PH敏感性多糖纳米载药胶束及其制备方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410251163.7 (22)申请日 2014.06.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104162166 A (43)申请公布日 2014.11.26 (73)专利权人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上大路99号 (72)发明人 曹傲能 谢恩源 金荣 董伶俐 (74)专利代理机构 上海上大专利事务所(普通 合伙) 31205 代理人 陆聪明 (51)Int.Cl. A61K 47/48(2006.01) A61K 9/107(2006.0

2、1) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 103301472 A,2013.09.18, Qingguo Xu et al Self-Aggregates of Cholic Acid HydrazideDextran Conjugates as Drug Carriers . Journal of Applied Polymer Science .2005,第85卷 审查员 吴铁生 (54)发明名称 pH敏感性多糖纳米载药胶束及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种pH敏感性多糖纳米载药胶 束及其制备方法。 该载药胶束是

3、由氨基化的葡聚 糖中的一部分氨基在偶联剂1- （3-二甲氨基丙 基） -3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的作 用下通过酰胺键与疏水性胆酸结合， 形成双亲型 的共聚物， 另一部分氨基与阿霉素共价结合形成 pH敏感的腙键， 自组装形成载药胶束， 其中氨基 化的葡聚糖、 偶联剂、 疏水性胆酸和阿霉素的摩 尔比为： 1: （1.8-3.0） : （1.2-2.0） : （1.8-3.0） 。 该 载药胶束原料生物相容性好， 有着良好的生物降 解性， 同时原料廉价易得。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 104162166 B 2017.01.11 CN 104162166 B 1.一种p

4、H敏感性多糖纳米载药胶束的制备方法， 该载药胶束是由氨基化的葡聚糖中的 一部分氨基在偶联剂1- （3-二甲氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下 通过酰胺键与疏水性胆酸结合， 形成双亲型的共聚物， 另一部分氨基与阿霉素共价结合形 成 pH敏感的腙键， 自组装形成载药胶束， 其中氨基化的葡聚糖、 偶联剂、 疏水性胆酸和阿霉 素的摩尔比为： 1: （1.8-3.0） : （1.2-2.0） : （1.8-3.0） ； 其特征在于该方法具有以下的工艺步 骤： a.将干燥后的葡聚糖和催化剂用量的LiCl溶于无水N， N-二甲基甲酰胺 （DMF） 中， 加热 至完全溶解； 在冰浴下加

5、入催化剂用量吡啶和对硝基苯基氯甲酸酯， 搅拌， 室温下反应过 夜， 反应结束， 产物在乙醇中析出沉淀， 真空干燥， 得功能化的葡聚糖； 所述的葡聚糖与对硝 基苯基氯甲酸酯的10：（3-4） ； b. 将步骤a所得葡聚糖和肼基甲酸叔丁酯按 1: （1.5-2.0） 的摩尔比溶于N， N-二甲基 甲酰胺中， 再加入催化剂用量的吡啶； 惰性气氛保护下， 室温下搅拌反应1天； 反应结束后， 产物在乙醇中析出沉淀， 真空干燥， 得到带保护基团的氨基化葡聚糖； 将该带保护基团的氨 基化葡聚糖脱保护， 即得到氨基化葡聚糖； c、 将步骤b所得氨基化的葡聚糖Dex-NHNH2溶解MES 缓冲溶液中； 将胆酸和

6、偶联剂按1: （1.2-2.0） 的摩尔比溶于二甲亚砜中， 振荡溶解后逐滴加入到氨基化葡聚糖的MES缓冲溶液 中， 所述的氨基化的葡聚糖与胆酸的摩尔比为1: （1.2-2.0） ； 在惰性气氛保护下， 室温搅拌 反应3天； 反应结束后， 加入去离子水使溶液浑浊， 离心， 取上层清液， 用截留分子量3500的 透析袋透析， 透析时首先用0.05M的NaCl稀溶液中透析， 除去EDC和NHS， 之后用去离子水透 析， 得到葡聚糖-胆酸； d.将步骤c所得葡聚糖-胆酸、 盐酸阿霉素按1：（1.2-2.0） 的摩尔比溶于二甲亚砜中， 再 加入与葡聚糖-胆酸等摩尔量的三乙胺， 在惰性气氛保护下， 室温下

7、搅拌反应3天， 反应结束 后， 溶液用MWCO:1000透析， 得到pH敏感性多糖纳米载药胶束。 2.根据权利要求1所述的pH敏感性多糖纳米载药胶束， 其特征在于所述的葡聚糖的数 均分子量10000-20000。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104162166 B 2 pH敏感性多糖纳米载药胶束及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种pH敏感性多糖纳米载药胶束及其制备方法。 背景技术 0002 近年来， 恶性肿瘤的发病率居高不下， 已成为世界上致死率最高的疾病之一。 自药 物递送载体首次被提出以来， 聚合物胶束作为一个应用于癌症治疗的多功能纳米级药物平 台获得了越来越多的

8、关注。 聚合物胶束由亲水性基团和疏水性基团组成， 在水性介质中可 自聚集形成特殊的 “核-壳” 结构。 核为药物提供了储存空间， 壳能增强胶束在体液循环中的 稳定性。 0003 基于聚合物胶束的表面特性， 聚合物胶束可通过增强渗透和保留作用 （EPR） 效应 在肿瘤组织滞留并富集， 将药物尽量限制在肿瘤部位， 在提高对肿瘤组织杀伤力的同时减 少对正常组织的损伤。 但人们对于理想的用于癌症治疗的药物递送系统的期望远不止如 此。 0004 对环境响应性纳米载体的探索为化学药物的递送开拓了新的思路。 环境响应性纳 米载体除了具备纳米级的结构特点以外， 还能够在一定程度上模拟生物响应行为， 随着环 境

9、的微小变化而改变自身性能， 使整个递送系统成为优化治疗中的一个主动参与者， 而不 仅仅是一个被动的载体。 0005 肿瘤细胞的恶性增殖以无氧糖酵解为能量供给， 伴随着酵解产物乳酸的大量堆 积， 造成肿瘤组织的细胞外液pH值在5-6之间， 相比于血液和正常组织细胞外液(pH7.4)偏 酸。 基于上述差异， pH是最常见的用来设计环境响应性肿瘤靶向智能载体的环境触发因子 之一。 0006 葡聚糖作为一种水溶性多糖， 具有良好的生物相容性， 在体内可被降解成葡萄糖 单糖体， 无毒， 无害。 葡聚糖具有较高的反应活性， 易于和多种生物活性物质反应且价格低 廉， 容易获得。 葡聚糖的诸多优势使葡聚糖在生

10、物技术和生物制药等很多领域得到广泛应 用， 也越来越引起人们的重视， 是药物控制释放的潜在载体。 发明内容 0007 本发明的目的之一在于提供一种pH敏感性多糖纳米载药胶束。 0008 本发明的目的之二在于提供该载药胶束的制备方法。 0009 为达到上述目的， 本发明的构思为： 葡聚糖进行功能化， 之后与抗癌药物阿霉素通 过腙键共价结合， 自组装形成纳米载药胶束， 载药胶束可以在血液(弱碱性)循环时保持稳 定， 而一旦到达肿瘤组织或者进入细胞溶酶体中(弱酸性)， 负载抗癌药物阿霉素的腙键在 酸性条件会发生裂解断裂， 则能够迅速释放出阿霉素原药， 具有pH响应可控给药的效果， 从 而在增强阿霉素

11、化疗疗效的同时， 减少其对正常组织的毒副作用。 0010 氨基化的葡聚糖的反应机理为： 说 明 书 1/4 页 3 CN 104162166 B 3 0011 0012 0013 0014 说 明 书 2/4 页 4 CN 104162166 B 4 0015 0016 根据上述构思， 本发明采用如下技术方案： 0017 一种pH敏感性多糖纳米载药胶束， 其特征在于该载药胶束是由氨基化的葡聚糖中 的一部分氨基在偶联剂1- （3-二甲氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的作用 下通过酰胺键与疏水性胆酸结合， 形成双亲型的共聚物， 另一部分氨基与阿霉素共价结合 形成 pH敏感的腙键，

12、 自组装形成载药胶束， 其中氨基化的葡聚糖、 偶联剂、 疏水性胆酸和阿 霉素的摩尔比为： 1: （1.8-3.0） : （1.2-2.0） : （1.8-3.0） 。 0018 上述的葡聚糖的数均分子量10000-20000。 0019 一种制备上述的pH敏感性多糖纳米载药胶束的方法， 其特征在于该方法具有以下 的工艺步骤： 0020 a.将干燥后的葡聚糖和催化剂用量的LiCl溶于无水N， N-二甲基甲酰胺 （DMF） 中， 加热至完全溶解； 在冰浴下加入催化剂用量吡啶和对硝基苯基氯甲酸酯， 搅拌， 室温下反应 过夜， 反应结束， 产物在乙醇中析出沉淀， 真空干燥， 得功能化的葡聚糖； 所述的

13、葡聚糖与对 硝基苯基氯甲酸酯的10：（3-4） 。 0021 b. 将步骤a所得葡聚糖和肼基甲酸叔丁酯按 1: （1.5-2.0） 的摩尔比溶于N-二甲 基甲酰胺中， 再加入催化剂用量的吡啶； 惰性气氛保护下， 室温下搅拌反应1天； 反应结束 后， 产物在乙醇中析出沉淀， 真空干燥， 得到带保护基团的氨基化葡聚糖； 将该带保护基团 的氨基化葡聚糖脱保护， 即得到氨基化葡聚糖； 0022 c、 将步骤b所得氨基化的葡聚糖Dex-NHNH2溶解MES缓冲溶液中； 将胆酸和偶联剂 按1: （1.2-2.0） 的摩尔比溶于二甲亚砜中， 振荡溶解后逐滴加入到氨基化葡聚糖的MES缓冲 溶液中， 所述的氨基

14、化的葡聚糖与胆酸的摩尔比为1: （1.2-2.0） ； 在惰性气氛保护下， 室温 搅拌反应3天； 反应结束后， 加入去离子水使溶液浑浊， 离心， 取上层清液， 用截留分子量 3500的透析袋透析， 透析时首先用0.05M的NaCl稀溶液中透析， 除去EDC和NHS， 之后用去离 子水透析， 得到葡聚糖-胆酸； 0023 d.将步骤c所得葡聚糖-胆酸、 盐酸阿霉素按1：（1.2-2.0） 的摩尔比溶于二甲亚砜 中， 再加入与葡聚糖-胆酸等摩尔量的三乙胺， 在惰性气氛保护下， 室温下搅拌反应3天， 反 应结束后， 溶液用MWCO:1000透析， 得到pH敏感性多糖纳米载药胶束。 0024 与现有技

15、术相比， 本发明具有如下突出优点： 本发明利用一种新方法制备纳米载 药胶束， 该方法利用良好的生物相容性的多糖类物质葡聚糖， 通过pH敏感的腙键共价结合 说 明 书 3/4 页 5 CN 104162166 B 5 抗癌药物阿霉素， 自组装形成纳米载药胶束。 附图说明 0025 图1为本发明所得Dextran， Dex-NHNH-Boc， Dex-NHNH2的核磁 （1HNMR） 图。 0026 图2为本发明所得Dex-PNC， Dex-DCA的核磁 （1HNMR） 图。 具体实施方式 0027 下面结合附图， 本发明的具体实施的过程和步骤以及结果分析如下： 0028 实施例1 0029 a.

16、 称取葡聚糖5.0g （92.6mmol OH） 和LiCl 2.0g置于干燥的三口烧瓶中， 75下 真空干燥后， 加入50mL的无水N， N-二甲基甲酰胺 （DMF ） ， 90下溶解， 溶解后冷却， 冰浴下 加入吡啶(1.46g， 18.52mmol） 和对硝基苯基氯甲酸酯 （PNC）（1.87g， 9.26mmol） ， 搅拌， 室温 下反应过夜。 反应结束， 产物在乙醇中析出沉淀， 真空干燥后称重。 产物5.19g。 0030 b. 氨基化葡聚糖的制备 （Dextran-NHNH2） 。 反应分两步进行， 第一步先称取1g功 能化的葡聚糖(Dex-PNC)， 溶于5mL N， N-二甲

17、基甲酰胺 （DMF） 中， 加入肼基甲酸叔丁酯 （NH2NHBoc）（1.67mmol， 0.22g） 和吡啶 （2.22mmol， 175 L） 。 氮气保护， 室温下搅拌反应1天。 反应结束后， 产物在乙醇中析出沉淀， 真空干燥后称重。 产物0.89g。 0031 第二步将上一步反应的产物溶解在4mL的水中， 之后再加入5mL的三氟乙酸 （TFA） ， 氮气保护下搅拌反应2天。 产物用NaOH调节到pH为7， 得到的氨基化葡聚糖超滤纯化， 然后冷 冻干燥， 称重。 产物0.68g。 0032 c、 氨基化的葡聚糖Dex-NHNH2溶解5mL的MES 缓冲溶液中。 称取胆酸 （0.075mm

18、ol， 30mg） 溶于5mL二甲亚砜(DMSO)， 加入1- （3-二甲氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺 （EDC） （0.12mmol， 21.5mg） N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）（0.12mmol， 13.8mg） ， 振荡溶解后逐滴加入到 溶有氨基化葡聚糖的MES缓冲溶液中。 氮气保护下室温搅拌反应3天。 反应结束后， 加入10mL 的去离子水， 溶液浑浊， 离心， 取上层清液， 用截留分子量3500的透析袋透析， 透析时首先用 0.05M的NaCl稀溶液中透析， 除去EDC和NHS， 之后用去离子水透析。 透析完成后， 将纯净的产 物冷冻干燥， 称重， 产物0.58g。 0033

19、附图1和附图2表明由核磁图谱分析可知， H： 1,2,3， 3.00-5.00ppm是Dextran端基 的质子信号峰。 Dex-PNC核磁图中1HNMR （DMSO） ， 7.58和8.32ppm （H： 4,5） 分别是PNC苯环上 的氢， 表明葡聚糖已经功能化。 Dex-NHNHBoc 核磁图中1HNMR （D2O） ， 7.58和8.32ppm峰消失， 1.45 （ -NHNHBoc） Boc峰， Dex-NHNH2核磁图上Boc峰消失。 Dex-DCA核磁图中1HNMR （D2O） ， 0.615ppm 为胆酸上-CH3的特征峰。 0034 d . 将葡聚糖-胆酸 （Dex-DCA）

20、 溶于5mL二甲亚砜 （DMSO )， 加入盐酸阿霉素 （1.1mmol， 620mg） ， 三乙胺 （TEA）（0.709mmol， 71.7mg） ， 氮气保护室温下搅拌反应3天。 反应 结束后， 溶液用透析袋 （MWCO:1000） 透析， 透析时首先用二甲亚砜 （DMSO） 透析， 透析液颜色 由红色变澄清后， 然后用去离子水透析。 透析结束， 聚合物自组装形成胶束， 胶束避光保存。 0035 经DLS分析， 胶束的粒径145nm， 聚合物分布指数(PDI)分别为0.139。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104162166 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 104162166 B 7