包含亚氨基脂质的两性脂质体.pdf

1、10申请公布号CN102481256A43申请公布日20120530CN102481256ACN102481256A21申请号201080031041722申请日2010070209165106720090709EP09171102820090923EPA61K9/127200601A61K9/133200601A61K48/0020060171申请人玛瑞纳生物技术有限公司地址美国华盛顿72发明人斯特芬潘茨纳埃夫耶尼奥斯谢皮74专利代理机构隆天国际知识产权代理有限公司72003代理人吴小瑛菅兴成54发明名称包含亚氨基脂质的两性脂质体57摘要本发明涉及脂质装配体，具有包含阴离子部分和阳离子部分的

2、混合物的外表面的脂质体；其中所述阳离子部分的至少一部分为在生理条件下基本上带电荷的亚氨基部分，及其在细胞的抗血清转染中的应用。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2012010986PCT申请的申请数据PCT/EP2010/0594872010070287PCT申请的公布数据WO2011/003834EN2011011351INTCL权利要求书2页说明书41页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书41页附图6页1/2页21包含阴离子两亲分子和阳离子两亲分子的脂质装配体；其中所述阳离子两亲分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，其中所述

3、阴离子两亲分子是羧基或磷酸脂质，并且其中此外所述阳离子两亲分子和所述阴离子两亲分子之间的电荷比例为15或更低。2如权利要求1所述的包含阴离子两亲分子和阳离子两亲分子的脂质装配体，其中所述阳离子两亲分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，其中此外所述阴离子两亲分子的至少一部分是羧基脂质，并且其中所述阳离子两亲分子和所述阴离子两亲分子之间的比例小于或等于15。3如权利要求1或2所述的脂质装配体，其包含脂质的组合，其中所述组合的阳离子脂质包含胍基部分且所述组合的阴离子脂质包含羧基基团，进一步的特征在于所述胍基部分和所述羧基基团的比例小于或等于15。4如权利要求1所述的包含阴离子两亲分

4、子和阳离子两亲分子的脂质装配体，其中所述阳离子两亲分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，其中此外所述阴离子两亲分子的至少一部分是磷酸脂质，并且其中所述阳离子两亲分子和所述阴离子两亲分子之间的电荷比例小于或等于15。5如权利要求14中任一项所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述阳离子两亲分子的带电荷的亚氨基基团的PK大于75，并且选自亚胺、脒、吡啶、2氨基吡啶、杂环氮基、胍基部分、异脲或硫代异脲。6如权利要求15中任一项所述的脂质装配体，其中所述阳离子两亲分子选自包括结构L1L113、结构A1A21或结构L1L17的组中，其中根据PK大于75进一步选择所述组的成员。7如前述权

5、利要求中任一项所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述阳离子脂质选自PONA、CHOLGUA、GUADACA、MPDACA或SAINT18。8如前述权利要求中任一项所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述阴离子脂质选自CHEMS、DMGS、DOGS、DOPA或POPA。9如前述权利要求中任一项所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述装配体的阳离子脂质和阴离子脂质的电荷比例为051510如权利要求19中任一项所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述装配体为脂质体。11如权利要求10所述的脂质体，其进一步包含选自胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂或其混合物的中性脂质或两性离子脂质。12如权利

6、要求11所述的脂质体，其进一步的特征在于所述中性脂质为胆固醇，并且所述脂质混合物中胆固醇的摩尔分数为1050摩尔。13如权利要求10、11、或12所述的脂质体，其还包含PEG脂质。14如权利要求13所述的脂质体，其进一步的特征在于所述PEG脂质位于最外侧的膜叶中。15如前述权利要求1014中任一项所述的脂质体，其还包含活性药物成分。16如权利要求15所述的脂质体，其中所述药物成分为寡核苷酸。17如权利要求16所述的脂质体，其中所述寡核苷酸为诱饵寡核苷酸、和反义寡核苷权利要求书CN102481256A2/2页3酸、SIRNA、影响转录的试剂、核酶、DNAZYME或适配体。18如权利要求17所述的

7、脂质体，其中所述寡核苷酸包括经修饰的核苷酸例如磷酸二酯或硫代磷酸酯形式的DNA、RNA、LNA、PNA、2OMERNA、2MOERNA、2FRNA。19如权利要求14所述的脂质体，其通过包括以下步骤的方法制备I在存在活性成分的情况下形成并密封脂质体；和II在所述步骤I之后单独添加PEG脂质。20权利要求1019任一项所述的脂质体在细胞的体内、体外或离体转染中的应用。21包含权利要求1019任一项所述的脂质体的气溶胶在肺细胞的转染中的应用。权利要求书CN102481256A1/41页4包含亚氨基脂质的两性脂质体技术领域0001本发明涉及能够克服脂蛋白介导的摄取阻滞的脂质装配体ASSEMBLY或脂

8、质体。更具体地，本发明涉及脂质体或其衍生物在各极性区域的改善，所述脂质体既包含具有羧酸或磷酸头基的带负电荷的脂质也包含具有亚氨基或胍基的带正电荷的脂质。背景技术0002脂质体作为活性成分的载体具有广泛的应用。中性的或带负电荷的脂质体通常用于小分子药物的递送，而带正电荷的阳离子或近期引进的两性类脂质体主要用于核酸例如质粒或寡核苷酸的递送。用于递送核酸“货物”的阳离子脂质体的重要实例包括但不限于SEMPLE等，NATBIOTECH201028172176；AKINC等，NATBIOTECH200826561569；CHIEN等，CANCERGENETHER200512321328；DEFOUGER

9、OLLES，NATREVDRUGDISCOV20076443453；KIM等，MOLTHER200614343350；MORRISSEY，NATBIOTECH20052310021007；PEER，SCIENCE2008319627630和SANTEL，GENETHER20061312221234。两性脂质体用于递送核酸的应用已在ANDREAKOS等，ARTHRITISRHEUM2009609941005中证明。0003两性脂质体属于较大一类的PH敏感性脂质体，该类还包括PH敏感性阴离子或阳离子脂质体，其原型已示于LAI等，BIOCHEMISTRY19852416541661和BUDKER等，

10、NATBIOTECH199614760764中。与PH敏感性阴离子或阳离子脂质体不同，两性脂质体为复杂结构并且包含至少一对具有互补电荷的脂质。WO02/066012公开了两性脂质体的关键特征在于这些脂质体在低PH和中性PH下都具有稳定相。WO02/066012和WO07/107304描述了自低PH下开始使此类颗粒负荷核酸的方法。0004HAFEZ等BIOPHYSJ2000，793，14381446和WO02/066012提供了关于如何选择具有真正两性性质的脂质混合物的指导，更具体地，提供了关于如何确定它们的等电点和融合开始的指导。中性脂质可以为两性脂质体的额外成分。一种或多种此类中性脂质的引入

11、显著增加了混合物的复杂度，特别是由于所有成分的单独的量都可能变化。脂质体的极大数量的可能组合显示出更快速地优化两性脂质体的实践障碍。就此而言，WO08/043575揭示出优化两性脂质体的稳定性、融合性FUSOGENICITY和细胞转染的策略，特别是预测何种脂质体混合物在高PH和低PH下形成令人满意的稳定层状相，同时在中间PH下形成融合性的六边形相的方法。0005根据上述参考文献的两性脂质体是有效的细胞转染子。然而，观察到通过添加某种血清而能够阻滞这些脂质体中的一些的功能，由此可能限制了这些脂质体体内靶向某种细胞的活性。这进一步在本文中所示的实施例例如实施例3中进行了说明。0006在不同血清中观

12、察到的两性脂质体的摄取的抑制显然与近期公开的通过与脂蛋白形成复合物而活化阳离子载体如AKINC等，MO1THER2010，印刷之前于5月11日电子公开，DOI101038/MT201085所证明的，在此情况下脂蛋白为APOE相反。0007更详细的研究揭示了脂蛋白介导此抑制作用。如本文中实施例4所述，根据说明书CN102481256A2/41页5SIRNA至受刺激细胞的功能递送表明缺乏脂蛋白的人血清不能够再抑制脂质体的摄取。目前，发明人已出人意料地发现某类阳离子脂质与在极性头基中具有羧基或磷酸根的阴离子脂质的组合在存在血清的情况下在保持转染活性方面是特别有利的。当根据本文和WO08/043575

13、中描述的方法配制由所述脂质混合物产生的脂质装配体或脂质体时，经常观察到特别的益处。0008发明目的0009因此，发明的目的是提供可以在存在各种血清的情况下转染细胞的脂质装配体或脂质体。0010发明的另一个目的是提供包含此类脂质体的药物组合物，所述脂质体作为用于将活性剂或活性成分递送至细胞或组织的载体，所述活性剂或活性成分包括药物例如核酸药物，如寡核苷酸或质粒。0011发明概述0012本发明提供了脂质装配体、脂质体及其用于细胞转染的应用，其中所述脂质装配体包含阴离子和阳离子两性分子并且其中阳离子两性分子的至少一部分是在PH75下基本上SUBSTANTIALLY带电荷的亚氨基脂质，其中阴离子两性分

14、子是羧基脂质或磷酸脂质PHOSPHATELIPID，并且此外其中阳离子和阴离子两性分子之间的电荷比例是15或更低。0013在本发明的各实施方案中，提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配体，其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，此外其中阴离子两性分子的至少一部分是羧基脂质，并且其中阳离子和阴离子两性分子之间的比例小于或等于15。0014在本发明的更具体的方面中，提供了包含脂质的组合的脂质装配体，其中所述组合的阳离子脂质包含胍基部分且所述组合的阴离子脂质包含羧基基团，进一步的特征在于胍基部分和羧基基团的比例小于或等于15。0015在本发明的其他实施方案中，提供了

15、包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配体，其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，此外其中阴离子两性分子的至少一部分是磷酸脂质，并且其中阳离子两性分子和阴离子两性分子之间的比例小于或等于15。在这样的实施方案的进一步优选的方面，亚氨基脂质为胍基脂质。0016本发明的阳离子两性分子的带电荷的亚氨基基团的PK大于75，并且选自亚胺、脒、吡啶、2氨基吡啶、杂环氮基、胍基部分、异脲或硫代异脲。在优选的实施方案中，阳离子脂质选自PONA、CHOLGUA、GUADACA、MPDACA或SAINT18。0017在优选的实施方案中，所述阴离子脂质选自CHEMS、DMGS、DOGS、

16、DOPA或POPA。0018在许多实施方案中，本发明的脂质装配体是脂质体。0019在进一步的实施方案中，脂质装配体还包括中性脂质例如胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或鞘磷脂或其混合物。0020在优选的实施方案中，中性脂质是胆固醇并且脂质混合物中的胆固醇的摩尔分数在10摩尔和50摩尔之间。0021在一些实施方案中，脂质装配体还包括PEG化的脂质，并且在这样的实施方案的说明书CN102481256A3/41页6优选方面，脂质体通过包括以下步骤的方法制备1在存在活性成分的情况下形成并密封脂质体；和2在所述步骤1之后单独添加PEG脂质。0022出人意料地发现，可以使用外表面具有包含阴离子部分和阳离子部

17、分的混合物的脂质装配体或脂质体实现抗血清性转染；其中阳离子部分的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基部分。在众多实施方案中，使用WO08/043575中描述的方法以及本文中更详细描述的方法配制本发明的脂质装配体和脂质体。0023发明详述0024脂质化学0025“可带电荷的”是指两性分子的PK在PH4至PH8的范围内。因此可带电荷的两性分子可以是弱酸或碱。与带电荷的两性分子有关的“稳定的”是指PK在此范围之外的强酸或碱，其在PH4至PH8的范围内产生基本稳定的电荷。0026本文中的“两性”是指包含阴离子特性和阳离子特性的带电基团的物质、物质的混合物或超分子复合物例如脂质体，其中00271

18、阳离子和阴离子两性分子中的至少一种是可带电荷的，任选地，两种都是可带电荷的，具有至少一个PK为48之间的带电荷基团，00282阳离子电荷在PH4下占优势，且00293阴离子电荷在PH8下占优势。0030结果，物质或物质的混合物在PH4和PH8之间具有中性净电荷的等电点。由该定义的两性特性与两性离子特性不同，这是由于两性离子的PK不在上述范围内。结果，两性离子在一系列PH值下基本上为中性电荷；磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺是具有两性离子特性的中性脂质。0031本文中的“电荷比例”或“C/A”是指通常分别分配至阳离子两性分子和阴离子两性分子的额定电荷之间的比例的绝对值或模量。羧基基团的额定电荷为“1”，

19、磷酸根部分的额定电荷为“2”，且亚氨基化合物的额定电荷为“1”。给定两性分子的混合物中或在脂质装配体中的“电荷比例”随后由这些额定电荷和所考虑的化合物的各自摩尔分数的乘积计算，不考虑中性化合物例如胆固醇或两性离子两性分子例如POPC或DOPE。0032C/AXC1ZC1XC2ZC2XCNZCN/XA1ZA1XA2ZA2XANZAN0033其中XC1N表示给定阳离子化合物的摩尔分数，XA1N表示阴离子化合物的摩尔分数，ZC1N表示给定阳离子化合物的额定电荷，且ZA1N表示阴离子化合物的额定电荷。0034作为实例，包含42摩尔羧基脂质、38亚氨基脂质和20摩尔中性脂质的混合物的电荷比例或C/A为3

20、8/42091。由于磷酸根基团的双倍额定电荷，包含27磷酸脂质、43摩尔亚氨基脂质和30摩尔中性脂质的另一种混合物的电荷比例或C/A为43/5408。0035由定义和实施例，显然脂质之间的摩尔比例或为了简洁比例和电荷比例对于单个电荷的物质而言具有相同的含义，并且在此类物质中这些术语可以互换。例如，对于亚氨基和羧基脂质的组合而言即是这种情况。相比之下，对于磷酸脂质而言摩尔比例与电荷比例不同，这是由于这些化合物可具有双倍电荷，例如在其中的磷酸根基团以初级磷酸酯的形式存在例如在DOPA中的情况下。如上述计算实例所示，摩尔比例或脂质比例则是电荷比例的两倍。仅为了清楚的目的，在整个说明书中优选使用术语“

21、电荷比例”。说明书CN102481256A4/41页70036本文中的“生理PH”或“生理条件”是指约75的PH。0037在其极性头基中包含羧基部分的阴离子脂质是本领域技术人员公知的。所述在其极性头基中包含羧基部分的阴离子脂质的实例可以选自以下结构1400380039其中N或M为029之间的整数，R1和R2各自独立地选自具有824个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分，A、B或D各自独立地选自不存在、CH2、CH、CH、O、NH、COO、OCO、CONH、NHCO、OCONH、NHCOO、磷酸或亚磷酸二酯，且“固醇”可以是通过其C3原子连接的胆固醇。0040以下列表提供了带有羧基

22、基团的脂质的其他具体实例。00410042以下通式的胆固醇半二羧酸和胆固醇基氧基羰基氨基羧酸0043说明书CN102481256A5/41页80044其中Z为C或NH且N为029之间的任意数字。00450046说明书CN102481256A6/41页90047说明书CN102481256A7/41页100048以上列举的包含二酰基基团的阴离子脂质的任何二烷基衍生物也在本发明的范围内。0049优选的具有羧基的阴离子脂质可以选自CHOLC1至CHOLC16，包括所有其同系物，特别是CHEMS。还优选的是阴离子脂质DMGS、DPGS、DSGS、DOGS、POGS。0050在其极性头基中包含磷酸部分的

23、阴离子脂质是本领域技术人员公知的。磷酸脂质的实例可以选自以下结构P1P400510052其中N或M为029之间的整数，R1和R2各自独立地选自具有824个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分，A、B或D各自独立地选自不存在、CH2、CH、CH、O、NH、COO、OCO、CONH、NHCO、OCONH或NHCOO，且“固醇”可以是通过其C3原子连接的胆固醇。0053以下列表提供了带有磷脂酸基团的脂质的其他具体实例。00540055说明书CN102481256A108/41页110056其中的R1具有1624个碳原子的十六烷基磷酸酯同系物。0057可以用于本发明的阳离子脂质是在其极性

24、头基中包含亚氨基部分的两性分子，其中所述亚氨基部分在生理条件下基本上带电荷。因此，在优选的实施方案中，此官能基团的PK值为75或更高，在进一步优选的形式中，亚氨基基团的PK值为85或更高。具有所述特性的亚氨基部分可以自身为亚胺或为较大的官能基团例如脒、吡啶、2氨基吡啶、杂环氮基、胍基官能团、异脲和异硫脲等的一部分。0058以下结构111113表示此类亚氨基部分的一些具体实例00590060说明书CN102481256A119/41页120061说明书CN102481256A1210/41页130062其中两性脂质分子的L表示极性区域，并且任选地表示连接子或间隔部分。L的实例可以进一步选自以下通

25、式111500630064其中N或M表示029之间的整数，R1和R2各自独立地选自具有824个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分，A、B或D各自独立地选自不存在、CH2、CH、CH、O、NH、COO、OCO、CONH、NHCO、OCONH或NHCOO，且“固醇”可以是通过其C3原子连接的胆固醇。0065下表1提供了包含111113部分的亚氨基的PK的计算值或数据库值。对于季胺化的亚氨基部分，引入99的假定值，仅用于凸显该事实。0066表1111113部分的PK值0067说明书CN102481256A1311/41页140068说明书CN102481256A1412/41页150

26、0690070由此处所示数据可以明显地看出，结构111113中的大多数包含PK大于75或甚至大于85的优选的亚氨基部分。0071PK值可获自公开的数据库。可选地，公开领域中有能够计算、预测或推算此类数值的专业软件，例如ACD/LABSV7ADVANCEDCHEMISTRYDEVELOPMENT，ONTARIO，CANADA等。0072以上分析的亚氨基部分例示了本发明的教导，但本发明并不局限于具体的实施例。当然可以改变取代基的位置，当使用环体系例如吡咯或吡啶来实践本发明时特别如此。也可以使用芳香残基或芳基部分来代替整个111113中使用的脂肪族基团。以下化合物A1至A21的列表提供了用于进一步例

27、示所述修饰的一些实例，其中L如上文所定义。0073说明书CN102481256A1513/41页160074以下表2提供了包含A1至A21部分的亚氨基的PK的计算值或数据库值。对于季胺化的亚氨基部分，引入99的假定值，仅用于凸显该事实。0075表2A1至A21结构的PK值0076结构原子PK原子PK原子PKA1环7,29外7,16A2环99A3环99外6,76A4环7,06外6,91A5环4,74A6亚氨基12,15淀粉溶素4,95A7亚氨基3,07淀粉溶素12,14环99A8亚氨基14,24环1,31A9亚氨基14,18淀粉溶素0,72A10亚氨基12,52淀粉溶素3,12说明书CN1024

28、81256A1614/41页17A11亚氨基14,18环1,27A12亚氨基14,25淀粉溶素0,71A13亚氨基12,31淀粉溶素5A14亚氨基13,75淀粉溶素0,76A15亚氨基10,98淀粉溶素5,43A16亚氨基7,96A17亚氨基9,44淀粉溶素8,39A18亚氨基9,78淀粉溶素0,95A19亚氨基8,52外1,86A20亚氨基11,97淀粉溶素6,3A21亚氨基12,5淀粉溶素3,600770078上表2中所示的结构中的许多结构也包含PK大于75或甚至大于85的优选亚氨基。0079如上所述，带电荷的亚氨基部分可以与脂质锚定点或疏水部分组合，以产生脂质或两性分子，所述脂质或两性分

29、子能够自身形成脂质双层或能够整合入由其他脂质或两性分子形成的脂质膜中。在一些实施方案中，具体的脂质或两性分子选自如下所示的实例L1L170080说明书CN102481256A1715/41页180081说明书CN102481256A1816/41页190082其中R1和R2各自独立地选自具有824个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分。0083这些脂质中的一些已在早前示于文献中，例如WO91/16024、WO97/43363、WO98/05678、WO01/55098、WO2008/137758氨基酸脂质、EP0685234基于二酰基甘油、US5965434同样基于二酰基甘油中的

30、胍基脂质或US6726894中的吡啶嗡化合物。此外，如WO29086558中所证明的或结构15中所例示的，也可能使用可选的脂质主链，例如包含二氧戊环连接子片段同时保持各头基的官能性的那些。0084脂质混合物和任选的其他脂质0085本发明公开了包含阴离子两性分子和阳离子两性分子的脂质混合物；其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，并且此外其中阴离子两性分子的至少一部分是羧基脂质或磷酸脂质。0086阳离子脂质和阴离子脂质共同存在是本发明的核心特征，其中在阳离子脂质的极性头基中包含带电荷的亚氨基部分，在阴离子脂质的头基中包含羧基或磷酸根官能团。即，说明书CN102481

31、256A1917/41页20实质上缺少这些要素中的一个要素的脂质体或脂质装配体不包含在本发明的实践中。阳离子亚氨基脂质和阴离子脂质可以以不同的比例存在；所述比例在本文中全文以“电荷比例”阳离子阴离子比例，C/A，参见定义表征。在许多实施方案中，C/A比例大于033，在优选的实施方案中，该比例大于05，并且在一些实施方案中，该比例等于或大于066。在所述实施方案的优选方面，C/A等于或小于3，在进一步优选的方面，所述比例等于或小于2，并且在特别优选的方面，所述比例等于或小于15。0087在所述实施方案的许多方面，所得脂质混合物都具有两性特性。PK大于75甚至更高并由此优选PK为85或更高的亚氨基

32、脂质在生理条件下是基本上带电荷的，它们的实际电荷变得与其额定电荷接近，并最终与额定电荷相同。通常羧基脂质的PK为456，因此这些脂质在生理PH下也带电荷。因此，在C/A小于1时，亚氨基脂质和羧基脂质两者的混合物在生理PH下带净负电荷，在C/A1时净电荷为0，并且在C/A1时净电荷为正。0088在低PH下，阴离子电荷在羧基脂质的PK附近消失，这使得C/A1的脂质混合物首先为中性并随后带正电。电荷反转是C/A1的特性，并且定义了两性特性。C/A1或C/A1的脂质混合物在低PH下同样经历负电荷的减少，但没有电荷反转。然而，应注意的是C/A和所得到的脂质装配体的两性特性之间的关系暗示了带电荷的部分跨越

33、给定双层的在统计学上基本上相等的分布。这意味着膜的内叶1EAFLET和外叶必然具有相同的带电荷脂质的组成，以保持这些计算的完全有效性。如实施例9所示，并非总是如此，并且甚至使用C/A1的脂质混合物也能够形成两性特性的脂质体。然而，此处公开的膜组成和两性特性之间的关系为脂质混合物的选择提供了良好的指导。0089脂质混合物还可以包含其他的阳离子、阴离子、中性/两性离子或官能化的脂质。其他的阳离子脂质可以是已知的成分例如DOTAP、DODAP和DCCHOL等。其他的阴离子脂质可以选自带负电荷的磷脂例如磷脂酰甘油、磷脂酸、二十六烷基磷酸和心磷脂等。中性或两性离子脂质为胆固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和

34、鞘磷脂等。0090在优选的实施方案中，中性脂质为胆固醇。其他优选的为其中脂质混合物包含10摩尔50摩尔胆固醇的变体，甚至更优选的为包含约20摩尔40摩尔胆固醇的变体。0091重要的一类官能化的脂质是包含聚合物延伸例如聚乙二醇PEG脂质的那些。现有技术中已知众多PEG化的脂质，主要差异可以在以下方面找到IPEG链的大小和支化程度，IIPEG和分子的膜插入部分之间的连接子基团的类型，和IIIPEG化脂质的疏水性膜插入区域的大小。PEG化的其他方面是IV脂质装配体中的修饰的密度和V它们在此类脂质装配体中的定向。0092在方面I的许多实施方案中，PEG片段的分子量在500DA和5000DA之间，在更优

35、选的实施方案中，此片断的分子量为约700DA2500DA，甚至更优选的是约2000DA的PEG片段。在许多这样的实施方案中，PEG部分为单链的、未支化的PEG。0093方面II的典型实施方案为磷酸乙醇胺部分、二酰基甘油部分或神经酰胺的极性头基。0094方面III中表征的疏水性膜插入区域的大小是此类分子的其他重要特征，原因是其决定PEG脂质在双层中的膜停留时间。作为实例，具有短的疏水区域的PEG化脂质例如DMPEPEG2000二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺PEG缀合物，其中PEG链的分子量为说明书CN102481256A2018/41页212000DA在若干秒内自给定的膜扩散，而DSPEPEG2000

36、同系物在双层中停留多个小时或多天参见SILVIUS，JR和ZUCKERMANN，MJ1993BIOCHEMISTRY32，31533161或WEBB，MS等1988，BIOCHIMBIOPHYSACTA1372272282或WHEELER等1999，GENETHER6271281。0095PEG化同时为脂质体，特别是如US6,287,591中所示的阳离子脂质体与阴离子核酸货物的组合提供了胶性稳定性，但也损害了脂质体的细胞摄取和/或内体参见SHIF等2002，BIOCHEMJ366333341。瞬时PEG化是现有技术，并且同时满足颗粒的胶性稳定性和活性的需要。0096PEG化的其他方面IV是此类

37、修饰的密度，其应在脂质混合物的05摩尔10摩尔之间，在优选的实施方案中，PEG化的程度为约1摩尔4摩尔。0097由于给定双层的PEG化稳定了脂质装配体的层状相并损害与六边形相的形成有关的脂质融合，因此必须使双层中残留的PEG部分的量最小。这可以通过所需PEG脂质量的滴定而实现。因此，在方面V的一些实施方案中，脂质体在全部两个膜叶上均被PEG化并且使PEG的量最小化。在另一个变体中，尽可能完全地除去PEG。尽管这对于与外部双层相连的PEG脂质而言容易实现，但对于与脂质结构的内部连接的PEG脂质而言扩散是基本不可能的。因此本发明的方面V的优选的实施方案是提供包含带电荷的亚氨基和羧基或进一步包含PE

38、G化脂质的磷酸脂质的脂质体，其中所述PEG化的脂质基本上位于外表面上。0098此类脂质体的特征在于它们的制备方法，其中脂质体在第一步骤中形成，且该步骤还包括“货物”分子的包封。随后，在第二步骤中通过例如将PEG化脂质的胶束溶液添加至脂质体悬浮液中，而将PEG脂质插入预先制作的脂质体的外部双层中。在此类方法的具体实施方案中，通过将核酸的水溶液与脂质的醇溶液混合而形成隔离SEQUESTER核酸的脂质体。捕获核酸的脂质体自发形成，并且在随后的步骤中加入PEG化的脂质。0099特别有利地，可以使用两性脂质体实施此方法，这是由于这些脂质体已具有胶性稳定性，并且脂质体形成和PEG化之间的时间因素较不重要。

39、包封核酸的两性脂质体的制备公开于WO02/066012，其继续申请US2007/0252295中，或另外公开于WO07/107304中。0100在优选的实施方案中，通过提供所需量的PEG脂质以及中和缓冲剂而将包含亚氨基和羧基或磷酸脂质的两性脂质体在其外表面PEG化。为此，可以将PEG脂质溶于中和缓冲剂中。在另一个实施方案中，形成所述脂质体并中和，并且在01秒至若干天的时间间隔之后单独添加PEG脂质。在另一个实施方案中，形成脂质体并中和，将脂质体悬浮液进一步浓缩，并在物质浓缩后添加PEG脂质。在另一个实施方案中，形成脂质体并中和和浓缩，除去未包封的核酸，任选地替换用于脂质体悬浮液的缓冲剂，并随后

40、添加PEG脂质。总之，可以在脂质体形成和闭合后的任何时间添加PEG脂质。0101在另一个实施方案中，包含亚氨基和羧基或磷酸脂质的脂质体具有PH敏感性阳离子特性，并且遵循上文列举的步骤通过在所述脂质体形成和闭合时提供所需量的PEG脂质而在其外表面PEG化。由于在核酸存在的情况下PH敏感性脂质体更易于形成聚集体，因此优选快速PEG化，并且在脂质体闭合时例如在其产生后01秒1分钟立即加入PEG脂质。0102与产生在其外表面上基本PEG化的脂质体产物的上述方法相反，在脂质体的实际形成期间存在PEG化脂质；其在初生的结构闭合之前，生成不同的产物。尽管尚未获得结构说明书CN102481256A2119/4

41、1页22数据，但本领域技术人员应预期在这种情况下大量的PEG部分也停留在膜的内叶中。这与具有进入初生脂质体的全部两叶的通路的核酸“货物”的情况类似，并且一旦这些脂质体已闭合，即可在脂质体内部检测到大部分核酸。0103脂质装配体0104本文提及的成分可以以本领域中已知的多种结构装配。这些结构可以是包含一个或多个单独的双层的脂质体、其它超分子脂质装配体或具有提供水相的相当大的内部体积的囊泡。其也可以是乳滴或LIPOPLEX装配体形式的结构，在许多实施方案中后者包含脂质和核酸的静电复合物。在优选的实施方案中，这些结构是脂质体或囊泡。在许多实施方案中，这些脂质体或囊泡具有相当大的含水内部。在本发明的许

42、多方面，活性药物成分与脂质装配体复合，被脂质装配体包封、隔离或与脂质装配体结合。由于大量可用的亚氨基和羧基或磷酸脂质和其他脂质，确实存在极大量的可能有用的组合，由此产生从这些变体中选择和优化的进一步需要。WO08/043575给出了用于优化复合物脂质装配体，特别是脂质双层的具体指导并提供了如本文另外详细讨论的方法。简而言之，WO08/043575中的教导证明两性脂质混合物在酸性和中性PH条件下都形成稳定的双层，然而，由这些脂质混合物形成的双层可经历相变并且在其等电点下通常是在微酸性的条件下融合。WO08/043575公开了将中等大小的或小的脂质头基用于带电荷的脂质成分的用途。WO08/0435

43、75还教导了使用大的缓冲剂离子或大体积的缓冲剂离子以在装载步骤期间在低PH下稳定层状相，以及使用大的或大体积的缓冲剂离子以在储存期间在中性PH下稳定层状相。特别地，参考WO08/043575的第4457页，其重点公开了上述基本要素。所述参考文献还公开了使用带有小的头基的中性脂质以使融合活性最大化。通常用于经改善的融合的中性脂质为胆固醇或DOPE。对于中性脂质的具体考虑和优化规则另外示于WO09/047006中，特别是第63页第70页。0105总而言之，WO08/043575或WO09/047006在本文中一起被称为“参考文献”提供了有关脂质装配体的优化的合理指导。所述参考文献不限于两性脂质体，

44、但为脂质装配体的结构活性关系提供了综合模型。0106本发明由于提供了用于配制能够避免与脂蛋白或其他血清成分的细胞结合、相互作用或竞争的脂质体的优化方法，而代表了现有技术的进步。尽管所述参考文献教导的方法提供了关于脂质装配体的必需融合性的信息，但其未公开关于脂质体的细胞结合的预测的信息。0107因此，本发明的目的是提供通过所述参考文献中公开的方法同时组合了当使用在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质与具有羧基或磷酸根的阴离子脂质即带负电荷的部分的组合时观察到的出人意料的性质而配制的脂质装配体、脂质混合物和脂质体。不期望受理论的限制，本文配制的所述新型组合物可以更好地促进脂蛋白样细胞结合和摄取本领域

45、中不知道的特征。0108本文中描述的脂质混合物可以具有两性或PH敏感性阳离子性质，这两个性质通常由形成其的脂质赋予脂质装配体或脂质体。可容易地如WO02/066012所述预测电荷性质，用于脂质朝向脂质膜或双层的两叶的对称分布。然而，在一些情况下最外叶的脂质分布可能与装配体的其他部分不同。宏观地，如实施例9和图1中所证明的，C/A略大于1且包含带电荷的亚氨基脂质以及羧基或磷酸脂质的组合的脂质混合物可能因此仍然形成具有说明书CN102481256A2220/41页23两性特性的脂质体。0109出于计算机优化和预测的目的，认为本发明的C/A1的脂质混合物是两性的并且可以形成根据参考文献的分类被归类于

46、“两性子AMPHOTERI”混合物的脂质装配体。在其他实施方案中，使用C/A1或C/A1的脂质混合物；这些是PH敏感性阳离子脂质混合物，其电荷在生理PH下为中性或阳离子性的，并且随着PH降低而变得更阳离子性。所述实施方案的PH敏感性阳离子混合物不再具有等电点，这是由于其两性对应物即是如此。然而，参考文献中提供的结构活性关系是可用的，这是由于其提供了对于脂质装配体和溶质以及离子与其电荷无关的组合的相行为的通用理解。0110为了说明，本发明的脂质混合物包含一种或多种具有在生理PH下基本上带电荷的亚氨基基团的阳离子脂质，还包含一个或多个具有羧基或磷酸根基团的阴离子脂质，任选地还包含中性脂质。0111

47、脂质体的两性特性还具有其他益处。此类脂质体或脂质装配体的负表面电荷大大地改善了脂质体在悬浮液中的胶性稳定性。这在与易于与阳离子脂质体生成聚集体的多阴离子“货物”例如核酸的组合中是特别重要的。0112当体内施用脂质体时，两性脂质装配体或脂质体的阴性至中性表面电荷也是有利的，在此其防止了利用阳离子脂质体观察到的在内皮上的非特异性吸收或与血清成分形成聚集体关于阳离子脂质体的内皮吸收参见SANTEL等，2006，GENETHERAPY1312221234，或者关于防止与两性脂质体形成聚集体参见ANDREAKOS等，2009，ARTHRITISANDRHEUMATISM，609941005。0113因此

48、，在优选的实施方案中，本发明的脂质体具有两性特性。在该组中，避免极低百分比的阳离子成分以保持颗粒对多阴离子“货物”例如核酸的有效装载是有利的。在其他优选的实施方案中，C/A大于05。0114当全身施用，即施用至血流中时，脂质体在体内经历某种分布。通常的靶点是肝和脾，但是也包括循环的吞噬细胞。脂质体也与围绕血管的内皮接触并可转染这些细胞。脂质体在发炎部位和肿瘤中的聚集具有特别的治疗相关性。0115技术人员应知晓将颗粒的分布引向一个或另一个部位的方法。公知具有约150NM或更小的小直径的脂质体可以穿透肝内皮，由此获得进入至肝细胞和肝实质的其他细胞的通道。在靶向肝细胞受到治疗关注的情况下，本发明的脂

49、质体的直径可以为150NM或更小，在优选的实施方案中，脂质体的直径可以小于120NM。0116还公知直径为100NM或更大的颗粒很好地被吞噬细胞识别。因此，在巨噬细胞或树突细胞构成受关注的靶的实施方案中，本发明的脂质体为120NM或更大。在一些实施方案中，这些脂质体为150NM或更大。在其他实施方案中，这些脂质体的大小可以为250NM或大至400NM。0117还描述了表面电荷可影响循环时间，因此影响脂质体的生物分布，并且已明确证明PEG化减少了表面电荷并导致脂质体的循环延长。通常认为循环延长使向肿瘤的分布最大化。因此，在其中肿瘤构成受关注的靶的方面，本发明的脂质体具有小的净表面电荷，并且其特征在于06715的C/A。在此类应用的优选实施方案中，形成所述脂质体的脂质混合物的C/A为08125。同样，靶向肿瘤的脂质体为小体积。在优选的实施方案中，此类脂质体小于150NM，在进一步优选的实施方案中，脂质体小于120NM。在一些实施方案中，脂质说明书CN102481256A2321/41页24体还包括PEG脂质。0118用于本发明脂质体的“货物”0119本发明的脂质体或脂质装配体可以隔离或包封至少一种活性剂。所述活性剂可以包括药物。在一些实施方案中，所述活性剂可以包含一种或多种核酸。在优选的实施方案