癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件CPE及其应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101638655 B (45)授权公告日 2011.05.04 CN 101638655 B *CN101638655B* (21)申请号 200910101856.7 (22)申请日 2009.09.03 C12N 15/11(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 杭州安倍生物科技有限公司 地址 310005 浙江省杭州市叶青苑 2 幢 2 单 元 103 室 (72)发明人 曹江 贾振宇 (74)专利代理机构 杭州天欣专利事务所 33209 代理人 陈红 WO 02053760 A2,

2、2002.07.11, 全文 . CN 101307327 A,2008.11.19, 全文 . Okabe S 等 .Adenovirus-mediated prodrug-enzyme therapy for CEA-producing colorectal cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol. .2003, 第 129 卷 ( 第 6 期 ),367-373. 王梦筠等 . 选择性杀伤 CEA 阳性结直肠癌细 胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用 .上 海交通大学学报 ( 医学版 ) .2009, 第 29 卷 ( 第 7 期 ),802-807.

3、 (54) 发明名称 癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种新型肿瘤靶向性基因表达元 件， 我们将其命名为CPE。 该元件为一种DNA分子， 能够在癌胚抗原阳性的肿瘤细胞内特异地表达， 可以有效地阻断肿瘤细胞内的 DNA 复制， 使细胞 周期因 DNA 复制受阻而无法进行下去， 从而达到 特异性抑制肿瘤细胞增殖的效果。可用于制备肿 瘤基因治疗药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐益君 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 CN 101638655 B1/1 页

4、 2 1.一种癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件CPE， 其特征是 ： 一种DNA分子， 为如SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序列。 2. 一种基于如权利要求 1 所述的 CPE 而改造的用于构建其他的靶向性基因表达元件， 为一种 DNA 分子， 具有如 SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序列， 其中第 7 位至第 375 位为人 CEA 基因翻译起始点 ( 定为 +1) 上游第 -407 位至第 -39 位， 该区域含有 CEA 的基本启动子和第 一外显子 5 非翻译区部分序列， 为 CEA 阳性细胞表达调控序列 ； 第 376 位至第 1599 位为 3 个3种串联连接的针对

5、人DNA聚合酶d催化亚基p125基因的人工设计的microRNA ； 第1600 位至第 1948 位为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区， 为基因表达提供转录终止信号。 3.一种如权利要求1所述的癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件CPE在制备靶向性 肿瘤基因治疗药物中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征是 ： 所述的癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达 元件 CPE 在制备肠癌药物中的应用。 5. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征是 ： 所述的癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达 元件 CPE 在制备胃癌药物中的应用。 6. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征是 ： 所述的癌胚抗

6、原阳性细胞靶向性基因表达 元件 CPE 在制备乳癌药物中的应用。 7. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征是 ： 所述的癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达 元件 CPE 在制备肺癌药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101638655 B1/7 页 3 癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 及其应用 技术领域 0001 本发明属生物技术， 涉及基因表达调控， 具体地说， 涉及一种特异性针对癌胚抗原 阳性肿瘤细胞的靶向性基因表达元件 CPE 的设计、 制备及其在癌胚抗原阳性的肿瘤细胞内 特异表达、 其产物可以有效地阻断肿瘤细胞内的DNA复制， 使细胞周期因DNA复制受阻而无 法进行下

7、去， 从而达到抑制细胞增殖的作用。 本发明可用于制备靶向性肿瘤基因治疗药物。 背景技术 0002 恶性肿瘤是目前人类主要 “杀手” 之一， 近年来随着人们生活方式及环境的改变， 其发病率呈上升趋势， 在许多城市已成为第一位死亡原因， 在农村位列第二位。肺癌、 胃肠 道肿瘤、 乳癌等在我国是最常见的危害极大的恶性肿瘤， 虽然目前可以通过手术和化疗等 常规方式进行治疗， 对较早期发现的上述肿瘤能收到一定的甚至较好的疗效， 但对于较晚 期的上述肿瘤的疗效和预后均不理想。 0003 被称为肿瘤治疗新模式的生物治疗目前正显示出越来越良好的应用前景。 在各种 肿瘤生物治疗手段中， 基因治疗始终是一个主要方

8、向， 我国研制的世界上第一个正式进入 临床使用的基因药物、 针对许多肿瘤细胞中发生突变的抑癌基因 p53 的、 可表达野生型 p53 的腺病毒注射液 “今又生” 即是其代表。随着医学分子生物学技术和知识的飞速发展， 各种 先进的分子生物学手段都运用到肿瘤的基因治疗研究中。 但是由于肿瘤的发生发展涉及众 多基因， 而目前的研究大都仅针对个别靶基因， 因此， 这些研究虽然都显示出较好的细胞水 平的体外抑瘤效果甚至荷瘤动物模型的体内抑瘤效应， 但实际效果并不理想。因此， 探索、 尝试新的肿瘤基因治疗手段具有十分重要的意义。 0004 正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变， 有相

9、当多的 基因表现出过度表达的现象， 尤其是一些促进细胞生长、 侵袭等恶性表型的基因的过量表 达。 针对肿瘤中异常表达的基因， 人们设计了许多靶向性基因治疗的方法， 其中以封闭促进 肿瘤生长、 侵袭等相关基因的表达的研究是一个相当热门的领域。 在以往大量的研究中， 人 们利用反义RNA(antisense RNA)对肿瘤细胞高表达基因进行封闭， 但由于反义RNA本身存 在的限制， 这类研究在抑制肿瘤细胞生长、 控制细胞侵袭迁移等方面虽然取得了较大的成 绩， 其封闭基因表达的效果仍不理想。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种抑制肿瘤效果好、 适应性广、 安全性好的 癌胚抗原阳性

10、细胞靶向性基因表达元件 CPE。 0006 本发明还涉及癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 而改造的用于构建其 他的靶向性基因表达元件 0007 本发明还涉及癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 在制备靶向性肿瘤基 因治疗药物中的应用。 0008 本发明还涉及癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 在制备肠癌药物中的 说 明 书 CN 101638655 B2/7 页 4 应用。 0009 本发明还涉及癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 在制备胃癌药物中的 应用。 0010 本发明还涉及癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 在制备乳癌药物中的 应用。 0011

11、本发明还涉及癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 在制备肺癌药物中的 应用。 0012 本发明提供的 CEA 阳性肿瘤细胞靶向性基因表达元件 CPE 为一种 DNA 分子， 具有 如 SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序列。其中第 7 位至第 375 位为人 CEA 基因翻译起始点 ( 定 为 +1) 上游第 -407 位至第 -39 位， 该区域含有 CEA 的基本启动子和第一外显子 5 非翻译 区部分序列， 为 CEA 阳性细胞表达调控序列 ； 第 376 位至第 1599 位为 3 个 3 种串联连接的 针对人 DNA 聚合酶 基因的人工设计的 microRNA ； 第 16

12、00 位至第 1948 位为牛生长激素 基因多聚腺苷酸信号区， 为基因表达提供转录终止信号。 0013 该表达元件在导入 CEA 阳性的肿瘤细胞后， 可以在细胞中表达针对 DNA 聚合酶 的人工microRNA， 并有效抑制细胞内DNA聚合酶的表达， 进而影响到DNA复制， 最终阻断 细胞周期的进行， 抑制细胞增殖。 0014 本发明提供该表达元件可用于构建的靶向性基因治疗载体， 进而制备基因治疗 药物， 用于 CEA 阳性的肿瘤的靶向基因治疗。该表达元件中针对人 DNA 聚合酶 的人工 microRNA 序列可以用于其它表达载体达到抑制相应细胞中 DNA 聚合酶 的表达目的。 0015 小干

13、扰 RNA(small interfering RNA， siRNA) 的发现为人为干预细胞中基因的表 达提供了一个有力的工具。 利用化学合成的双链形式的siRNA， 或是由III型启动子带动转 录的结构类似的小发卡样 RNA(small hairpin RNA， shRNA)， 可以通过序列特异性匹配原则 降解靶基因， 从而对靶基因的表达进行有效的抑制， 因此也被尝试应用于基因治疗。 但是由 于化学合成的siRNA代价太高， 而shRNA的表达又不利于调控， 这些因素大大地限制了这一 技术的应用。 0016 微小 RNA(microRNA) 是细胞内天然存在的一种小分子 RNA， 是在基因转

14、录后水平 进行表达调控的一种重要方式， 能在序列完全匹配的情况下降解靶基因 mRNA， 也可以在序 列非完全匹配的情况下抑制靶基因的翻译， 是目前生命科学领域中的一个研究热点， 在肿 瘤相关 microRNA 方面也有大量研究， 而且大都集中在正常细胞和肿瘤细胞之间表达有差 异的各种天然 microRNA 的发现以及功能鉴定。 0017 由于天然 microRNA 是由 II 型启动子带动转录， 因此如果人工设计类似的 microRNA分子， 也应该可以由II型启动子引导转录， 而II型启动子的特点是其转录启动功 能可以调控， 所以其下游的人工 miRNA 的表达应该可以受到人为控制， 而 m

15、icroRNA 的作用 方式最近的一些文献报道已证实这一设想。 0018 在本发明中我们选择细胞周期中的DNA复制过程为作用点， 设计人工microRNA的 序列， 抑制 DNA 复制中必需的 DNA 聚合酶 的催化亚基 p125 表达。由于 DNA 的复制是一 个复杂而又精密调控的过程， 主要由 DNA 聚合酶 、 和 等酶催化、 以原有的 DNA 链为 模板进行的半保留复制， 因此对 DNA 聚合酶 表达的抑制将有效阻断细胞的 DNA 复制， 从 而使细胞周期因 DNA 无法复制而停止， 进而抑制细胞的增殖。 说 明 书 CN 101638655 B3/7 页 5 0019 为了达到对肿瘤

16、细胞的靶向性作用， 针对我国高发的肺癌、 胃肠道肿瘤、 乳癌等 恶性肿瘤， 利用在胚胎细胞中表达而在正常成人细胞中不表达、 但在上述肿瘤细胞中又常 会重新表达胚胎性抗原癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen， CEA) 的特点， 重组了 CEA 基因上游的表达调控序列， 用来调控人工设计的 microRNA 的表达。这一基因表达元件 在导入正常细胞后不会有任何表达， 而在导入 CEA 阳性的肿瘤细胞后， 可以表达出相应的 microRNA 并有效地阻断肿瘤细胞的 DNA 复制， 从而达到靶向性抑制肝癌细胞的生长。 0020 基于本发明的思路， 还可以 DNA 聚合酶 基因

17、的其它位点做为靶序列进行人工 microRNA的设计， 或是以DNA复制过程中其它重要基因作为靶基因来进行DNA复制的阻断， 从而抑制细胞增殖。 0021 本发明同现有技术相比具有以下优点及效果 ： 0022 利用本发明提供的表达元件可以制备的基因治疗药物， 其特点在于以多种肿瘤细 胞均重新表达的胚胎性抗原癌胚抗原为肿瘤细胞特异性表达调控手段、 以肿瘤细胞快 速生长分裂所需的 DNA 聚合酶 为作用靶点进行表达抑制， 有效地引起细胞周期阻断， 特 异性地抑制 CEA 阳性的肿瘤细胞的增殖。 附图说明 0023 图 1 为 CEA 阳性细胞表达调控序列 PCR 产物电泳图 ； 0024 图 2

18、为针对人 DNA 聚合酶 的三种人工 microRNA 构建 PCR 产物电泳图 ； 0025 图 3 为 Western blot 法检测 CPE 对 DNA 聚合酶 表达的抑制的比较图 ； 0026 图 4 为 MTT 法检测结果。 具体实施方式 0027 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明， 以下实施例是对本发明的解释而 本发明并不局限于以下实施例。 0028 实施例 1 ： 0029 人 CEA 阳性细胞表达调控序列的克隆 ： 0030 首先从 GenBank 检索得到包含人 CEA 基因 5 侧翼及第一个外显子的基因组 DNA 序列 (GenBank 登录号 ： Z21818)

19、， 然后参考 Nyati MK 等人的文献 (Cancer Research 62， 2337-2342， 2002)， 设计并合成引物1和引物2， 利用聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction， PCR) 扩增 CEA 翻译起始点 ( 定为 +1) 上游包含基本启动子和部分第一外显子的 5 非翻译区在内的 -407 至 -39 位序列。引物 1 序列为 ： 5 -AGA TCT CCC GGG ACC CTG CTG GGT TTC-3 、 引物 2 序列为 ： 5 -GGA TCC AGC TTG AGT TCC AGG AAC G-3 ， 以人肠癌细胞 SW6

20、20 基因组 DNA 为模板， 用上述引物进行核酸扩增， 获得 381bp 的扩增产物。 0031 将上述扩增产物以 T-A 克隆的方式分别克隆至 pGEM T-easy 载体 (Promega 公 司， 美国 )， 参见图 1， 其中泳道 1 为 1Kb Plus DNA 分子量标记， 泳道 2 为 pGEM T-easy/CEA 经 EcoR I 酶切， 如克隆成功， 则会出现两个条带， 大的一个条带为约 3.0kb 的载体 pGEM T-easy， 小的一个条带为约 0.4kb 的插入片段 CEA 阳性细胞表达调控序列， 如果未克隆成 功， 则仅有一个条带， 即约 3.0kb 的载体 p

21、GEM T-easy， 从图中可以看出 PCR 产物克隆成功， 条带大小与预期完全相符。 经DNA序列测定并与基因组DNA序列(GenBank登录号 ： Z21818) 说 明 书 CN 101638655 B4/7 页 6 核对验证其正确性。测序结果如下， 其中下划线部分分别为两端加的 Bgl II 和 BamH I 位 点， 加框部分为人 CEA 基因翻译起始点上游第 -407 位至第 -39 位序列。 0032 AGATCTCCCG GGACCCTGCT GGGTTTCTCT GTCACAAAGG AAAATAATCC CCCTGGTGTG 60 0033 ACAGACCCAA GGAC

22、AGAACA CAGCAGAGGT CAGCACTGGG GAAGACAGGT TGTCCTCCCA 120 0034 GGGGATGGGG GTCCATCCAC CTTGCCGAAA AGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG 180 0035 GAAAAAAGAG GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA GGACACCTGA 240 0036 ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC 300 0037 TCAGGGCAGA GGGA

23、GGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG ACAAAACGTT 360 0038 CCTGGAACTC AAGCTGGATC C 381 0039 针对人 DNA 聚合酶 基因的人工 microRNA 的克隆 ： 0040 从 GenBank 检 索 得 到 人 DNA 聚 合 酶 基 因 的 mRNA 序 列 (GenBank 登 录 号 ： NM_006231)， 利用网上软件分析该 mRNA 序列上合适的位点， 确定 3 个人工 microRNA 的作用 靶点， 设计合成引物 E-1S ： 5 -TGC TGT TGA CAG TGA GCG CGG

24、 AAG CAC TTT CTC CGG AAA TTA GTG AAG CCACAG ATG TA-3 、 E-1R ： 5 -TCC GAG GCA GTA GGC AAG GAA GCA CTT TCT CCG GAA ATT ACATCT GTG GCT TCA CTA AT-3 、 E-2S ： 5 -TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG TTC CCA CTT GCTGCT CAA TTA GTG AAG CCA CAG ATG TA-3 、 E-2R ： 5 -TCC GAG GCA GTA GGC ACG GTT CCCACT TGC TGC TCA ATT

25、ACA TCT GTG GCT TCA CTA AT-3 、 E-3S ： 5 -TGC TGT TGA CAG TGAGCG AGG AGA TTG TTT CAG AAG ATA TTA GTG AAG CCA CAG ATG TA-3 、 E-3R ： 5 -TCC GAGGCA GTA GGC AGG GAG ATT GTT TCA GAA GAT ATT ACA TCT GTG GCT TCA CTA AT-3 、 PS ： 5 -AGA TCT GAT CCA AGA AGG TAT ATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3 和 PR ： 5 -GGA TCC AT

26、CGTA GCC CTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3 。先分别将引物 E-1S 和引物E-1R、 引物E-2S和引物E-2R、 引物E-3S和引物E-3R配对进行重叠延伸PCR， 均分别 得到 97bp 的扩增产物 E-1p、 E-2p 和 E-3p， 再分别以这些扩增产物为模板， 用引物 PS 和引 物 PR 进行 PCR 扩增， 再分别得到 142bp 的扩增产物 E-1f、 E-2f 和 E-3f， 参见图 2， 其中泳道 1、 3、 4 分别为三种不同人工 microRNA 的 PCR 产物， 均显示出 142bp 的 PCR 产物条带， 泳道 2 为 D

27、L2000 分子量标记， 说明按照设计进行的人工 microRNA 的 PCR 合成成功。 0041 上述 142bp 的扩增产物以 T-A 克隆的方式分别克隆至 pGEM T-easy 载体， 经 DNA 测序验证其正确性。这些即为针对人 DNA 聚合酶 基因 3 个不同靶点的人工 microRNA 序 列。为了加强其作用效果， 每一种人工 microRNA 分别用限制性内切酶 BamH I 和 Bgl II 双 酶切后回收该人工 microRNA 序列并重新插入同一载体的 BamH I 位点， 获得各有 3 个串联 连接的人工 microRNA 序列， 再将它们串联连接在一起成为完整的针对

28、人 DNA 聚合酶 基 因的人工 microRNA 序列。 0042 肿瘤靶向性基因表达元件 CPE 的构建及腺病毒载体的制备 ： 0043 首先构建 pDC312-BGHpA 载体 ： 将腺病毒穿梭质粒 pDC312 载体 (Microbix 公司， 美国 ) 用限制性内切酶 Xba I 单酶切开， 用 Klenow 酶补平， 再用限制性内切酶 HindIH 单酶 切， 去掉 Xba I 到 HindIII 之间的部分 ( 从 HindIII、 Sac I、 Ecl136II、 Acc I、 Sal I 到 Xba I)， 回收部分一端为平端， 另一端为 HindIII 粘性末端。pcDNA

29、3.1(+) 载体 (Invitrogen 公 司， 美国 ) 用限制性内切酶 PvuII 和 HindIII 双酶切， 回收包括 HindIII、 Asp718、 Kpn I、 BamH I、 BstXI、 EcoR I、 EcoR V、 BstXI、 Not I、 Xho I、 Xba I、 Dra II、 Apa I 和 Pme I 多克 说 明 书 CN 101638655 B5/7 页 7 隆位点和牛生长因子基因多聚腺苷酸信号(BGHpA)的片段， 一端为HindIII粘性末端， 另一 端为 PvuII 的平端。将上述两个片段连接起来， 即成 pDC312-BGHpA 载体， 可在多

30、克隆位点 上插入启动子和目的基因编码区。 0044 再将前面所述的 CEA 阳性细胞表达调控序列从载体上用限制性内切酶 BamH I 和 Bgl II双酶切后回收， 并插入pDC312-BGHpA的BamH I位点， 得到带有CEA阳性细胞表达调 控序列和 BGHpA 的腺病毒穿梭质粒。最后将串联连接的完整的针对人 DNA 聚合酶 基因 的人工 microRNA 序列从载体上用限制性内切酶 BamH I 和 Bgl II 双酶切后回收， 插入此穿 梭质粒的 BamH I 位点， 得到带有完整肿瘤靶向性表达元件 CPE 的腺病毒穿梭质粒， 酶切鉴 定结果与预期完全相符。 0045 将上述带有完整

31、肿瘤靶向性表达元件 CPE 的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒 pBHGlox(delta)E1， 3cre(Microbix公司， 美国)共转染腺病毒包装细胞293细胞， 得到带有 表达元件 CPE 的腺病毒载体。也就是完成了癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 的 制备。 0046 应用实施例 1 ： 0047 基因表达元件 CPE 对 CEA 阳性细胞 DNA 聚合酶 基因表达的抑制 0048 取对数生长期的CEA阳性的人肠癌细胞HR8348细胞， 按3105细胞/孔的密度接 种于6孔板中， 培养24小时使其贴壁并达到80的汇合度。 用培养基稀释上述带有表达元 件 CPE 的腺病毒，

32、 以感染复数 (multiplicity of infection， MOI) 为 100pfu/cell 感染细 胞， 48hr后中止作用， 提取细胞总蛋白， 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10分离胶， 5浓 缩胶)， 然后将蛋白转至PVDF膜， 封闭后与11000稀释的抗DNA聚合酶的抗体(Santa CruzBiotechnology， Inc.， 美国， DNA pol(93H3A) ： sc-56655， ) 于 4结合过夜， 用 TBST 洗膜 3 次， 再与 1 10000 稀释 HRP 标记的二抗 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司 ) 结合， 室温2小时后， 用TBST洗膜3

33、次， 然后用化学发光试剂盒(Roche公司， 美国)显影， X光片暴 光。 用无腺病毒感染的细胞作对照。 以GAPDH为内参照， 采用酶标抗体HRP-Anti-GAPDH(上 海康成生物技术有限公司 ) 同样进行检测。从图 3 中可看到， 感染带有表达元件 CPE 的腺 病毒的 CEA 阳性肠癌细胞 HR8348 中的 DNA 聚合酶 表达明显受到抑制。图中 1 为无病毒 感染的 HR8348 肠癌细胞 DNA 聚合酶 基因表达情况， 2 为带 CPE 的腺病毒以 MOI 100 感染 HR8348 肠癌细胞 48 小时后 DNA 聚合酶 基因表达情况。 0049 应用实施例 2 ： 0050

34、 基因表达元件 CPE 对 CEA 阳性细胞体外细胞生长抑制试验 (MTT 法 ) 0051 取对数生长期的人肠癌细胞 HR8348 和 HT-29， 均按 3105细胞 / 孔的密度接种 于 6 孔板中， 培养 24 小时使其贴壁。将带 CPE 的腺病毒以 MOI 为 200pfu/cell、 100pfu/ cell、 10pfu/cell 和 0pfu/cell 感染细胞。在病毒感染 48 小时后， 每孔加入 MTT 溶液 (5mg/ml)200l， 37继续培养 4hr， 中止培养。弃去培养上清液， 每孔加入 DMSO 2ml， 振荡 10min， 使结晶物充分溶解， 取100l在酶联

35、免疫检测仪上测定各样品570nm波长OD值。 每 组设立3复孔。 从图4可以看出， 不同MOI的带CPE的腺病毒对CEA阳性的肠癌细胞HR8348 和 HT-29 的生长均有不同程度的抑制， 且对 HR8348 的抑制作用强于对 HT-29 的抑制作用。 0052 此外， 需要说明的是， 本说明书中所描述的具体实施例， 其零、 部件的形状、 所取名 称等可以不同。 凡依本发明专利构思所述的构造、 特征及原理所做的等效或简单变化， 均包 说 明 书 CN 101638655 B6/7 页 8 括于本发明专利的保护范围内。 本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施 例做各种各样的修改或补

36、充或采用类似的方式替代， 只要不偏离本发明的结构或者超越本 权利要求书所定义的范围， 均应属于本发明的保护范围。 0053 虽然本发明已以实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明的保护范围， 任何熟 悉该项技术的技术人员， 在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰， 均应属于本 发明的保护范围。 0054 癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 电子序列 0055 杭州安倍生物科技有限公司 0056 癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件 CPE 及其应用 0057 1 0058 1 0059 1948 0060 DNA 0061 人工序列 0062 0063 癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表

37、达元件 CPE 0064 1 0065 AGATCTCCCG GGACCCTGCT GGGTTTCTCT GTCACAAAGG AAAATAATCCCCCTGGTGTG 60 0066 ACAGACCCAA GGACAGAACA CAGCAGAGGT CAGCACTGGG GAAGACAGGTTGTCCTCCCA 120 0067 GGGGATGGGG GTCCATCCAC CTTGCCGAAA AGATTTGTCT GAGGAACTGAAAATAGAAGG 180 0068 GAAAAAAGAG GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGAGGACA

38、CCTGA 240 0069 ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG CTGAGAAGTA CTCCTGCCCTAGGAAGAGAC 300 0070 TCAGGGCAGA GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTGACAAAACGTT 360 0071 CCTGGAACTC AAGCTGGATC TGATCCAAGA AGGTATATTG CTGTTGACAGTGAGCGCGGA 420 0072 AGCACTTTCT CCGGAAATTA GTGAAGCCAC AGATGTAATT TCCGGAGAAAGTGCTTCCT

39、T 480 0073 GCCTACTGCC TCGGACTTCA AGGGCTACGA TGGATCTGAT CCAAGAAGGTATATTGCTGT 540 0074 TGACAGTGAG CGCGGAAGCA CTTTCTCCGG AAATTAGTGA AGCCACAGATGTAATTTCCG 600 0075 GAGAAAGTGC TTCCTTGCCT ACTGCCTCGG ACTTCAAGGG CTACGATGGATCTGATCCAA 660 0076 GAAGGTATAT TGCTGTTGAC AGTGAGCGCG GAAGCACTTT CTCCGGAAATTAGTGAAGCC 72

40、0 0077 ACAGATGTAA TTTCCGGAGA AAGTGCTTCC TTGCCTACTG CCTCGGACTTCAAGGGCTAC 780 0078 GATGGATCTG ATCCAAGAAG GTATATTGCT GTTGACAGTG AGCGAGGTTCCCACTTGCTG 840 0079 CTCAATTAGT GAAGCCACAG ATGTAATTGA GCAGCAAGTG GGAACCGTGCCTACTGCCTC 900 0080 GGACTTCAAG GGCTACGATG GATCTGATCC AAGAAGGTAT ATTGCTGTTGACAGTGAGCG 960 00

41、81 AGGTTCCCAC TTGCTGCTCA ATTAGTGAAG CCACAGATGT AATTGAGCAGCAAGTGGGAA 1020 0082 CCGTGCCTAC TGCCTCGGAC TTCAAGGGCT ACGATGGATC TGATCCAAGAAGGTATATTG 1080 0083 CTGTTGACAG TGAGCGAGGT TCCCACTTGC TGCTCAATTA GTGAAGCCACAGATGTAATT 1140 0084 GAGCAGCAAG TGGGAACCGT GCCTACTGCC TCGGACTTCA AGGGCTACGATGGATCTGAT 1200 00

42、85 CCAAGAAGGT ATATTGCTGT TGACAGTGAG CGAGGAGATT GTTTCAGAAGATATTAGTGA 1260 0086 AGCCACAGAT GTAATATCTT CTGAAACAAT CTCCCTGCCT ACTGCCTCGGACTTCAAGGG 1320 说 明 书 CN 101638655 B7/7 页 9 0087 CTACGATGGA TCTGATCCAA GAAGGTATAT TGCTGTTGAC AGTGAGCGAGGAGATTGTTT 1380 0088 CAGAAGATAT TAGTGAAGCC ACAGATGTAA TATCTTCTGA

43、AACAATCTCCCTGCCTACTG 1440 0089 CCTCGGACTT CAAGGGCTAC GATGGATCTG ATCCAAGAAG GTATATTGCTGTTGACAGTG 1500 0090 AGCGAGGAGA TTGTTTCAGA AGATATTAGT GAAGCCACAG ATGTAATATCTTCTGAAACA 1560 0091 ATCTCCCTGC CTACTGCCTC GGACTTCAAG GGCTACGATG GATCCACTAGTCCAGTGTGG 1620 0092 TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC GGCCGCTCGA

44、GTCTAGAGGGCCCGTTTAAA 1680 0093 CCCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTTTGCCCCTCCC 1740 0094 CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAATAAAATGAGG 1800 0095 AAATTGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGGGTGGGGCAGG 1860 0096 ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCGGTGGGCTCTA 1920 0097 TGGCTTCTGA GGCGGAAAGA ACCAGCTG 1948 0098 / 说 明 书 CN 101638655 B1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101638655 B2/2 页 11 图 4 说 明 书 附 图