培养的不同天添加 MnCl2下的 Man5 水平。 通过 CE- 聚 糖测定法

46、测定 Man5 水平。 0044 图 10D。 不同细胞培养条件下 GnT-I 敲低克隆 6D 的 Man5 水平 (CE- 聚糖测定 法 )。 对照代表标准生产培养基。 高 osmo 代表基本培养基中的摩尔渗透压浓度升高至 400mOsm。 无 Mn 代表缺乏锰的标准生产培养基。 0045 图 11。 抗体对 Fc 受体 IIIa-V158 的结合。 空心圆形代表 HERCEPTIN (trastuzumab)，空心正方形代表 RITUXAN(rituximab)，空心三角形代表具有 5 Man5(7-9无岩藻糖基聚糖 ) 的抗受体抗体，空心菱形代表具有 16 Man5(14.6无岩 藻糖基

47、聚糖 ) 的抗受体抗体，而实心圆形代表具有 62 Man5(11无岩藻糖基聚糖 ) 的 抗受体抗体。 0046 图 12。 抗体对 Fc 受体 IIIa-F158 的结合。 空心圆形代表 HERCEPTIN (trastuzumab)，空心正方形代表 RITUXAN(rituximab)，空心三角形代表具有 5 Man5(7-9无岩藻糖基聚糖 ) 的抗受体抗体，空心菱形代表具有 16 Man5(14.6无岩 藻糖基聚糖 ) 的抗受体抗体，而实心圆形代表具有 62 Man5(11无岩藻糖基聚糖 ) 的 抗受体抗体。 0047 发明详述 0048 I. 定义 0049 “抗体依赖性细胞介导的细胞毒

48、性” 和 “ADCC” 指由细胞介导的反应，其中 表达 Fc 受体 (FcR) 的非特异性细胞毒性细胞 ( 例如天然杀伤 (NK) 细胞，嗜中性粒细胞 和巨噬细胞 ) 识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。 介导 ADCC 的主要细 胞，NK 细胞，只表达 FcRIII，而单核细胞表达 FcRI，FcRII 和 FcRIII。 Ravetch and Kinet， Annu.Rev.Immunol.9 ：457-492(1991) 第 464 页表 3 总结了造血细胞上的 FcR 表达。 为了评估目的分子的 ADCC 活性，可进行体外 ADCC 测定法，诸如美国专利 No.5,500,3

49、62 或 5,821,337 中所记载的。 可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核 细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。 或者 / 另外，可在体内评估目的分子的 ADCC 活性，例如在动物模型中，诸如 Clynes et al.，PNAS(USA)95 ：652-656(1998) 中所披露 的。 0050 “人效应细胞” 指表达一种或多种 FcR 并行使效应器功能的白细胞。 优选的 是，该细胞至少表达 FcRIII 并行使 ADCC 效应器功能。 介导 ADCC 的人白细胞的例子 包括外周血单个核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜 中性粒细胞，优选 PBMC 和 NK 细胞。 效应细胞可以从其天然来源分离，例如如本文所 述从血液或 PBMC 分离。 0051 术语 “Fc 受体” 或 “FcR” 用于描述结合抗体 Fc 区的受体。 优选的 FcR 是 天然序列人 FcR。 此外，优选的 FcR 是结合 IgG 抗体的 FcR( 受体 )，包括 FcRI， 说 明 书 CN 102027009 A CN 102027024 A6/21 页 11 FcRII 和 FcRIII 亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。 FcRII 受 体包括 FcRIIA(“活化受体”) 和 FcRIIB(“