大流行流感病毒裂解疫苗.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102406931 A (43)申请公布日 2012.04.11 CN 102406931 A *CN102406931A* (21)申请号 201110382631.0 (22)申请日 2011.11.25 A61K 39/145(2006.01) A61P 31/16(2006.01) (71)申请人 成都康华生物制品有限公司 地址 610100 四川省成都市国家经济技术开 发区北京路 182 号 (72)发明人 侯文礼 冯晓 张涛 钟泽荣 (74)专利代理机构 四川省成都市天策商标专利 事务所 51213 代理人 刘兴亮 (54) 发明名称 大流行流感病毒裂解疫

2、苗 (57) 摘要 本发明提供了一种大流行流感病毒裂解 疫苗及其制备方法， 所述方法采用 WHO 推荐的 NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1) 株毒 种， 经接种鸡胚 ( 产量高、 操作容易 )、 培养、 收 获病毒液、 灭活病毒、 蔗糖密度区带离心纯化、 Triton X-100 裂解、 再纯化和氢氧化铝吸附、 分 装等工艺制备得到大流行流感病毒裂解疫苗。本 发明在大流行流感疫苗 ( 全病毒 ) 的基础， 通过 采用二乙烯亚胺和辅料甲醛组合更彻底地灭活病 毒， 同时采用裂解剂裂解和新的纯化方法， 去除副 反应源病毒内脂膜， 最终能够以较高的浓缩 效率和回收率制

3、备得到杂质含量更少， HA 含量更 高的保持较高免疫原性的大流行流感病毒裂解疫 苗， 所述疫苗不含硫柳汞， 接种更安全 ； 接种人群 更广泛， 而且灭活疫苗更加安全、 可靠。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 CN 102406934 A1/1 页 2 1. 一种大流行流感病毒裂解疫苗的制备方法， 其包括 NIBRG-14 病毒的接种培养、 灭活 病毒、 病毒液澄清和浓缩、 层析纯化病毒、 Triton X-100 裂解病毒、 超滤膜二次纯化、 除菌过 滤、 氢氧化铝吸附、 分装冻干制成疫苗成品的步骤， 其特

4、征在于 ： 其中采用毒性弱且可自行 分解的烷化剂二乙烯亚胺和辅料甲醛组合形成灭活剂对病毒进行灭活。 2. 根据权利要求 1 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 二乙烯亚胺 和辅料甲醛终浓度为 1 比 4000， 在 20-25作用 6 小时灭活病毒。 3. 根据权利要求 2 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： NIBRG-14 病 毒的接种培养按照如下步骤进行， 将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀 释为 10-5 稀释度， 尿囊腔接种 10 日龄健康 SPF 鸡胚， 病毒接种量为 0.2ml/ 枚， 将接种病毒 的鸡胚放在 37.5， 相对湿度

5、 60下培养， 于接种病毒后 56 小时取鸡胚放置于 4冷胚 18 小时后， 收获病毒尿囊液。 4. 根据权利要求 2 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于病毒液澄清 和浓缩包括滤网过滤、 滤膜过滤， 超滤和衡滤浓缩。 5. 根据权利要求 4 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 病毒液澄 清和浓缩具体步骤如下 ： 将各批单型别的病毒原液分别用盖有 120 目滤网合并过滤， 添 加柠檬酸钠和 EDTA 去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测 pH 值达到 7.8 后再添加 0.5mol/L的磷酸盐溶液PB， 取样检测使pH值达7.20.2， 将无菌试验和灭活试验合格

6、的尿 囊液进行澄清过滤， 即经 10um 滤膜粗滤后， 再经两次 0.45um 滤膜过滤， 最后用相对分子质 量 1000KD 的膜进行超滤浓缩， 0.01M pH 7.2 的 PBS 进行 8 倍体积的衡滤作最后浓缩， 浓缩 液中再加入 0.25mol/L 的 PB 回收病毒液。 6. 根据权利要求 2 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 病毒纯化采 用分子筛凝胶层析系统。 7. 根据权利要求 6 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 分子筛凝胶 层析系统为 Amersham 的 BPG200.750 ； 凝胶为 Sepharose 4FF， 凝胶过滤介质是

7、 4琼脂糖 的高度交联体， 层析柱凝胶装量为 14L， 使用的平衡盐溶液为 0.01M pH 7.2 的 PBS， 流速为 150ml/min， 样品上样量为 700ml。 8. 根据权利要求 2 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： Triton X-100 裂解是用 0.01M pH7.2 的 PBS 将裂解剂 Triton X-100 稀释至浓度为 0.5， 与大流 行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合， 于室温 20-25作用 2 小时。 9. 根据权利要求 2 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 超滤膜再纯 化选用截留分子量为 100kD 的超滤膜， 超

8、滤缓冲液用 0.01mol/L 的 PBS(pH 7.2)， 进液压 力在50psi左右， 回流压力为0-10psi， 采用PBS超滤10倍体积， 用于Triton X-100去除工 艺。 10. 根据权利要求 2 所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法制备得到的疫苗， 其内毒 素含量为低于 70EU/ml。 权 利 要 求 书 CN 102406931 A CN 102406934 A1/7 页 3 大流行流感病毒裂解疫苗 技术领域 ： 0001 本发明属于生物医学技术领域， 本发明涉及利用 WHO 推荐的 NIBRG-14 株毒株， 在 大流行流感全病毒疫苗的基础上， 增加裂解工艺， 制备成大

9、流行流感病毒裂解疫苗， 用于预 防大流行流感。 背景技术 ： 0002 人 禽 流 行 性 感 冒 (Human-avian Influenza) 简 称 人 禽 流 感 或 大 流 行 流 感 (Pandemic Influenza)， 是指 A 型禽流感病毒由于种种原因突破种属屏障而感染人， 引起 的一种急性高度致死性禽类传染病， 其感染人类的事件最先发生于中国香港。1997 年 5 月 9 日， 香港一名 3 岁男童体内分离出一株 A 型流感病毒， 同年 8 月确诊为全球首例由 A 型禽 流感病毒 (H5N1) 引起的人间病例。根据 2005 年 WHO 对流感大流行预警期的划分， 当前

10、全 球正处在预警期的第三阶段， 即以散发病例和有限的人传人疫情为特征。据世界卫生组织 (WHO) 报道， 截止 2008 年 4 月 3 日， 14 个国家报告 378 例 A 型禽流感 (H5N1) 确诊病人， 其 中 238 人死亡， 病死率为 62.96。 0003 H5N1 型禽流感病毒带来了全球性的威胁。H5N1 亚型流感病毒具有 H5 亚型血凝素 和Nl亚型神经氨酸酶， 它能在人体内复制并引起严重的疾病。 H5N1亚型病毒对现有的每一 个人的免疫系统来说都是新的抗原， 因此人类具有普遍的易感性， 被认为是最有可能引起 下一次流感大流行的病毒。 0004 最大的担忧是， H5N1 禽

11、流感病毒继续进化成不同的抗基因突变体， 感染除人之外 的哺乳动物宿主， 其传染范围扩大， 从家禽至迁移鸟类， 而通过鸟类传播， 30 多个国家暴发 了禽流感疫情。 0005 疫苗作为控制流感大流行的一种主要手段， 受到各个国家的重视。安全有效的疫 苗很可能是减小大流行疾病、 维护公众健康的唯一手段。因此， 发展 H5N1 疫苗被认为是主 要的策略。 0006 目前在研制的大流行流感疫苗包括全病毒灭活疫苗和裂解疫苗。美国巴斯德公 司、 法国巴斯德公司、 澳大利亚 CSL 公司、 匈牙利 Onminvest 公司和中国北京科兴公司等 5 家机构研究出产品， 获得生产大流行流感疫苗的能力。 0007

12、 美国巴斯德公司采用美国 CDC 制备的重配株进行的 H5N1 裂解无佐剂疫苗的研究 结果。他们于 2005 年 4 月至 10 月在 451 人中进行了临床试验， 测试了 90， 45， 15， 7.5 微克 四个不同剂量的疫苗效果。结果显示， 两针 90 微克的疫苗产生了最高的免疫反应， 抗体阳 性率为 58。后续试验将给部分 I 期的受试者加强 1 针， 观察免疫持久性结果。 0008 随后， 法国巴斯德公司的 H5N1 裂解铝佐剂疫苗的临床试验结果， 该试验于 2005 年 5-7 月在法国进行， 疫苗株使用的是由世界卫生组织英国中心实验室 NIBSC 提供的 NIBRG-14 毒株。

13、300 名受试者分别接种 30， 15， 7.5 微克有铝或无铝佐剂裂解疫苗。其中两 针 30 微克铝佐剂疫苗产生的抗体阳性率最高， 为 67。 0009 澳大利亚 CSL 公司也于 2005 年 10 月进行了 H5N1 裂解铝佐剂疫苗临床试验， 共 说 明 书 CN 102406931 A CN 102406934 A2/7 页 4 400 名受试者参加。结果两针 15 微克铝佐剂疫苗的抗体阳性率为 67， 并随后将继续在更 大规模的人群中进行试验， 也包括老年人和儿童。 0010 在我国北京科兴与中国疾病预防控制中心共同研发的 H5N1 全病毒铝佐剂疫苗的 临床试验于 2006 年 6

14、月初揭盲。疫苗在全部的受试者中表现出良好的安全性和免疫原性， 仅两针 10 微克的全病毒疫苗就产生了 78的抗体阳性率。 0011 巴斯德公司的大流行流感裂解疫苗在 2007 起为美国政府采购储备， 作为高危人 群使用， 匈牙利已在2008年大流行流感疫苗上市 ； 我国北京科兴在2008年奥运会生产大流 行流感灭活疫苗国家政府采购储备。 0012 大流行流感病毒裂解疫苗的优点是 ： 制备工艺成熟， 免疫原性较高， 培养的病毒 含量达到滴度要求即可进行大量生产 ； 由于不存在活病毒颗粒， 没有感染问题， 安全性 好 ； 保存方便， 一般无需冻干保存 ； 适用人群较广， 尤其适用于不能运用全病毒疫

15、苗的 人群， 如 12 岁以下的儿童和老年人。 发明内容 ： 0013 本发明的目的之一是提供一种副反应更小， 免疫原性更高， 接种更安全， 接种人群 更广泛的新疫苗。 0014 本发明的另一目的是提供一种能高效低成本大量制备大流行流感裂解疫苗的制 备方法。 0015 本发明的大流行流感裂解疫苗包括大流行流感免疫抗原及疫苗佐剂， 其中所述 的大流行流感免疫抗原为 WHO 推荐的 NIBRG-14 株毒种的血凝素 HA， 其内毒素含量为低于 70EU/ml， HA 含量为 40ug/ml， 所述的疫苗佐剂为氢氧化铝。 0016 为实现本发明的第二个目的， 本发明的技术方案是采用WHO推荐的NIB

16、RG-14株毒 种， 在大流行流感疫苗(全病毒)的基础， 通过裂解剂裂解， 去除副反应源病毒内脂膜， 减少副反应， 保持较高免疫原性， 接种更安全， 接种人群更广泛。 本发明制品不含硫柳汞， 以 减少汞积累造成危害性， 在生产、 疫苗接种过程更安全。 0017 本发明的大流行流感裂解疫苗的制备方法， 包括 NIBRG-14 病毒的接种培养、 灭活 病毒、 病毒液澄清和浓缩、 层析纯化病毒、 Triton X-100 裂解病毒、 超滤膜二次纯化、 除菌 过滤、 氢氧化铝吸附、 分装冻干制成疫苗成品的步骤， 其中采用毒性弱且可自行分解的烷化 剂二乙烯亚胺和辅料甲醛组合形成灭活剂对病毒进行灭活， 二

17、乙烯亚胺和辅料甲醛终浓度 为 1 比 4000， 在 20-25作用 6 小时灭活病毒。NIBRG-14 病毒的接种培养按照如下步骤进 行， 将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为 10-5 稀释度， 尿囊腔接种 10 日龄健康 SPF 鸡胚， 病毒接种量为 0.2ml/ 枚， 将接种病毒的鸡胚放在 37.5， 相对湿度 60下培养， 于接种病毒后 56 小时取鸡胚放置于 4冷胚 18 小时后， 收获病毒尿囊液。病 毒液澄清和浓缩包括滤网过滤、 滤膜过滤， 超滤和衡滤浓缩， 具体步骤是将各批单型别的病 毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤， 添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵

18、黄蛋白等 杂质并取样检测 pH 值达到 7.8 后再添加 0.5mol/L 的磷酸盐溶液 PB， 取样检测使 pH 值达 7.20.2， 将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤， 即经 10um 滤膜粗滤后， 再 经两次0.45um滤膜过滤， 最后用相对分子质量1000KD的膜进行超滤浓缩， 0.01M pH 7.2的 PBS进行8倍体积的衡滤作最后浓缩， 浓缩液中再加入0.25mol/L的PB回收病毒液。 病毒纯 说 明 书 CN 102406931 A CN 102406934 A3/7 页 5 化采用分子筛凝胶层析系统。 具体使用的分子筛凝胶层析系统为Amersham的BPG200

19、.750 ； 凝胶为 Sepharose 4FF， 凝胶过滤介质是 4琼脂糖的高度交联体， 层析柱凝胶装量为 14L， 使用的平衡盐溶液为0.01MpH 7.2的PBS， 流速为150ml/min， 样品上样量为700ml。 Triton X-100 裂解是用 0.01M pH7.2 的 PBS 将裂解剂 Triton X-100 稀释至浓度为 0.5， 与大流 行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合， 于室温20-25作用2小时。 超滤膜再纯化选用截留 分子量为 100kD 的超滤膜， 超滤缓冲液用 0.01mol/L 的 PBS(pH 7.2)， 进液压力在 50psi 左右， 回流压力为 0-

20、10psi， 采用 PBS 超滤 10 倍体积， 用于 Triton X-100 去除工艺。 0018 具体制备步骤为 ： 0019 (1) 选用菌种 ： 0020 WHO 推荐的 NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1) 株毒株， NIBRG-14 株 ( 简称 R1194)( 英国国家生物制品检定所 )。该毒株是 1194 株 (A/Viet Nam/1194/2004H5N1) 和 PR8 株 (H1N1) 二种病毒， 通过反相遗传的方法改造而成， 且通过 HA 基因修饰的方式进一步 降低疫苗株的毒力， 却保留其免疫原性。这种经过重配得来的疫苗株保留了原始毒株

21、的免 疫原性， 具有良好的鸡胚适应性和传代的稳定性， 与野毒株相比具有很好的安全性， 因此适 用于疫苗的生产。 0021 (2) 鉴定毒种 ： 0022 a) 材料 ： 将 NIBRG-14 在鸡胚中传二代 (P2)。血清 ： 禽流感病毒 H5 血凝素及 抗血清 ( 英国国家生物制品检定所 ) ； A1、 A3、 B 型人流感病毒血凝素及抗血清 ( 英国国家 生物制品检定所 )。 0023 b) 方法 ： 0024 血凝抑制试验和单向免疫扩散试验 ： 按常规法。 0025 病毒滴度测定 ： 按常规鸡胚感染法， 每稀释度接种 4 只鸡胚。 0026 无菌试验和外源因子检查 ： 按现行版 中国药典

22、 的要求测定。 0027 毒种免疫源性测定 ： 病毒经灭活、 浓缩、 纯化后， 用不同剂量的血凝素经大腿肌 肉接种 20 25kg 家兔 4 只， 14d 后加强 1 针， 首针后 28d 采血， 测定血凝抑制抗体和中和抗 体。 0028 血凝素序列测定 ： 根据 H5 的核酸序列， 设计一对特异性引物， 经 RT-PCR 扩增 H5 基因， 通过 T-A 克隆， 将其插入载体， 转导大肠埃希菌， 筛选阳克隆， 提取质粒， 测序。 0029 R1194 的原始株序列 ： 来源于美国国家生物信息中心基因库 (NCBI GenBank)。 0030 电子显微镜图片。 0031 (3) 毒种库的建立

23、 0032 根据现行版 中国药典 三部通则中 “生物制品生产和检定用菌毒种管理规程” 的 要求， 将 R1194 毒种建立了三级种子库 ； 即原代、 主代和工作代。原代 ： 引进的毒种 P2 作为 原代。主代 ： 原代在无致病菌 (SPF) 鸡胚中传 2 代 P4 作为主代。工作代 ： 主代在无致病菌 (SPF) 鸡胚中传 1 代 P5 作为工作代。该工作种子批毒种病毒滴度 7.7LogEID50。 0033 (4)NIBRG-14 接种鸡胚、 培养 0034 将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为 10-5稀释度， 尿囊腔 接种 10 日龄健康 SPF 鸡胚， 病毒接种量为 0

24、.2ml/ 胚， 培养鸡胚， 于接种病毒后 56 小时取鸡 胚放置于 4冷胚 18 小时后， 收获病毒尿囊液。 说 明 书 CN 102406931 A CN 102406934 A4/7 页 6 0035 (5) 灭活病毒 0036 收 获 的 病 毒 尿 囊 液， 用 用 毒 性 弱 且 可 自 行 分 解 的 烷 化 剂 二 乙 烯 亚 胺 (BinaryEthyleneImine， 简称 BEI) 和辅料甲醛灭活病毒。两者组合灭活病毒更彻底， 抗原 性更高， 灭活疫苗更加安全、 可靠。 0037 (6) 病毒液澄清和浓缩 ： 0038 将各批单型别的病毒原液分别用滤网合并过滤， 添加柠

25、檬酸钠和 EDTA 去除尿囊 液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测 pH 值达到 7.8 后再添加 0.5mol/L 的磷酸盐溶液 PB， 取 样检测使 pH 值达 7.20.2。将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤， 浓缩， 浓 缩液中再加入 0.25mol/L 的 PB 回收病毒液。这种方法有效地去除杂蛋白和回收 HA 抗原， 保证病毒颗粒的完整性和主要抗原组分的存在和纯度。 蛋白去除率为61.93， 体积浓缩了 36 倍， 蛋白去除率为 96.34， HA 含量收率分别为 72.52。浓缩后的病毒液血凝效价应不 低于 1 10240。 0039 (7) 病毒纯化 0040 在疫苗浓缩液

26、中， 主要的杂蛋白是鸡胚的卵清蛋白等。 流感病毒的分子量至少1MD 以上， 远远大于大部分杂蛋白分子量， 用分子筛将病毒与大部分杂蛋白分开。 纯化选择的条 件是 ： 凝胶层析系统为 Amersham 的 BPG200.750 ； 凝胶为 Sepharose 4FF ； 凝胶过滤介质是 4琼脂糖的高度交联体 ( 该介质具有物理及化学稳定性好、 流速快， 尤其是流量大、 适合 大规模生产等优点 )。 0041 (7)Triton X-100 裂解 ： 0042 将裂解剂 Triton X-100 与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合， 于室温 (20-25 ) 作用 2 小时。 0043 (8)

27、 再纯化 0044 超滤膜法去除 Triton X-100， 去除率在 90以上。 0045 (9) 除菌过滤 0046 将上述收集的病毒纯化液用 0.2um 的膜进行过滤除菌。 0047 (10) 氢氧化铝吸附 0048 配置 13mg/ml 的氢氧化铝， 高压灭菌， 将氢氧化铝用生理盐水稀释至 24mg/ml， 加 入 HA(NIBRG-14 病毒表面的糖蛋白血凝素 ) 含量为 120ug/ml 的疫苗稀释原液， 于 20-25 搅拌吸附 4 小时， 配制成大流行流感病毒裂解疫苗的半成品。 0049 (11) 分装冻干制成疫苗成品 0050 上述半成品采用洗烘灌联动机组分装， 冻干、 真空

28、压塞和轧盖、 透视检查及贴签 ； 完成贴签的制品即冻干疫苗成品， 送 2 8冷库保存。 0051 与现有技术相比， 本发明具有以下优点 ： 0052 1、 选用 WHO 推荐的 NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1) 株毒株， NIBRG-14 株。 疫苗株的毒力低， 保留的免疫原性高， 具有良好的鸡胚适应性和传代的稳定性， 与野毒株相 比具有很好的安全性， 适用于疫苗的生产。 0053 2、 烷化剂二乙烯亚胺 (BinaryEthyleneImine， 简称 BEI) 和辅料甲醛的组合灭活 剂在终浓度 1 比 40000.02， 20-25， 6 小时灭活病毒。

29、灭活病毒更彻底， 抗原性更高， 灭 活疫苗更加安全、 可靠。 说 明 书 CN 102406931 A CN 102406934 A5/7 页 7 0054 3、 经过 2 此纯化， 采用新的纯化方法， 所含杂质更少， 得到的 HA 含量更高。 0055 4、 病毒滴度高， 平均 1.5 个鸡胚就能生产出 1 人份疫苗。 0056 5、 浓缩效率及回收率好。 具体实施方式 ： 0057 具体实施方式例 1 0058 筛选和确定灭活病毒的最佳条件 0059 灭活时， 以 1 比 1000、 1 比 2000、 1 比 4000、 1 比 8000 加入甲醛溶液， 于 20-25条 件下灭活病毒，

30、 采用 1 比 1000、 1 比 2000 甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒， 24 小时病毒即 可被完全灭活， 采用1比4000、 甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒， 48小时病毒即可被完全灭 活， 采用 1 比 8000、 甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒， 96 小时病毒即可被完全灭活。甲醛具 有较强的还原作用， 高浓度的甲醛对疫苗抗原的生产有影响， 因此， 综合考虑， 用 1 比 4000、 甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒。 0060 具体实施方式例 2 0061 制备大流行流感裂解疫苗成品 0062 (1) 将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为 10-5稀释度， 尿 囊腔接种 1

31、0 日龄健康 SPF 鸡胚， 病毒接种量为 0.2ml/ 枚 ( 即 100EID50/ 枚 )。将接种病毒 的鸡胚放在 37.5， 相对湿度 60下培养， 于接种病毒后 56 小时取鸡胚放置于 4冷胚 18 小时后， 收获病毒尿囊液。 0063 (2) 灭活病毒 0064 收获的病毒尿囊液， 用用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺 0065 (BinaryEthyleneImine， 简称 BEI) 和辅料甲醛的组合灭活剂在终浓度 1 比 4000 0.02， 20-25， 6 小时灭活病毒。 0066 (3) 病毒液澄清和浓缩 0067 将各批单型别的病毒原液分别用盖有 120 目滤网合

32、并过滤， 添加柠檬酸钠和 EDTA 去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测 pH 值达到 7.8 后再添加 0.5mol/L 的磷酸盐 溶液 PB， 取样检测使 pH 值达 7.20.2。将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过 滤， 即经 10um 滤膜粗滤后， 再经两次 0.45um 滤膜过滤， 最后用相对分子质量 1000KD 的膜 包进行超滤浓缩， 0.01MpH 7.2 的 PBS 进行 8 倍体积的衡滤作最后浓缩， 浓缩液中再加入 0.25mol/L 的 PB 回收病毒液。 0068 (4) 病毒纯化 0069 在疫苗浓缩液中， 主要的杂蛋白是鸡胚的卵清蛋白等。 流感病毒的分子量

33、至少1MD 以上， 远远大于大部分杂蛋白分子量， 用分子筛将病毒与大部分杂蛋白分开。 纯化选择的条 件是 ： 凝胶层析系统为 Amersham 的 BPG200.750 ； 凝胶为 Sepharose 4FF ； 凝胶过滤介质是 4琼脂糖的高度交联体 ( 该介质具有物理及化学稳定性好、 流速快， 尤其是流量大、 适合 大规模生产等优点 ) ； 层析柱凝胶装量为 14L， 使用的平衡盐溶液为 0.01M pH 7.2 的 PBS， 流速为 150ml/min， 样品上样量为 700ml。 0070 (5)Triton X-100 裂解 0071 用 0.01M pH7.2 的 PBS 将裂解剂

34、Triton X-100 稀释至浓度为 0.5， 与大流行流 说 明 书 CN 102406931 A CN 102406934 A6/7 页 8 感裂解疫苗病毒纯化液等量混合， 于室温 (20-25 ) 作用 2 小时。 0072 (6) 再纯化 0073 超滤膜法去除 Triton X-100， 选用截留分子量为 100kD 的超滤膜超滤膜， 超滤缓 冲液用 0.01mol/L 的 PBS(pH 7.2)， 进液压力在 50psi 左右， 回流压力为 0-10psi， 采用 PBS 超滤 10 倍体积， 用于 Triton X-100 去除工艺， 去除率在 90以上。 0074 (7) 除

35、菌过滤 0075 将上述收集的病毒纯化液用 0.2um 的膜包进行过滤除菌。 0076 (8) 氢氧化铝吸附 0077 配置 13mg/ml 的氢氧化铝， 高压灭菌， 将氢氧化铝用生理盐水稀释至 24mg/ml， 加 入 HA(NIBRG-14 病毒表面的糖蛋白血凝素 ) 含量为 120ug/ml 的疫苗稀释原液， 于 20-25 搅拌吸附 4 小时， 配制成大流行流感病毒裂解疫苗的半成品。 0078 (9) 分装冻干制成疫苗成品 0079 上述半成品采用洗烘灌联动机组分装， 玻璃管制注射剂瓶盛装， 分装规格为 0.5ml/ 瓶， 分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞， 分装完成后， 在分装后 6

36、小时内冻干 ； 冻干 完成即进行真空压塞和轧盖 ； 完成轧盖的制品进行透视检查及贴签 ； 完成贴签的制品即冻 干疫苗成品， 送 2 8冷库保存。 0080 具体实施方式例 3 0081 成品检定 0082 (1) 鉴别试验 0083 取通过本发明的具体实施方式例 2 制备得到的大流行流感裂解疫苗成 品 待 检 样 品， 加 入 TritonX 一 100 和 二 乙 醇 胺 解 吸 附， 离 心 上 清 液， 加 入 羊 抗 A/ VIETNAM/1194/04(H5N1) 血清的琼脂糖凝胶平板孔中， 把凝胶平板放于湿盒中， 室温放置 18-24h， 经 PBS 浸泡 30min， 0.5考马

37、斯亮兰染色， 双蒸水脱色后观察。所有样品孔均出现 沉淀环， 这证明待检样品抗原性与禽流感 A/VIETNAM/1194/04(H5NI) 株型相一致。 0084 (2) 外观 0085 对制各的大流行流感裂解疫苗成品进行灯检， 为白色混悬液体， 摇动后未发现异 物和块状物， 外观检定合格。 0086 (3)pH 测定 0087 将大流行流感裂解疫苗成品多支混合后， 使用 pH 计测定， 三批疫苗检定结果为 7.2， 在 6.5 7.5 标准之内， pH 检定合格。 0088 (4) 效力试验 0089 取大流行流感裂解疫苗成品， 分别肌肉注射免疫体重 18-20g Balb/c 小鼠 10 只

38、， 免疫剂量分别是 7.5ug、 15ug、 30ug， 免疫 2 次， 间隔 14 天。第 1 次免疫后 28 天采血， 分离血 清， 采用血凝抑制检测中和抗体效价。大流行流感裂解疫苗成品都产生了良好的中和抗体 效价， 效力检定合格。 0090 说 明 书 CN 102406931 A CN 102406934 A7/7 页 9 0091 (6) 游离甲醛含量 0092 取大流行流感裂解苗供试品 lml， 用水稀释至甲醛含量约为 0.005， 即为供试品 溶液， 取供试品溶液 lml， 置 50ml 比色管中， 加注射用水 4ml， 加品红亚硫酸溶液 10ml， 混合 酸 10ml， 摇匀，

39、 在 25 C 放置 3 小时， 用 590nm 波长测定吸光度。精确量取 0.005的甲醛 对照品溶液 0.5ml、 1.0ml、 1.5ml、 2.0ml， 置 50ml 比色管中， 同法操作， 测定吸光度。以甲醛 对照品溶液的浓度对相应的吸光度 0093 作线性回归分析， 计算样品含量。结果显示大流行流感裂解疫苗成品游离甲醛含 量分别为 5、 5、 6ug/ml， 低于 30ug/ml 的质量标准， 游离甲醛含量合格。 0094 (7) 铝含量 0095 我们对制备的大流行流感裂解疫苗进行了铝含量测定。结果为 1.4、 1.4、 1.4ug/ ml， 在 1.0-1.5ug/ml 的质量

40、标准之内， 铝含量合格。 0096 (8) 无菌试验 0097 我们对制备的大流行流感裂解疫苗成品进行了无菌试验检定。 将疫苗样品接种硫 乙醇酸盐培养基， 25放置增菌培养 3 天， 之后转种硫乙醇酸盐培养基、 改良马丁培养基、 以及琼脂斜面培养基各两支， 取琼脂斜面培养基和硫乙醇酸盐培养基各一支于 35培养， 其余培养基于25培养， 培养14天。 在整个观察期间大流行流感裂解疫苗成品所有的培养 基均没有细菌、 真菌生长， 无菌试验合格。 0098 (9) 细菌内毒素测定 0099 将待检的大流行流感裂解疫苗成品稀释后加入鲎试剂中， 各管以封口膜封口， 充 分混匀， 置37水浴1小时后观察结果

41、。 鲎试剂呈凝胶状， 倒转180不变形为阳性， 鲎试剂 呈液体或半固体状， 倒转180可流动为阴性。 同时作阴性对照、 供试品阳性对照、 灵敏度的 对照系列。 我们对大流行流感裂解疫苗成品进行了细菌内毒素检定， 阴性对照、 供试品阳性 对照、 以及灵敏度的对照系列均成立， 大流行流感裂解疫苗成品细菌内毒素含量分别为 12、 24、 12EU/ml， 低于 70EU/ml 质量标准， 细菌内毒素检测合格。 0100 (10) 异常毒性 0101 将大流行流感裂解疫苗成品分别注射小鼠和豚鼠， 观察 7 天， 在观察期内， 小鼠和 豚鼠均未死亡， 体重增加。结果表明， 大流行流感裂解疫苗成品异常毒性试验合格。 0102 (11) 大流行流感裂解疫苗成品检定结果汇总 0103 通过对大流行流感裂解疫苗成品的全面检定， 大流行流感裂解疫苗成品汇总检定 结果见表。 检定结果表明， 我们制备的大流行流感裂解疫苗各项检定项目均符合规定， 说明 疫苗制备工艺稳定， 产品质量能够保证。 说 明 书 CN 102406931 A