用于血管造影术的多色的不同大小的颗粒.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101616692 B (45)授权公告日 2013.05.08 CN 101616692 B *CN101616692B* (21)申请号 200780033040.4 (22)申请日 2007.07.06 60/806,711 2006.07.06 US A61K 49/00(2006.01) A61K 51/12(2006.01) (73)专利权人 纽约市哥伦比亚大学信托人 地址 美国纽约 专利权人 内布拉斯加大学评议会 (72)发明人 SR塔里 GR巴里莱 UB科姆佩拉 (74)专利代理机构 北京攀腾专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11374 代理人 彭蓉

2、游舜华 WO 2005/084710 A2,2005.09.15, 说明书实 施例 1-7. Mingyong Han et al.Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules.nature biotechnology .2001, 第 19 卷 631-635. Mohamed G. Qaddoumi et al.The Characteristics and Mechanisms of Uptake of PLGA Nanoparticles in Rabbit Conjunctiv

3、al Epithelial Cell Layers.Pharmaceutical Research .2004, 第 21 卷 ( 第 4 期 ),641-648. M.Lansalot et al.Elaboration of fluorescent and highly magnetic submicronic polymer particles via a stepwise heterocoagulation process.Colloid Polym Sci .2005, 第 283 卷 1267-1277. (54) 发明名称 用于血管造影术的多色的不同大小的颗粒 (57) 摘要 本

4、发明包括用于评估血流量、 血屏障泄露和 血管泄漏的不同粒径的多色颗粒。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2009.03.06 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2007/015546 2007.07.06 (87)PCT申请的公布数据 WO2008/005514 EN 2008.01.10 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李佳博 权利要求书 3 页 说明书 13 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书3页 说明书13页 附图9页 (10)授权公告号 CN 101616692 B CN 10161669

5、2 B *CN101616692B* 1/3 页 2 1. 一种组合物， 其包括一系列颗粒组， 每一颗粒组包含具有独特标记物的颗粒， 与在组 合物里的其他颗粒组相比， 所述标记物提供独特信号和不同的平均直径， 其中 ： 至少一个颗粒组含有聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 聚 ( 丙交酯 - 共 - 乙交酯 )、 聚亚烷 基二醇、 泊洛沙姆、 聚乙烯吡咯烷酮、 异丁烯酸酯、 肽、 类蛋白微球体、 脂质、 脂质体或多糖或 其组合 ； 并且 颗粒组的标记物包括荧光素、 异硫氰酸荧光素、 吲哚菁绿、 若丹明红、 太平洋蓝、 德克萨 斯红、 alexa-532、 羟基香豆素、 氨基香豆素、 甲

6、氧基香豆素、 氨基甲基香豆素、 级联蓝、 荧光 黄、 P- 藻红蛋白、 R- 藻红蛋白、 丽丝胺若丹明 B、 别藻蓝蛋白、 俄勒冈绿、 四甲基若丹明、 丹磺 酰、 monochlorobimane、 钙黄绿素、 荧光蛋白或其组合。 2. 根据权利要求 1 的组合物， 其中至少一个颗粒组包括生物可降解的颗粒， 或至少一 个颗粒组包括非生物可降解的颗粒， 或其中至少一个颗粒组包括非生物可降解和可生物降 解材料的组合。 3. 权利要求 1 的组合物， 其中每一颗粒组可溶于水相环境。 4. 权利要求 1 的组合物， 其中标记物是共价结合在颗粒上、 吸附到颗粒上、 包封在颗粒 内或其组合。 5. 权利要

7、求 1 的组合物， 其中至少一个颗粒组的独特标记物包括发光标记物、 红外标 记物、 磁性标记物、 放射性标记物或其组合。 6. 根据权利要求 1 的组合物， 其中蛋白质是白蛋白。 7. 权利要求 1 的组合物， 其中组合物含有平均直径为从 1 皮米到 3 微米的颗粒组。 8. 权利要求 1 的组合物， 其中组合物含有平均直径为从 10 皮米到 900 纳米的颗粒组。 9. 权利要求 1 的组合物， 其中组合物含有平均直径为从 1 纳米到 1 微米的颗粒组。 10. 权利要求 1 的组合物， 其中至少一个颗粒组的标记物是顺磁离子。 11. 根据权利要求 10 的组合物， 其中顺磁离子是铬 (II

8、I)、 锰 (II)、 铁 (III)、 铁 (II)、 钴 (II)、 镍 (II)、 铜 (II)、 钕 (III)、 钐 (III)、 镱 (III)、 钆 (III)、 钒 (II)、 铽 (III)、 镝 (III)、 钬 (III) 或者铒 (III)。 12. 权利要求 1 的组合物， 其中至少一个颗粒组的标记物是镧 (III)、 金 (III)、 铅 (II)、 铋 (III)、 碘 131、 碘123、 碘125、 锝99、 铟111、 磷32、 铼188、 铼186、 镓67、 硫35、 铜67、 钇90、 氚3 或 者砹 211。 13. 一种试剂盒或者制造的物品， 其包

9、括权利要求 1-12 任意一项的组合物和有关在哺 乳动物内使用组合物定量测定血管泄漏的说明书， 和 / 或有关在哺乳动物中使用组合物以 监控血流量和 / 或血流速度的说明书。 14. 根据权利要求 13 的试剂盒， 其还包括注射器、 针头、 药签、 导管或者消毒液。 15. 一系列颗粒组在制备用于在哺乳动物中检测和 / 或定量测定的血屏障损坏的药物 中的用途， 每一颗粒组包含具有不同平均直径， 并且具有提供独特信号的独特标记物的颗 粒， 其中所述药物用于以下方法， 其包括 (a) 把组合物给药至哺乳动物 ； (b) 观察哺乳动物 的血管外部是否放出信号 ； 以及 (c) 如果信号在哺乳动物的血

10、管外部发出， 确定哺乳动物 血管外放出的信号的类型以定量测定哺乳动物体内的血管泄漏 ； 其中 ： 至少一个颗粒组含有聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 聚 ( 丙交酯 - 共 - 乙交酯 )、 聚亚烷 基二醇、 泊洛沙姆、 聚乙烯吡咯烷酮、 异丁烯酸酯、 肽、 类蛋白微球体、 脂质、 脂质体或多糖或 权 利 要 求 书 CN 101616692 B 2/3 页 3 其组合 ； 并且 颗粒组的标记物包括荧光素、 异硫氰酸荧光素、 吲哚菁绿、 若丹明红、 太平洋蓝、 德克萨 斯红、 alexa-532、 羟基香豆素、 氨基香豆素、 甲氧基香豆素、 氨基甲基香豆素、 级联蓝、 荧光 黄、 P

11、- 藻红蛋白、 R- 藻红蛋白、 丽丝胺若丹明 B、 别藻蓝蛋白、 俄勒冈绿、 四甲基若丹明、 丹磺 酰、 monochlorobimane、 钙黄绿素、 荧光蛋白或其组合 ； 其中所述定量测定血管泄漏包括， 将所述信号与发出该信号的颗粒组的粒径范围进行 关联， 以鉴定引起泄漏的血管里的孔径大小。 16. 根据权利要求 15 的用途， 其中血管泄漏包括通过哺乳动物的血视网膜屏障、 脉络 膜、 视网膜色素上皮、 内层血视网膜屏障或者血脑屏障的泄漏。 17. 权利要求 15 的用途， 其中至少一个颗粒组的独特标记物包括发光标记物、 红外标 记物、 磁性标记物、 放射性标记物或其组合。 18. 权利

12、要求 15 的用途， 其中至少一个颗粒组的标记物包括铬 (III)、 锰 (II)、 铁 (III)、 铁 (II)、 钴 (II)、 镍 (II)、 铜 (II)、 钕 (III)、 钐 (III)、 镱 (III)、 钆 (III)、 钒 (II)、 铽 (III)、 镝 (III)、 钬 (III)、 铒 (III)、 镧 (III)、 金 (III)、 铅 (II)、 铋 (III)、 碘 131、 碘123、 碘 125、 锝99、 铟111、 磷32、 铼188、 铼186、 镓67、 硫35、 铜67、 钇90、 氚3 或者砹 211。 19. 权利要求 15 的用途， 其中测定

13、发射信号类型包括测定信号的吸收或者发射波长。 20. 权利要求 15-19 任意一项的用途， 其中所述方法还包括给该孔径大小赋予数值。 21. 多色荧光颗粒组合物在制备用于在哺乳动物中定量测定血视网膜屏障损坏的药物 中的用途， 其中该药物能够用于以下方法， 所述方法包括 ： (a) 将多色荧光颗粒组合物静脉 内给药至哺乳动物 ； (b) 观察在哺乳动物的视网膜里是否发射荧光 ； 以及 (c) 如果发射荧 光， 测定荧光吸收或者发射波长以便定量测定在哺乳动物内的血 - 视网膜屏障损坏 ； 其中 多色颗粒组合物包括一系列颗粒组， 每一颗粒组具有独特的直径粒径范围和在独特的波长 发射光的独特的荧光团

14、， 其中 ： 至少一个颗粒组含有聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 聚 ( 丙交酯 - 共 - 乙交酯 )、 聚亚烷 基二醇、 泊洛沙姆、 聚乙烯吡咯烷酮、 异丁烯酸酯、 肽、 类蛋白微球体、 脂质、 脂质体或多糖或 其组合 ； 并且 独特的荧光团包括荧光素、 异硫氰酸荧光素、 吲哚菁绿、 若丹明红、 太平洋蓝、 德克萨斯 红、 alexa-532、 羟基香豆素、 氨基香豆素、 甲氧基香豆素、 氨基甲基香豆素、 级联蓝、 荧光黄、 P- 藻红蛋白、 R- 藻红蛋白、 丽丝胺若丹明 B、 别藻蓝蛋白、 俄勒冈绿、 四甲基若丹明、 丹磺酰、 monochlorobimane、 钙黄绿素、

15、荧光蛋白或其组合。 22.权利要求1-12任意一项的组合物在制备用于在哺乳动物血管中观察血流量和/或 血流速的药物中的用途。 23.根据权利要求22的用途， 其中血流量和/或血流速能够通过将权利要求1-12中的 任何一项的组合物给药至哺乳动物的血管， 并检测来自在血管里的组合物的至少一颗粒组 的至少一个信号。 24.权利要求22或23的用途， 还包括将信号与发射信号的颗粒组的粒径范围相关联以 鉴定血管直径。 25. 权利要求 22 或 23 的用途， 还包括鉴定是否血管的直径沿着血管的长度改变， 或者 在随后的时间改变。 权 利 要 求 书 CN 101616692 B 3/3 页 4 26.

16、 权利要求 22 或 23 的用途， 还包括鉴定血管是否部分阻塞。 权 利 要 求 书 CN 101616692 B 1/13 页 5 用于血管造影术的多色的不同大小的颗粒 0001 本申请请求序列号 60/806,711 的美国临时申请作为优先权， 申请日为 2006 年 7 月 6 日， 其内容在此列为参考。 发明领域 0002 本发明涉及用于血管造影术的组合物和用于检测血管泄漏和血流量的方法。 在一 些实施方案中， 本发明的组合物和方法能用来评估血 - 视网膜屏障的完整性和 / 或定量测 定血 - 视网膜屏障内的损坏程度。因此， 本发明的组合物可以在二维， 三维成像和相似的技 术中当做造

17、影剂使用。 0003 发明背景 0004 视网膜血管造影术是用于眼科学的一种研究眼的生理和病理状况的技术。例如， 已经证明血管造影术在研究和临床领域中对评估视网膜疾病有用， 例如糖尿病视网膜病和 年龄相关的黄斑病变是两种导致失明的主要原因。常规的， 一种荧光物质， 例如荧光素， 静 脉内给药至患者， 然后通过血管造影术观察患者的视网膜。 在健康的眼睛里， 眼睛屏障防止 荧光素的泄漏通过视网膜血管进入玻璃体或者其他眼睛组织。 然而， 在患病的眼睛中， 血液 视网膜屏障损坏， 在糖尿病视网膜病的情况下导致荧光素泄漏进玻璃体， 或者在与年龄相 关的黄斑变性的情况下导致泄露至视网膜下间隙。 0005

18、对常规使用的血管造影操作的限制之一是使用的荧光物质只提供泄漏存在的一 种 “全或无” 的判定， 或者在最好实施例中， 血视网膜屏障损坏的一次主观评价。在血视网 膜和血脑屏障中的损坏数量的定量测定将为疾病进展提供更好的评估， 提高我们选择适当 治疗和剂量的能力， 并且允许我们监控该治疗和剂量的效果。 0006 发明概述 0007 本发明涉及多色血管造影术 (PCA)， 使用不同的标记物或粘附染料， 吸附到或者包 裹在不同大小的颗粒、 珠， 胶体或者标记物的可溶缀合物。这样的标记物 / 染料的颗粒、 珠， 胶体和可溶缀合物在此统称为颗粒。 一组一定大小的颗粒可以通过它们的标记物或染料与 不同尺寸的

19、另一组颗粒区分。 多组颗粒的组合能用来明确检测并且定量测定血屏障的泄漏 或者损坏。因此， 来自血屏障泄漏的颗粒大小提供了一种测定血屏障损坏程度的方法。当 除较小颗粒之外还有较大颗粒泄露时， 存在血屏障的较大损坏或机能障碍， 反之， 只有较小 颗粒的泄漏表明存在较小损坏或者机能障碍 ( 参见， 例如， 附图 4)。 0008 因此， 本发明的一方面是包括一系列颗粒组的组合物， 每一颗粒组具有不同的平 均直径和提供独特信号的独特标记物 ( 例如， 在独特波长吸收或者发射光的独特荧光基 团 )。 0009 通常， 在组合物里的每一颗粒组的颗粒可溶于一种水相环境。 在一些实施方案里， 颗粒组使用可生物

20、降解的颗粒。在其他实施方案里， 颗粒由不能生物降解的材料或者可生 物降解和不能生物降解的材料的组合制成。例如， 颗粒可以由聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 聚 ( 丙交酯 - 共 - 乙交酯 )(PLGA)、 聚亚烷基二醇、 泊洛沙姆、 聚乙烯吡咯烷、 异丁烯酸酯、 肽、 蛋白质、 类蛋白微球体、 脂质、 脂质体或者多糖制成。 用于本发明颗粒的多糖可以包括纤 说 明 书 CN 101616692 B 2/13 页 6 维素和衍生化的纤维素 ( 例如， 由各种低级烷基取代的纤维素 )， 或者糖、 苹果酸盐、 琥珀酸 盐、 柠檬酸盐、 异柠檬酸盐， - 酮戊二酸、 延胡索酸等其他聚合物。

21、颗粒也可包含聚合物， 例如羟丙基异丁烯酸、 马来酸酐的均聚物或者混合聚合物、 琥珀酸酐等等。 0010 在不同颗粒组中的颗粒具有不同的分子量或者尺寸。例如， 颗粒可能像 500 道尔顿或者 800 道尔顿、 或者 1000 道尔顿或者 5000 道尔顿一样小。颗粒也可具有像 100,000,000道尔顿或者1,000,000,000道尔顿一样大的分子量。 在一些实施方案中， 颗粒 具有最多 3 微米的直径。在其他实施方案中， 颗粒能在尺寸方面具有的直径， 例如从大约 3 皮米到大约 3 微米， 或者大约 10 皮米到大约 2.5 微米， 或者大约 100 皮米到大约 2 微米， 或 者大约 1

22、 纳米到 1 微米。在一些实例里， 颗粒尺寸为至少大约 10 皮米、 至少大约 100 皮米、 至少大约 1 纳米和 / 或至少大约 10 纳米。 0011 在颗粒组内的颗粒上使用不同染料和标记物。因此， 例如颗粒能有荧光、 发光、 红 外、 有磁性、 放射性标记物或其组合。荧光标记物的实例包括荧光素、 异硫氰酸荧光素、 吲 哚菁绿 (indocyanine green)、 若丹明红 (rhodamine red)、 太平洋蓝 (pacific blue)、 德 克萨斯红 (texas red)、 alexa-532、 羟基香豆素、 氨基香豆素、 甲氧基香豆素、 氨基甲基香豆 素、 级联蓝 (

23、cascade blue)、 荧光黄 (luciferyellow)、 P- 藻红蛋白 (P-phycoerythrin)、 R- 藻红蛋白 (R-phycoerythrin)、 丽丝胺若丹明 B(lissamine rhodamine B)、 别藻蓝蛋白 (allophycocyanin)、 俄勒冈绿 (oregon green)、 四甲基若丹明 (tetramethylrhodamine)、 丹磺酰、 monochlorobimane、 荧光蛋白、 钙黄绿素 (calcein) 或者其他连接其上的染料或标 记物， 吸附其上或者包裹其中。 在其他实施方案中， 至少一个颗粒组的标记物是铬(II

24、I)、 锰 (II)、 铁 (III)、 铁 (II)、 钴 (II)、 镍 (II)、 铜 (II)、 钕 (III)、 钐 (III)、 镱 (III)、 钆 (III)、 钒 (II)、 铽 (III)、 镝 (III)、 钬 (III)、 铒 (III)、 镧 (III)、 金 (III)、 铅 (II)、 铋 (III)、 碘 131、 碘123、 碘125、 锝99、 铟111、 磷32、 铼188、 铼186、 镓67、 硫35、 铜67、 钇90、 氚3 或者砹 211。 0012 本发明的另一方面是一种在哺乳动物中用于定量测定血管泄漏的方法， 包括 ： (a) 将本发明的颗粒

25、组合物给药至哺乳动物 ； (b) 观察哺乳动物的血管外部是否放出信号 ； 以 及 (c) 如果信号随着哺乳动物的血管外部发出， 在哺乳动物体内确定在哺乳动物血管外面 放出信号的类型以定量测定血管泄漏。在一些实施方案中， 血管泄漏包括通过哺乳动物的 血视网膜屏障的泄漏。 例如， 当观察或者定量测定通过这种血视网膜屏障的血管泄漏时， 这 个信号可能是荧光信号并且确定发射信号的类型可以包括确定信号的吸收或者发射波长。 在其他实施方案中， 血管泄漏可以包括通过哺乳动物的血脑屏障的泄漏。当观察或者定量 测定通过血脑屏障的血管泄漏时， 信号可能是顺磁性或者放射性的信号。 0013 在哺乳动物中用于定量测定

26、血管泄漏的方法， 也可包括定量测定血管泄漏的一个 步骤， 通过将发出该信号的颗粒组的粒径范围与信号关联， 以在引起泄漏的血管里鉴定孔 径大小， 并且给该孔径大小赋予数值。 0014 本发明的另一方面是一种在哺乳动物中用于定量测定血管泄漏的方法， 包括 ： (a) 将本发明的多色颗粒组合物给药至哺乳动物 ； (b) 观察哺乳动物的血管外部是否放出色信 号 ； 以及 (c) 如果放出色信号， 检测色信号吸收或者发射波长， 从而定量测定哺乳动物内 的血管泄漏 ； 其中多色颗粒组合物包括一系列颗粒组， 每一颗粒组具有不同的平均直径和 独特的色信号。如果哺乳动物的血管外部发出色信号， 一个或多个色颗粒已

27、经从血管外渗 ( 即， 泄漏 )。在一些实施方案中， 例如， 血管泄漏包括通过哺乳动物的血脑屏障的泄漏。在 说 明 书 CN 101616692 B 3/13 页 7 其他实施方案中， 例如， 血管泄漏包括通过哺乳动物的血视网膜屏障的泄漏。 本发明的方法 可进一步包括定量测定血管泄漏， 通过将颗粒组的粒径范围与色信号的吸收或者发射波长 关联， 在引起泄漏的血管里发射该波长以鉴定孔径大小， 并且给孔径大小赋予数值。 在鉴定 孔径大小之后， 合适的治疗剂和 / 或程序可以被给药和 / 或执行。 0015 本发明的另一方面是一种用于观察血在哺乳动物中流过血管的方法， 包括 ： (a) 将本发明的标记

28、颗粒组合物给药至哺乳动物 ； (b) 在哺乳动物的血管内观察信号 ； 以及 (c) 检测信号的类型以确定哺乳动物中血流的速度和 / 或血管的大小 ； 其中被标记的颗粒组合 物包括一系列颗粒组， 每一颗粒组具有不同的平均直径和独特的标记物或者信号。这种方 法可适于允许血流动问题的鉴定， 例如血管的部分或者全部阻塞。阻塞的程度或者血管的 直径可以通过观察哪种类型的标记物或者信号存在于血管被确定。 血管里的阻塞可以通过 观察在一个独特的位点流过血管的粒径的较大颗粒的阻滞而鉴定。 0016 本发明的另一方面是一个试剂盒或者制造的产品， 含有包括一系列颗粒组的组合 物， 每一颗粒组具有独特的直径粒径范围

29、和独特的标记物或者染料 ( 例如， 荧光团， 其在独 特的波长吸收或者发射光 )， 以及使用组合物的说明书。在一些实施方案中， 说明书描述怎 样在哺乳动物中发现和 / 或定量测定血管泄漏。在其他实施方案中， 说明书描述怎样检测 血流量， 血管直径和/或血管阻塞(既包括部分也包括实质上完全的血管阻塞)。 试剂盒也 可包含其他有用的工具， 例如注射器、 针头、 药签、 导管或者抗菌溶液 )。 0017 本发明的另一方面是一种用于在哺乳动物的血管里观察血流量和 / 或血流速的 方法， 其包括将本发明的组合物之一给药至哺乳动物的血管， 并检测来自血管里组合物的 至少一组颗粒组的至少一个信号。方法也能包

30、括使信号与发射的颗粒组的粒径范围相关 联， 鉴定血管的直径的那个信号。 另外， 这种方法可包括鉴定血管的直径是否沿着血管的长 度改变， 或在随后的时间改变。这种方法也可包括鉴定血管是否有部分阻塞。 0018 附图简述 0019 附图 1A-D 描述了视网膜血管造影术的性质， 根据普通有效的操作使用荧光素钠 (102) 完成， 其中荧光素 (102) 的分子量和有效粒径为 376 道尔顿。荧光素钠 (102) 具有 橙 - 棕色的颜色， 最大 abs为 492nm， 以及最大 em为 518nm。视网膜 (106) 将含有内部视 网膜血管和外部视网膜血管的脉络膜分开。附图 1A 是显示荧光素和血

31、浆蛋白质 (104) 的 混合物 (100A) 的图解， 说明 20-30的荧光素分子 (102) 是非结合的， 而 70-60结合在血 浆蛋白质 (104) 上。附图 1B 是在正常视网膜 (100B) 里的荧光素 (102) 行为的图解， 并且 显示从脉络膜血管泄露到脉络膜的游离荧光素分子 (102) 引起的背景荧光。附图 1C 显示 来自脉络膜或者外部血视网膜屏障 (100C) 的泄漏， 而附图 1D 显示来自血视网膜屏障内部 (100D)的泄漏。 因此， 附图1C和D说明不同的荧光素泄漏模式和不同程度的血视网膜屏障 机能障碍。 0020 附图 2A-D 描述来通过吲哚菁绿 (202 ；

32、 ICG) 进行的血管造影术， 根据常规的有效 操作并且证明有效粒径 (30-70 千道尔顿 ) 的概念， 在那里含有 98的小吲哚菁绿分子 (202)， 其只有 775 道尔顿的分子量， 被结合在更大的蛋白质、 脂蛋白和磷脂类 (204) 上。注 意到吲哚菁绿 (202) 具有绿颜色， 最大 abs为 800nm， 以及最大 em为 825nm。在这张图解 里， 视网膜 (206) 将含有内部视网膜血管和外部视网膜血管的脉络膜分开。附图 2A 显示吲 哚菁绿分子 (202) 和血浆蛋白质和其他等离子体颗粒 (204) 的混合物 (200A)， 说明几乎所 说 明 书 CN 101616692

33、 B 4/13 页 8 有的吲哚菁绿分子 (202) 被结合在血浆蛋白质和其他等离子体颗粒 (204) 上， 并且这些大 蛋白质 (204) 通常在正常的视网膜内防止 ICG(202) 从血视网膜屏障里泄漏， 如附图 2B 中 所示。附图 2C 显示来自脉络膜或者外部血视网膜屏障 (200C) 的泄漏， 而附图 2D 显示来自 内部 (200D) 血视网膜屏障的泄漏。因此， 附图 1C 和 D 说明不同的荧光素泄漏模式和不同 程度的血视网膜屏障机能障碍。 0021 附图 3 描述来本发明的一个实施方案 - 组合物 (300B) 包含被结合在不同粒径的 颗粒(302， 312， 314和316)

34、上的一系列荧光团， 其中颗粒表示为大白环， 以及荧光团表示为 小圆点 (302， 304， 306 和 308)。如图所示， 最终组合物由含有不同粒径颗粒的不同荧光团 (302， 304， 306 和 308) 的一系列单独混合物 (300A) 制成。在混合并将荧光团和颗粒 (310) 结合起来之后， 三个荧光团被结合在不同粒径的颗粒上 (312， 314， 316， 例如， 具有从大约 500 个道尔顿至 1 微米的粒径范围 )。一个荧光团 (302) 是未结合的并且形成最小种类的 颗粒。因此， 组合物 (300B) 包括众多颗粒种类， 每个都具有控制粒径， 每个都具有不同的标 记物 ( 或

35、者荧光团 )(302， 312， 314， 316)， 其中标记物或者荧光团类型标志了珠粒的大小。 0022 附图 4 描述了本发明组合物的效用， 为确定在血管机能障碍度或者在像血视网膜 屏障那样的各种各样的血屏障里的机能障碍程度。使用的组合物 (300B) 具有在这张示意 图内说明的相同的标记物颗粒 (302， 312， 314， 316)， 与如附图 3 显示的那些相同。因此， 在 正常的健康血管 (400A) 里， 实质上没有标记颗粒逃脱血管， 基本上没有机能障碍存在， 以 及机能障碍的程度能够， 例如， 被标记为第0阶段或者(没有机能障碍)。 如果， 最小机能障 碍存在(400B)，

36、非常小的珠粒(302)逃脱血管。 这表明存在一些小程度的机能障碍能够， 例 如， 作为最小或者第1等级机能障碍分级。 如果中等机能障碍存在(400C)， 有点更大珠粒以 及非常小的颗粒 (302 和 312) 逃脱血管。这表明有点较大程度的机能障碍能够， 例如， 被标 记为中等或者第2等级机能障碍。 如果严重的机能障碍存在(400D)， 有点更大的颗粒(314) 和更小的以前提及颗粒 (302 和 312) 逃脱血管。这表明存在较大程度机能障碍的能够， 例 如， 被标记为严重或者第 3 等级机能障碍。如果， 非常严重机能障碍存在 (400E)， 十分大的 颗粒 (316) 以及较小颗粒逃脱血管

37、 (302， 312 和 314)， 存在更巨大程度机能障碍的能够， 例 如， 被标记为非常严重或者第 4 等级机能障碍。 0023 附图 5 描述了在体外实验过程中用不同的发色团显示不同粒径的颗粒制备的分 离， 其中分离是通过具有 0.2 微米大小孔径的膜过滤实现。制备三组染料 / 混合物， 其由被 结合在尺寸不到 0.2 微米的 PLGA 颗粒上的荧光素， 结合至尺寸大于 0.2 微米 PLGA 颗粒的 吲哚菁绿 (ICG) 以及两种类型颗粒的混合物组成。将每组分两个等分进行测试。一个等分 经 0.2 微孔过滤器滤过， 以及第二等分没被过滤。这排图像底部从左到右显示非过滤的荧 光素 PLG

38、A 颗粒， 非过滤的荧光素 PLGA 和吲哚菁绿 PLGA 混合物的颗粒和非过滤的吲哚菁绿 PLGA 颗粒。上排图像从左到右显示被过滤的荧光素 PLGA 颗粒 ( 自由地通过过滤器 )， 被过 滤的混合物， 其中荧光素PLGA颗粒自由地通过过滤器， 而吲哚菁绿PLGA颗粒被阻断以及被 过滤的吲哚菁绿 PLGA 颗粒， 其被过滤器全部阻断。这一体外实验过程证明选择性泄漏的概 念。 0024 附图 6A 和 6B 比较由使用吲哚菁绿 (ICG) 操作 ( 附图 6A) 和由靛青 (ICG) 常规操 作的结合 PLGA 颗粒 ( 附图 6B) 获得的血管造影图像。对于附图 6A 实验来说， 用 1

39、毫升生 理盐溶液的 2.5 毫克 ICG 给药至兔， 和对于图 6B 的实验， 用 1 毫升生理盐溶液的 2.5 毫克 说 明 书 CN 101616692 B 5/13 页 9 ICG 颗粒 ( 装载 3.3的 ICG) 给药至兔。然后观察染料和 / 或颗粒在兔内视网膜的体内行 为。如附图 6B 中所示， 颗粒结合的 ICG 引起更明亮， 更独特的图像。因为游离 ICG 结合至 组织， 而颗粒结合的ICG不会结合， 颗粒结合ICG的使用提供了改进的、 清晰的、 独特的血管 图像。 0025 附图 7A 和 7B 比较由使用常规可用的游离荧光素血管造影术 ( 附图 7A) 或者使用 常规的操作

40、被结合在颗粒上的荧光素血管造影 ( 附图 7B) 获得的图像。两种荧光素产物给 药至兔并观察染料 / 颗粒在兔视网膜内的体内行为。正如所示， 颗粒结合的荧光素使得图 像没有显著的背景。 因为游离荧光素结合组织， 而颗粒结合的荧光素不结合组织， 颗粒结合 荧光素的使用提供了改进的、 清晰的、 独特的没有背景荧光的血管图像。 0026 附图 8A-F 描述了将组合物的混合物给药至兔后， 粒径的不同标记组在视网膜中 的选择性泄漏。附图 8A-C 在一种 ICG 结合颗粒和游离荧光素的混合物的给药之后， 健康的 视网膜血管的血管造影图像。在附图 8B 里发现 ICG 结合颗粒， 而在图 8C 里发现荧

41、光素结 合颗粒。附图 8A 显示在正常的兔视网膜里从 ICG 结合颗粒和游离荧光素发现荧光。附图 8D-F 是在对一只兔的 ICG 结合颗粒和游离荧光素的混合物的给药之后， 中等机能障碍的视 网膜的血屏障的血管造影图像。在兔体内通过 LPS( 脂多糖 20 纳克 ) 的玻璃体体内注射， 引起中等血视网膜屏障机能障碍。在附图 8E 检测到该 ICG 结合颗粒， 而在附图 8F 中检测 到游离荧光素。附图 8D 显示在这只中等机能障碍的兔视网膜的血屏障里从 ICG 结合颗粒 和游离荧光素发现荧光。注意， 在正常兔视网膜内 ( 附图 8A-C) 都没染料泄漏， 而在中等机 能障碍的血视网膜屏障模型里

42、， 更小的未结合的荧光素颗粒从视网膜的血管泄漏 ( 附图 8D 和 8F 的绿色着色 )， 而颗粒结合的 ICG( 在附图 8D&E 里的红色 ) 没有泄漏。 0027 发明详述 0028 本发明涉及一种不同的清楚大小基团并且清楚地标记颗粒或者小珠的组合物。 本 发明的组合物可以用于定量评价血屏障(例如， 血视网膜屏障)完整性的方法， 通过检测在 血屏障 ( 例如， 在玻璃体里 ) 外边发现颗粒的粒径。颗粒的大小通过观察哪种类型的染料 或者标记物在血屏障的外部上存在而被鉴定。 本发明的组合物也可用于确定或者检测通过 血管的血流量的方法 ( 例如， 和在血流量方面鉴定部分或者完全阻塞， 或由于全

43、身或者局 部的问题减少血流的速度 )， 通过检测颗粒流过血管的速度和粒径。因此， 血管的部分阻塞 可以经通过观察血管的粒径突然改变而检测。 为检测这些事件(例如， 泄漏， 部分阻塞)， 将 不同的染料或者标记结合到， 吸附到或者加载到不同尺寸颗粒上， 以产生本发明的组合物。 0029 根据本发明， 在血屏障中的破裂程度通过观察从该血屏障中泄露的较大颗粒的程 度进行评价。例如， 在血视网膜屏障 (BRB) 轻微机能障碍的情况下只有较小的颗粒泄漏， 而 当 BRB 机能障碍更严重时， 较大粒径的颗粒泄漏。颗粒的大小通过观察逃脱血屏障的标记 物或者染料来测定。 血屏障泄露或者机能障碍的严重程度可以通

44、过血屏障泄漏的粒径将其 分级。泄漏的颗粒在此反映血屏障中孔的大小。在血管里的大多数组合物颗粒的存在是血 管实质上完整的证据。因此， 治疗剂和操作可用来恰当处理被检测血管泄漏的程度。 0030 经过血管的血流量(以及在血流中可能的阻塞)也能使用本发明的颗粒组合物进 行评价。 因此， 当使用本发明的组合物观察血流量时， 在较大的血管里将会检测到较大颗粒 和较小颗粒的混合物， 但是在更小的血管里可能观察到较小的颗粒。 然而， 如果在较大血管 里已经发生阻塞， 将会在阻塞下游观察到粒径方面的变化。特别地， 与阻塞的上游观察相 说 明 书 CN 101616692 B 6/13 页 10 比， 将在阻塞

45、的下游观察到较大比例的较小颗粒。 0031 颗粒 0032 如上所述， 本发明的组合物含有被标记的不同大小的颗粒。 特别地， 组合物包含一 系列颗粒组， 每一颗粒组具有在组合物里不同于其他颗粒组平均直径的平均直径。 而且， 每 一颗粒组具有独特的标记物， 其发射在组合物里可容易同其他颗粒组的标记物 / 信号区分 的特别信号。 0033 选择颗粒组尺寸以允许进行血屏障或者血管泄漏的严重程度的评价。因此， 使用 多种的尺寸。通常， 组合物使用大约 2 到大约 20 或者大约 2 到大约 10 种不同的颗粒组尺 寸。在一些实施方案中， 组合物中使用大约 2 到大约 8， 或者大约 2 到大约 6 种

46、不同的颗粒 组尺寸。粒径能随分子量或者尺寸 ( 例如直径 ) 而变化。例如， 颗粒可能像 500 道尔顿、 或 者 800 道尔顿、 或者 1000 道尔顿或者 5000 道尔顿一样小。颗粒也能具有像 100,000,000 道尔顿或者1,000,000,000道尔顿一样大的分子量。 在一些实施方案中， 颗粒具有高至约3 微米， 或者高至约 2 微米或者高至约 1 微米的直径。在其他实施方案中， 颗粒能例如， 具有 直径像大约 10 皮米一样小， 或者大约 100 皮米， 或者大约 1 纳米。因此， 例如， 珠粒在尺寸 方面范围为从大约 10 皮米到大约 3 微米， 或者大约 100 皮米到大

47、约 2 微米， 或者大约 1 纳 米至大约 1 微米。在一些实施方案中， 颗粒能在大约 10 皮米到 900 纳米直径或者大约 1 纳 米到大约 1 微米的范围内。 0034 例如， 在本发明的组合物里一组颗粒能有大约 1-2 微米的平均直径， 在组合物里 的另一组颗粒能有大约 400-600 纳米的平均直径， 又一组颗粒能有大约 100-200 纳米的平 均直径， 另一组颗粒能有大约 40-60 纳米的平均直径， 更进一步的组能有大约 5-20 纳米的 平均直径， 以及一个最终的组能由一类游离标记物组成。 0035 颗粒可以由可生物降解材料制成， 其将逐渐在活体的身体里溶解。 或者， 颗粒可

48、以 由不能生物降解的材料或者可生物降解和不能生物降解的材料的组合制成。而且， 用于本 发明颗粒的材料基本上没有任何毒性或者其他对主体有害的影响。通常， 在颗粒中使用的 颗粒和 / 或材料不充分疏水， 以致吸收或者吸附到组织和生物分子上。本发明的颗粒优选 容易悬浮或者溶解于水性溶液， 且在需要执行本发明诊断方法的时间内(例如， 约6到约24 个小时 ) 基本上不会损失标记物 / 染料或其整体结构。 0036 合适的可生物降解材料能在体内(例如通过酶促作用)分解或者溶于身体的水相 环境。合适的可生物降解材料的例子包括多糖、 聚亚烷基二醇、 蛋白质、 肽、 类蛋白微球体 等等。在一些实施方案中， 使

49、用聚 (D， L- 丙交酯 - 共 - 乙交酯 )(PLGA)、 聚乳酸、 聚乙醇酸、 双乳酸和乳酸乙醇酸共聚物， 其可购自 Poly SciencesIncorporated， Moorington， PA 或者 Birmingham Polymers(Durect Corporation， Pelham， AL)。也可使用其他生物可降解聚合 物， 例如， 聚亚烷基二醇 ( 例如， 聚乙二醇 )、 蛋白质、 类蛋白微球体 ( 热处理的氨基酸混合 物 )、 脂质体等等。 0037 正如此处所述， 载有荧光素钠和吲哚菁绿的聚(D， L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA) 纳米颗粒已经成功生产并用于检测血视网膜屏障泄露。 0038 在本发明的组合物中不同颗粒组的浓度可以根据本领域技术人员的期望而改变。 在一些实施方案中， 组合物包含大约相同数量的每一颗粒组， 象以颗粒数目或者以标记物 信号评价的那样。因此， 组合物可具有颗粒组， 其中每一颗粒组具有大约相同数目的颗粒。 说 明 书 CN 101616692 B 7/13 页 11 可选择地， 当各种各样的颗粒组包含有不同信号强度的不同标记物时， 颗