S100A4蛋白的纯化与鉴定.pdf

1、10申请公布号CN102020708A43申请公布日20110420CN102020708ACN102020708A21申请号200910070460022申请日20090917C07K14/435200601C07K1/36200601C07K1/34200601C07K1/22200601G01N27/447200601G01N33/54820060171申请人中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所地址300050天津市和平区大理道一号72发明人王天辉刘洪涛徐传香刘子泉陈学伟崔博佘晓俊张娜马强54发明名称S100A4蛋白的纯化与鉴定57摘要本发明公开了一种S100A4蛋白的纯化与

2、鉴定方法。本发明采用金属螯合层析法对表达载体PBV220S100A4的表达产物纯化后，进行SDSPAGE鉴定和WESTERNBLOT鉴定。为了加快纯化速度，防止蛋白在纯化过程中降解，采用GEHEALTHHITRAPDESALTING柱进行脱盐处理。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN102020722A1/1页21权利要求1所述的S100A4蛋白的纯化与鉴定，其特征在于包括如下步骤1S100A4蛋白的纯化将金属鳌合层析柱GEHEALTH连接AKTAFPLC蛋白纯化仪，并以约5倍体积的结合缓冲液平衡至基线。平衡以后，将破碎上清以结合缓

3、冲液稀释35倍以045M的除菌滤器过滤除菌后以3ML/MIN的流速上样，收集穿透液。以结合缓冲液平衡至基线，用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，以3ML/管收集A280峰，进行SDSPAGE鉴定和纯度鉴定。2S100A4蛋白的脱盐采用GEHEALTHHITRAPDESALTING柱进行脱盐处理，程序参照该层析柱说明书，简言之，缓冲液为生理盐水缓冲液，平衡柱子35个柱床体积后，用注射器手推上样，上样过程中弃去所有的流出液，上样完毕后，将层析柱连接FPLC系统，监测A280值与电导，进行SDSPAGE分析3蛋白鉴定ASDSPAGE鉴定将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取25L，再加入25L的2SDS上样缓

4、冲液，混匀；取破碎后的沉淀少许，加入25L的PBS重悬后，再加入25L的2SDS上样缓冲液，混匀；将上述两者100煮沸5MIN，并短暂离心，进行SDSPAGE电泳，鉴定其表达形式。BWESTERNBLOT鉴定按照常规WESTERNBLOT法操作规程操作，以兔抗S100A4来源SANTACLOUSE公司为抗，进行鉴定所表达的S100A4蛋白。权利要求书CN102020708ACN102020722A1/4页3S100A4蛋白的纯化与鉴定技术领域0001本发明涉及一种蛋白分子的纯化与鉴定。具体的说，本发明涉及一种具有高效表达活性的S100A4蛋白分子的纯化与鉴定。背景技术0002S100A4蛋白是

5、以非共价键结合二聚体存在于细胞内，而以共价结合二聚体分泌到细胞外。推测CA2结合后可导致S100A4蛋白构型改变，在表面暴露出新的结合位点，从而可与一系列靶标结合。胞外基质中的S100A4蛋白是一种单体和二聚体共存的状态，其比例受CA2结合程度的影响；胞内S100A4蛋白的同源二聚体和异源二聚体形式也是同时存在。因此，从S100A4蛋白可形成同源二聚体、异源二聚体、寡聚体的多种形式来看，其结构具有很强的可变性，这可能也是它在体内具有多种生物学功能的结构基础。0003S100A4蛋白与肿瘤的发生、转移及预后密切相关，参与血管生成、细胞外基质重建等生命过程。因此，构建S100A4蛋白载体、表达并纯

6、化S100A4蛋白，可以用于与P53等靶分子相互作用的基础研究，以揭示其作用机制。发明内容0004本发明提供了一种纯化与鉴定S100A4蛋白的方法。该方法包括如下步骤00051S100A4蛋白的纯化0006将层析柱连接AKTAFPLC蛋白纯化仪，并以约5倍体积的1BINDINGBUFFER平衡至基线。0007平衡以后，将破碎上清以1BINDINGBUFFER稀释35倍以045M的除菌滤器过滤除菌后以3ML/MIN的流速上样，收集穿透液。0008以1BINDINGBUFFER平衡至基线，用ELUTIONBUFFER洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，以3ML/管收集蛋白峰，进行SDSPAGE鉴定和纯度鉴

7、定。00092S100A4蛋白的脱盐0010为了加快纯化速度，防止蛋白在纯化过程中降解，采用GEHEALTHHITRAPDESALTING柱进行脱盐处理，程序参照该层析柱说明书，简言之，缓冲液为生理盐水缓冲液，平衡柱子35个柱床体积后，用注射器手推上样，上样过程中弃去所有的流出液，上样完毕后，将层析柱连接FPLC系统，监测紫外和电导，收集相应紫外峰，所需蛋白先洗脱，盐类等小分子后洗脱，收集蛋白峰，进行SDSPAGE分析00113蛋白鉴定0012ASDSPAGE鉴定0013将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取25L，再加入25L的2SDS上样缓冲液，混合均匀；0014取破碎后的沉淀少许，加入25L

8、的PBS后，再加入25L的2SDS上样缓冲液，混合均匀；说明书CN102020708ACN102020722A2/4页40015将上述两者100煮沸5MIN，并短暂离心，进行SDSPAGE电泳，鉴定其表达形式。0016BWESTERNBLOT鉴定0017处理好蛋白样品，进行SDSPAGE电泳，记录加样顺序。0018电泳完毕后，取下凝胶，标记方向，切取所需大小的胶。0019量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜；6张滤纸，大小同凝胶。0020将滤纸用转移BUFFER湿润，取3张叠放于半干转移仪上，将硝酸纤维素膜叠放上去后，把大小相同的凝胶叠放上去，再将转移BUFFER湿润的滤纸3张叠放上去。002

9、1检查气泡，接通半干转移仪，以1MA/CM2的电量，开始转移1H15H。0022转移完毕后，取下硝酸纤维素膜，放入平皿，加入1520ML的B液，封闭过夜轻摇0023封闭结束后，用D液洗膜3次，2MIN/次，加入1520ML的用C液稀释好的一抗兔抗S100A4，轻摇1H。0024再用D液洗膜3次，2MIN/次，加入1520ML的用C液稀释好的酶标二抗羊抗兔IGGHRP，轻摇1H。0025再用D液洗膜3次，2MIN/次，加入A液配制好的DAB035G/L10ML，再加入H2O230L观察特异性反应，23MIN后，用2MOL/L的硫酸终止反应，用蒸馏水冲洗膜附图说明0026图1为S100A4的SDS

10、PAGE电泳分析0027图2为纯化后S100A4的SDSPAGE电泳分析0028图3为S100A4的WESTERNBLOT鉴定结果具体实施方式0029下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明00301S100A4蛋白的纯化0031将层析柱连接AKTAFPLC蛋白纯化仪，并以约5倍体积的1BINDINGBUFFER平衡至基线。0032平衡以后，将破碎上清以1BINDINGBUFFER稀释35倍以045M的除菌滤器过滤除菌后以3ML/MIN的流速上样，收集穿透液。0033以1BINDINGBUFFER平衡至基线，用ELUTIONBUFFER洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，以3ML/管收集蛋白峰，进行S

11、DSPAGE鉴定和纯度鉴定。00342S100A4蛋白的脱盐0035为了加快纯化速度，防止蛋白在纯化过程中降解，采用GEHEALTHHITRAPDESALTING柱进行脱盐处理，程序参照该层析柱说明书，简言之，缓冲液为生理盐水缓冲液，平衡柱子35个柱床体积后，用注射器手推上样，上样过程中弃去所有的流出液，上样完毕后，将层析柱连接FPLC系统，监测紫外和电导，收集相应紫外峰，所需蛋白先洗脱，盐类等小分子后洗脱，收集蛋白峰，进行SDSPAGE分析说明书CN102020708ACN102020722A3/4页500363蛋白鉴定0037ASDSPAGE鉴定0038将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取2

12、5L，再加入25L的2SDS上样缓冲液，混合均匀；0039取破碎后的沉淀少许，加入25L的PBS后，再加入25L的2SDS上样缓冲液，混合均匀；0040将上述两者100煮沸5MIN，并短暂离心，进行SDSPAGE电泳，鉴定其表达形式。0041BWESTERNBLOT鉴定0042处理好蛋白样品，进行SDSPAGE电泳，记录加样顺序。0043电泳完毕后，取下凝胶，标记方向，切取所需大小的胶。0044量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜；6张滤纸，大小同凝胶。0045将滤纸用转移BUFFER湿润，取3张叠放于半干转移仪上，将硝酸纤维素膜叠放上去后，把大小相同的凝胶叠放上去，再将转移BUFFER湿润的

13、滤纸3张叠放上去。0046检查气泡，接通半干转移仪，以1MA/CM2的电量，开始转移1H15H。0047转移完毕后，取下硝酸纤维素膜，放入平皿，加入1520ML的B液，封闭过夜轻摇0048封闭结束后，用D液洗膜3次，2MIN/次，加入1520ML的用C液稀释好的一抗兔抗S100A4，轻摇1H。0049再用D液洗膜3次，2MIN/次，加入1520ML的用C液稀释好的酶标二抗羊抗兔IGGHRP，轻摇1H。0050再用D液洗膜3次，2MIN/次，加入A液配制好的DAB035G/L10ML，再加入H2O230L0051观察特异性反应，23MIN后，用2MOL/L的硫酸终止反应，用蒸馏水冲洗膜2结果00

14、5221重组蛋白的纯化0053菌体经超声破碎后显示，S100A4以上清形式存在。融合蛋白C端表达6HISTAG便于纯化。6HISTAG的加入并不影响其可溶性表达3234。对将破碎后的菌液上清用AMERSHAM公司生产的全自动快速液相色谱系统FPLC过NI柱，纯化过程见图，当洗脱剂咪唑浓度为10MMOL/L时有很多杂蛋白被洗下，随即采用咪唑的线形洗脱，当咪唑浓度到达100MMOL/L时目的蛋白开始被洗下，咪唑浓度达到100MMOL/L时目的蛋白达到最大值。005422重组蛋白的脱盐0055将纯化后的蛋白通过脱盐柱进行脱盐，每5ML层析柱上样15ML，手推上样后连接FPLC系统，流速3ML/MIN

15、，紫外值迅速上升，目的蛋白很快洗下，但此时溶液电导尚未上升，紫外吸收峰快下降至底端时，电导迅速开始上升，此时蛋白收集完毕，同时，由于金属螯合层析的缓冲液中咪唑的作用，紫外吸收值又开始上升，出现另一个小的紫外吸收峰，待电导与紫外值都下降至基线后即可进行下一次脱盐005623重组S100A4蛋白的WESTERNBLOT分析说明书CN102020708ACN102020722A4/4页60057以PBV220空菌为对照，上样量15L，对称上样，进行SDSPAGE电泳，电泳完毕后去掉积层胶，把分离胶中间切开，一半用考马斯亮蓝染色，一半进行WESTEMBLOT分析，以小鼠抗组氨酸标签抗体作为一抗，以HRP羊抗小鼠IGG作为二抗，DAB显色，可以看到，在11KD处，PBV220空菌为对照未见显色条带，纯化后的S100A4制品与PBV220S100A4诱导表达产物均有特异条带，表明S100A4获得了表达并进行了有效纯化。在蛋白电泳图上约44KD处未见明显条带，但在WESTERNBLOT图上有明显条带，推测可能是S100A4形成的聚体。图3说明书CN102020708ACN102020722A1/1页7图1图2图3说明书附图CN102020708A