1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510767646.7 (22)申请日 2015.11.11 A61K 9/06(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 38/30(2006.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 13/12(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 17/02(2006.01) (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 赵强 李宗金 冯国伟 张计敏 孔德领 (74)专利代理机构 上海胜康律师事务所 31263 代理人 樊英如
2、李献忠 (54) 发明名称 结合 IGF-1C 多肽的可注射性水凝胶及其用 于载体材料增强干细胞在组织损伤中的修复效果 (57) 摘要 本发明涉及一种结合胰岛素样生长因子 C 结 构域多肽 (IGF-1C) 的壳聚糖水凝胶， 其具有良好 的细胞相容性和生物活性。这类活性水凝胶具有 可注射性， 能够作为载体材料， 促进干细胞对组织 损伤的治疗效果。其为移植干细胞提供适宜的组 织再生微环境， 从而提高移植干细胞的存活率。 增 加干细胞在损伤区内的存活及驻留， 促进移植细 胞存活、 增殖， 减少凋亡， 促进损伤部位血管新生 以及功能恢复， 进而提高干细胞移植治疗组织损 伤的治疗效果。 此外， 移植后
3、水凝胶并没有促进干 细胞发生不良分化。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 附图2页 CN 106667899 A 2017.05.17 CN 106667899 A 1/1 页 2 1.一种壳聚糖水凝胶， 其特征在于， 所述壳聚糖水凝胶结合了胰岛素样生长因子 C 结 构域多肽 (IGF-1C)。 2.根据权利要求 1 所述的壳聚糖水凝胶， 其特征在于， 所述壳聚糖水凝胶既具备壳聚 糖生物材料的物理和化学性能， 也具有胰岛素样生长因子 C 结构域多肽的生物活性。 3.根据权利要求 1 所述的壳聚糖水凝胶的制备方法，
4、其包括 ： (1) 所述胰岛素样生长因子 C 结构域多肽通过化学反应共价键结合到壳聚糖分子上 ； 或者， (2) 所述胰岛素样生长因子 C 结构域多肽通过物理混合结合到壳聚糖中。 4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述化学反应是点击化学反应和/或 缩合反应。 5.根据权利要求 1 所述的壳聚糖水凝胶， 其特征在于， 所述壳聚糖水凝胶具有不同的 释放胰岛素样生长因子 C 结构域多肽的行为。 6.根据权利要求 1 所述的壳聚糖水凝胶， 其特征在于， 所述壳聚糖水凝胶通过结合胰 岛素样生长因子 C 结构域多肽方式来调控所述胰岛素样生长因子 C 结构域多肽的释放行 为。 7.根据权利要
5、求 1 所述的壳聚糖水凝胶， 其特征在于， 所述壳聚糖水凝胶具有可注射 性。 8.根据权利要求 1 所述的壳聚糖水凝胶在制备治疗组织损伤的干细胞载体中的应用。 9.根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于， 所述干细胞包括 ： 脂肪间充质干细胞、 骨 髓间充质干细胞、 脐带间充质干细胞、 胎盘间充质干细胞、 尿液来源干细胞、 内皮祖细胞、 或 心脏干细胞。 10.根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于， 所述组织损伤包括肾脏损伤、 心肌梗死 或皮肤缺损。 权 利 要 求 书 CN 106667899 A 2 1/13 页 3 结合 IGF-1C 多肽的可注射性水凝胶及其用于载体材料增 强
6、干细胞在组织损伤中的修复效果 技术领域 0001 本发明属于生物医用材料领域， 具体涉及一种结合 IGF-1C 结构域多肽的活性可 注射壳聚糖水凝胶的制备方法， 还涉及这类材料作为干细胞载体材料应用于组织损伤修 复， 增强干细胞的治疗效果 . 背景技术 0002 以干细胞为基础的细胞疗法可以为组织损伤治疗提供前景。 干细胞具有自我更新 和多向分化能力， 可以通过转分化、 旁分泌等方式参与肾脏修复。相比于药物， 干细胞治疗 组织损伤的一大优势在于其多样化的治疗作用可以靶向肾脏损伤病理生理学的多种机制 ； 内源性动员或外源性输注的干细胞归巢到受损肾脏， 一方面转分化为肾脏细胞直接补充丢 失的小管上
7、皮细胞， 另一方面可以发挥促进增殖、 减少凋亡、 促进血管新生、 减少炎症和调 节免疫反应等作用。但是， 使用外源性干细胞治疗组织损伤的过程中， 递送形式是一个挑 战。直接将细胞注射到组织损伤部位， 很难发生整体的整合。经脉管系统注射细胞需要避 免其被其他器官俘获， 而且需要细胞具有定向迁移的能力。 但在之前的研究中， 我们发现将 干细胞直接注射到缺血损伤部位， 1 周后仅有 1的细胞存活。这可能与细胞处于局部恶 劣 ( 缺血缺氧、 炎症、 缺乏基质保护 ) 的损伤环境有关。最近的研究显示生物支架材料作为 细胞载体在调节移植细胞在受损肾脏中的细胞命运方面体现出优势。 利用生物材料释放的 细胞外
8、基质与移植细胞相互作用可以改善局部微环境， 增强细胞的生物学作用， 并加快组 织的修复和再生。壳聚糖 (CS) 作为一种天然大分子化合物， 具有较好的组织相容性、 生物 可降解性及丰富的生物学活性。以 CS 为基础的多种类型支架材料已经在组织工程领域显 示出重要的应用价值。同时， 许多研究人员重视利用递送生长因子来增加组织工程化基质 的生物活性。由于蛋白具有免疫原性和生物活性丢失快的缺陷， 越来越多的研究支持使用 具有生物学功能的模拟活性多肽 ( 如 RGD， QK， QHREDGS) 来替代生长因子 ( 如纤维粘连蛋 白、 血管内皮生长因子、 血管生成素 -1) 的功能。胰岛素样生长因子 -
9、1(IGF-1) 是一种强大 的促有丝分裂和细胞存活的生长因子， 其被认为在调控临床肾病恢复中发挥关键作用。有 趣的是， 最近的研究发现 C 结构域 (IGF-1C) 是 IGF-1 蛋白的活性区域， 并且已经证明这一 多肽可以促进角膜上皮伤口愈合。从这一点上来看， 将活性多肽 IGF-1C 修饰于大分子生物 支架材料可能实现载体对移植细胞特定功能的增强， 从而为组织损伤修复提供新的视角。 发明内容 0003 本发明提供了一种壳聚糖水凝胶， 其特征在于， 所述壳聚糖水凝胶结合了胰岛素 样生长因子 C 结构域多肽 (IGF-1C)。 0004 本发明的壳聚糖水凝胶既具备壳聚糖生物材料的物理和化学
10、性能， 也具有胰岛素 样生长因子 C 结构域多肽的生物活性。 0005 本发明提供了上述壳聚糖水凝胶的制备方法， 其包括 ： (1) 胰岛素样生长因子 C 结 说 明 书 CN 106667899 A 3 2/13 页 4 构域多肽通过化学反应共价键结合到壳聚糖分子上 ； 或者， (2) 胰岛素样生长因子 C 结构域 多肽通过物理混合结合到壳聚糖中。 0006 在本发明的制备方法中， 所述化学反应是点击化学反应和 / 或缩合反应。 0007 本发明的壳聚糖水凝胶具有不同的释放胰岛素样生长因子 C 结构域多肽的行为。 0008 本发明的壳聚糖水凝胶通过结合胰岛素样生长因子 C 结构域多肽方式来调
11、控所 述胰岛素样生长因子 C 结构域多肽的释放行为。 0009 本发明的壳聚糖水凝胶具有可注射性。 0010 本发明的壳聚糖水凝胶在制备治疗组织损伤的干细胞载体中的应用。 0011 干细胞包括 ： 脂肪间充质干细胞、 骨髓间充质干细胞、 脐带间充质干细胞、 胎盘间 充质干细胞、 尿液来源干细胞、 内皮祖细胞、 心脏干细胞。 0012 组织损伤包括肾脏损伤、 心肌梗死以及皮肤缺损。 0013 本发明提供一种结合 IGF-1C 多肽的生物活性壳聚糖水凝胶的制备方法。 0014 1.IGF-1C 结构域多肽的制备方法 ： 0015 (1) 第一个氨基酸的 C 端接枝在树脂上， 接载率为 0.6 毫摩
12、尔 / 克。20的哌啶溶 于 N， N - 二甲基甲酰胺 (DMF) 用于脱除氨基的 Fmoc 保护基团 ； 0016 (2) 在缩合剂 O- 苯并三氮唑 - 四甲基脲六氟磷酸盐 (BTU) 和催化剂 N， N- 二异丙 基乙胺 (DIPEA) 的共同作用下， 下一个氨基酸的羧基与游离的氨基结合 ； 重复以上步骤， 多 肽链会不断增长 ； 0017 (3) 最后将分别将叠氮化的己酸或二元酸 ( 丁二酸、 己二酸、 癸二酸 ) 连接到多肽 的氨基上 ； 0018 (4) 用一定体积的 DMF 反复冲洗连有多肽的树脂 (5 分钟， 5 次 )， 之后再用 DCM 冲 洗 (1 分钟， 3 次 )
13、； 用三氟乙酸 (TFA) 处理干燥的树脂， 将多肽从树脂上脱离， 转移进入 TFA 溶液 ； 0019 (5) 收集溶液旋干， 得到浓缩溶液 ； 用冰冻乙醚处理， 离心， 得到沉淀 ； 0020 (6) 将沉淀溶于二甲基亚砜 (DMSO)， 使用高效液相色谱纯化得到 IGF-1C， 及末端 带有叠氮或羧基的多肽产物 IGF-1C-N3 或 IGF-1C-COOH。 0021 2. 通过点击化学反应共价结合 IGF-1C 多肽的壳聚糖的制备方法 ： 0022 碳二亚胺碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应 24 小时， 从而通过酰胺化反应将炔 基接枝到壳聚糖分子侧基上， 产物经透析纯化。第二步是通过点
14、击化学反应将碳二亚胺盐 酸盐催化下冰浴中反应 24 小时， 从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上， 产 物经透析纯化。第二步是通过点击化学反应将 IGF-1C-N3 与炔基化壳聚糖反应， 采用无水 硫酸铜、 抗坏血酸钠做催化剂， 恒温 37搅拌反应 24 小时， 产物经水透析 3 天， 冷冻干燥得 CS-IGF-1C。 0023 3. 通过缩合反应共价结合 IGF-1C 多肽的壳聚糖的制备方法 ： 0024 碳二亚胺碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应 24 小时， 从而通过酰胺化反应将炔 基接枝到壳聚糖分子侧基上， 产物经透析纯化。碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应 24 小 时， 从而通过
15、酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上， 产物经透析纯化。 0025 4. 共价结合 IGF-1C 的壳聚糖水凝胶的制备 ： 0026 (1) 将 CS-IGF-1C 以一定浓度 ( 质量体积分数 1-5 ) 溶解在水中 ； 说 明 书 CN 106667899 A 4 3/13 页 5 0027 (2)- 甘油磷酸钠 (-GP) 溶液滴加到壳聚糖溶液中， 冰水浴条件下搅拌 0.5 小 时 ； 0028 (3) 混合溶液转移至 37恒温箱中， 即可见凝胶化 ； 0029 (4) 混合溶液中 -GP 终浓度为 0.005-0.05M。 0030 5. 物理混合 IGF-1C 的壳聚糖水凝胶的制备
16、 ： 0031 (1)将壳聚糖以一定浓度(质量体积分数1-5)溶解到醋酸(1-3)溶液中， 室 温， 过夜 ； 0032 (2)调节溶液pH值至中性， 加入一定比例的IGF-1C多肽(多肽质量分数1-5)， 混合均匀 ； 0033 (3) 将 - 甘油磷酸钠 (-GP) 溶液滴加到壳聚糖溶液中， 冰水浴条件下搅拌 0.5 小时 ； 0034 (5) 混合溶液转移至 37恒温箱中， 5 分钟即可见凝胶化 ； 0035 (6) 混合溶液中 -GP 终浓度为 0.005-0.05 摩尔 / 升。 0036 本发明提供了利用结合 IGF-1C 多肽的活性水凝胶负载干细胞及细胞示踪的方 法。 0037
17、1. 脂肪间充质干细胞 (ADSCs) 提取与培养 0038 (1) 准备 ： 将手术器械 ( 弯头镊子 2 把， 眼科剪 2 把 ) 用纱布包好灭菌， 后置于烘 箱中烘干 ； 无血清培养基 (PS) 一管 ； 0039 (2) 选取 3 4 只 10 周龄雄性小鼠， 体重 20 克以上最佳， 利用脱颈的方法将小鼠 处死 ； 0040 (3) 用酒精均匀喷洒小鼠腿部以及腹部毛发， 用无菌的弯镊提起小鼠表皮， 用无菌 眼科剪小心分离小鼠皮肤和皮下肌肉组织 ； 0041 (4) 在小鼠大腿的根部有淡粉色的脂肪组织， 用剪刀仔细剥离并剪下， 置于无血清 培养基中暂时保存 ； 0042 (5) 沿小鼠
18、腹中线剪开小鼠的腹部肌肉层， 打开其腹腔， 在小鼠附睾附近， 分布有 两大块白色脂肪组织， 轻轻剥离去其它组织并将脂肪组织剪下暂时保存在无血清培养基 中 ； 0043 (6) 将盛有脂肪组织的离心管喷匀酒精充分消毒后， 移入超净台中， 将脂肪组织倒 入无菌培养皿中， 轻轻摇晃以洗涤脂肪组织 ； 0044 (7) 用无菌弯头镊将脂肪组织转移至一个新的盛有无菌 PBS 的培养皿中， 轻轻转 动培养皿洗涤脂肪组织。如此反复再洗涤脂肪组织 3 次。本步骤意在尽量去除小鼠毛发以 及组织内的细菌 ； 0045 (8)最后一遍洗涤后， 将脂肪组织转移至新培养皿中(无PBS)， 用无菌眼科剪将脂 肪组织尽量剪
19、碎 ( 本步骤利于后期酶的消化 ) ； 0046 (9) 用无血清培养基重悬剪碎了的脂肪组织， 转移至 50 毫升离心管中， 不加培养 基使总体积达到 35 毫升， 在 1500 转 / 分的条件下离心 5 分钟 ； 0047 (10) 离心后， 将液体用离心管小心吸弃， 保留漂浮在液面上及沉淀在底部的脂肪 组织， 后加入无菌的20毫升0.075的型胶原酶溶液， 用封口膜密封离心管， 在37水浴 摇床上消化 1 小时 ； 说 明 书 CN 106667899 A 5 4/13 页 6 0048 (11) 消化结束后， 补加培养基至总体积为 45 毫升， 在 1000 转 / 分钟条件下离心 5
20、 分钟 ； 0049 (12) 弃掉上清， 用 45 毫升的培养基再次洗涤细胞沉淀， 后弃上清 ； 0050 (13) 用 10 毫升 ADSCs 培养基重悬细胞沉淀， 并铺于 10 厘米细胞培养盘中 ； 0051 (14) 铺盘后第三天给细胞换半液， 第四天换全液， 以后每三天换一次全液， 直至细 胞长满， 此时的 ADSCs 即为原代 (P0) 细胞 ； 0052 (15)ADSCs长至90以上时可以传代， 传代时先吸弃培养基， 后用PBS清洗残余的 培养基， 然后再加入 2 毫升胰酶 - 乙二胺四乙酸溶液， 细胞培养箱孵育 4 分钟， 用 AD-MSCs 培养基中和胰酶， 于 1000
21、转 / 分钟离心， 重悬沉淀后分盘。通常的传代比例为 1:3。 0053 (16)ADSCs 的冻存 : 将生长良好的 P1 代细胞， 经消化后， 用 PBS 液洗涤 2 次， 用冻 存液(含90的全血清+10DMSO)重悬细胞， 逐滴加入冻存管中， 放入4冰箱预冷l0分 钟， 随后转移至冻存盒中放置于-80冰箱冻存48小时以上， 最后沉入液氮中长期保存。 冻 存细胞浓度为 l-5106/ 毫升。 0054 (17)ADSCs 的复苏 : 将冻存细胞从液氮取出， 置入 37水浴中 1-3 分钟， 待细胞完 全解冻， 用 DMEM 培养液稀释离心， 弃上清， 使沉淀重新悬浮于培养液中， 按 21
22、05/ 毫升接 种于 T75 细胞培养瓶。 0055 (18)ADSCs 的表型鉴定 ： 将 P3 的 ADSCs 按上述方法消化， 离心后用 PBS 重悬计数， 后向每个炮弹管中分装含有约 15 万个细胞的细胞悬液 ； 再次离心细胞 (1000 转 / 分钟 )， 收集沉淀， 用30微升的含有1FBS的PBS重悬细胞沉淀， 向各管中加入1微升的相应的流 式抗体 (CD45、 CD31、 CD44、 CD29、 CD90.2 以及 Sca-1)， 冰上孵育 30 分钟， 期间经常轻晃炮弹 管， 以防细胞沉淀 ； 染色结束后， 每管中加入 1 毫升的 PBS 溶液充分混匀后离心 ； 离心结束 后
23、弃上清， 再次重复洗涤3次 ； 最后一次洗涤结束弃上清后， 用300微升的PBS重悬细胞， 用 流式网过滤后转移至流式管中避光保存， 24 小时内上机分析 ； 以进行任何染色的 ADSCs 进 行空白对照， 利用流式细胞仪分析各抗体的阳性百分率。 0056 2. 体内化学发光成像评价 0057 (1) 经腹腔注射水合氯醛 (4， 350 毫克 / 千克 ) 麻醉小鼠 ； 0058 (2) 向小鼠经腹腔注射萤火虫荧光素酶底物 D-Luciferin(150 毫克 / 千克 ) ； 0059 (3) 底物注射 5 分钟后， 将小鼠放入小动物活体成像系统暗箱内， 摆放好体位 ( 俯 卧位 )， 将其
24、头部对准暗箱内出气孔 ； 0060 (4) 根据荧光信号强度调整曝光时间， 一般为 0.5-2 分钟， 连续采集图像直到信号 强度开始下降 ； 0061 (5) 数据分析 ： 使用 Living Image 软件测定每只小鼠的荧光信号强度， 进行统计 学分析。 0062 本发明提供了一种利用活性水凝胶负载脂肪间充质干细胞治疗缺血性肾脏损伤、 心肌梗死以及皮肤缺损的方法。 0063 1. 急性肾脏损伤及细胞治疗 0064 (1) 高压消毒手术器械， 使用医用酒精消毒手术台区域 ； 0065 (2)经腹腔注射水合氯醛(4， 350毫克/千克)麻醉小鼠， 于背部中部、 脊柱左侧 0.2 厘米处纵行切
25、开皮肤 (0.8-1 厘米 )， 分离皮下结缔组织， 离断背部肌肉进入腹腔， 探查 说 明 书 CN 106667899 A 6 5/13 页 7 并暴露左肾， 可见正常肾脏呈现鲜红色 ； 0066 (4) 用尖镊游离肾周脂肪及筋膜， 向左侧轻轻牵拉肾脏暴露肾蒂， 使用微型血管夹 略靠近肾脏夹闭肾蒂， 约 1 分钟可见肾脏出现淤血呈紫黑色 ； 0067 (5) 肾脏缺血期间， 使用浸沾温生理盐水的纱布覆盖切口并保持纱布湿润， 小鼠上 方暖灯照射并保持加热垫温度 (37 ) 恒定 ； 0068 (6)缺血40分钟后移除血管夹， 肉眼可见肾脏颜色即刻变为红色， 使用4-0丝线逐 层缝合肌层和皮肤关
26、闭背部切口 ； 0069 (7) 将小鼠置于加热垫上复温， 待苏醒后放回饲养笼。 0070 在肾脏缺血再灌注后 ( 对于重度损伤模型， 在对侧肾脏切除术后 )， 即刻行左肾内 递送细胞或水凝胶。 0071 (8) 使用镊子将肾脏轻轻提拉到体外， 用细棉条或纱布条包裹并固定肾脏， 防止其 掉回腹腔内 ； 0072 (9) 使用胰岛素注射器 (300 微升规格 ) 吸取输送介质 (PBS 或水凝胶， 30 微升 ) 负载的细胞(106ADSCs)， 于肾脏上极、 中部和下极三个部位轻轻刺入肾脏实质(深度约3毫 米 )， 缓慢轻推注射器 (10 微升 / 部位 )， 同时观察小鼠的呼吸频率 ； 00
27、73 (10) 注射完成后， 缓慢拔除注射器， 同时使用棉球按压进针处肾脏组织止血 1 分 钟。 0074 2. 治疗心肌梗死模型 ( 冠状动脉左前降支永久结扎 ) 建立及细胞 - 水凝胶移植 ： 0075 (1) 小鼠麻醉 ： 用 5的异氟烷气体预麻小鼠， 用医用胶带固定小鼠的四肢和头部 于手术板上， 剪开颈部气管， 气管插管后接通麻醉呼吸机正压通气， 调节异氟烷的含量约为 1 -1.5， 呼吸频率为 120 次 / 分钟 ； 0076 (2) 胸部备皮， 用医用酒精和碘伏进行消毒 ； 0077 (3) 行胸廓切开术， 于第四肋间处开胸并暴露心脏， 仔细撕开心包膜暴露小鼠左心 室前壁 ； 0
28、078 (4) 左冠状动脉起始端的下方距离左心耳约 1 毫米处， 用 7-0 的缝合线结 扎冠状动脉左前降支 ( 以结扎点下方心肌的颜色变浅发白或出现紫黑色且心电图 (electrocardiogram， ECG) 检测显示心肌电 ST 段抬高为结扎成功的标志 ； 0079 (5)结扎成功后于结扎位点左下、 右下各1毫米处分别注射10微升生理盐水、 细胞 生理盐水悬液、 水凝胶或凝胶 -ADSCs 复合物 ； 0080 (6) 关胸， 缝合肌肉和皮肤， 伤口用碘伏再次消毒， 妥善饲养。 0081 (7) 假手术对照组 ： 开胸， 穿线不接扎不移植任何细胞或溶液， 后关胸缝合肌肉。 0082 3
29、. 真皮层全层皮肤损伤模型的建立及细胞 - 水凝胶移植 ： 0083 (1) 裸鼠腹腔内注射 4水合氯醛进行全身麻醉。 0084 (2) 麻醉效果满意后， 75酒精消毒裸鼠背部皮肤 3 遍。 0085 (3) 用眼科剪剪除全层裸鼠皮肤及肉膜， 暴露肌肉层， 制备出面积为 l.0 平方厘米 的皮肤缺损区域。 0086 (4)IV3000 无菌不透水伤口敷料覆盖创面， 贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背 部皮肤。 0087 (5) 术后裸鼠单笼饲养， 自第 3 天起每隔 2 天更换创面敷料。 说 明 书 CN 106667899 A 7 6/13 页 8 0088 (6) 水凝胶 -ADSCs 以
30、1106/ 毫升的密度接种于水凝胶中， 各个实验组每只裸鼠 注射200微升生理盐水(不治疗组)、 细胞生理盐水悬液(单纯细胞组)、 水凝胶-ADSCs(对 照水凝胶与细胞组 )、 水凝胶。 0089 (7) 术后大体观测及愈合曲线测定， 每天观察并记录各组裸鼠的精神状态、 进食饮 水情况、 活动力、 大小便情况。 0090 (8) 术后每隔 2 天 ( 术后第 3、 6、 9、 l2 天 ) 麻醉后首先行活体成像检测， 然后去除 伤口敷料、 仔细清除创面渗出物、 痂皮， 观察创面有无感染、 创面愈合情况， 并进行创面拍照 同时以透明薄膜描印创面。 0091 (9) 拍照后， 创面重新用 IV3
31、000 无菌不透水伤口敷料贴膜覆盖， 贴膜边缘用伤口 粘合剂點附于裸鼠背部皮肤。使用 Image J 软件分析各组术后第 3、 6、 9、 l2 天残留创面面 积， 并绘制愈合曲线。 0092 本发明的优点和积极效果 ： 0093 我们使用IGF-1C修饰的水凝胶负载ADSCs通过直接注射的方式移植到损伤组织， 观察到组织学和功能学的恢复。这种治疗手段可以在早期显著增强存活的组织细胞增殖， 并在晚期通过结合 IGF-1C 的水凝胶与 ADSCs 的相互作用增加水凝胶注射区域和临近部位 的细胞增殖而建立有益的局部微环境 ； 水凝胶和细胞的联合移植还能够通过抑制 Bax 表达 而减少损伤后早期肾脏
32、细胞凋亡。该水凝胶具有有效的治疗作用、 无毒副作用、 损伤小、 适 合长期应用。 附图说明 0094 图1表示天然人源胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的氨基酸序列以及本发明合成的 C 结构域多肽 ； 0095 图 2 表示通过点击化学反应合成共价结合 IGF-1C 的壳聚糖 (CS-IGF-1C) 的步骤 ； 0096 图 3 表示不同浓度 CS-IGF-1C 水凝胶对于脂肪间充质干细胞体外活性的影响 ； 0097 图 4A 和 B 表示生物发光成像检测 CS-IGF-1C 水凝胶对脂肪间充质干细胞体外增 殖能力的影响 ； 0098 本发明结合附图和具体实施方式做进一步详细说明。 这些实施例
33、用来更具体地阐 述本发明， 并且如所附权利要求书提出的本发明的范围不限于实施例或受实施例的限制。 具体实施方式 0099 实施例 1 ： IGF-1C 修饰壳聚糖 (CS) 获得 CS-IGF-1C 的制备 0100 IGF-1C 多肽的固相合成 0101 IGF-1C多肽通过成熟的固相合成(SPPS)步骤， 使用2-chlorotrityl chloride树 脂和侧链被 tert-buty 基团保护且氨基被 Fmoc 保护的氨基酸合成。步骤为 ： 0102 1. 第一个氨基酸的 C 端接枝在树脂上， 接载率为 0.6 毫摩尔 / 克。20的哌啶溶 于 N， N - 二甲基甲酰胺 (DMF)
34、 用于脱除氨基的 Fmoc 保护基团 ； 0103 2. 在缩合剂小时 BTU 和催化剂 DIPEA 的共同作用下， 下一个氨基酸的羧基与游离 的氨基结合 ； 重复以上步骤， 多肽链会不断增长 ； 0104 3. 叠氮化己酸的合成 ： 6- 溴己酸乙酯与叠氮化纳在 DMF 中反应， 之后用氢氧化钠 说 明 书 CN 106667899 A 8 7/13 页 9 处理， 得到叠氮化的己酸 ； 0105 4. 最后将上一步的叠氮化己酸用同样的步骤连接到多肽的氨基上 ； 0106 5.用一定体积的DMF反复冲洗连有多肽的树脂(5分钟， 5次)， 之后再用DCM冲洗 (1 分钟， 3 次 ) ； 01
35、07 6. 用 TFA 处理干燥的树脂， 将多肽从树脂上脱离， 转移进入 TFA 溶液 ； 0108 7. 收集溶液旋干， 得到浓缩溶液 ； 用冰冻乙醚处理， 离心， 得到沉淀 ； 0109 8. 将沉淀溶于 DMSO， 使用高效液相色谱纯化得到带叠氮的多肽产物。 0110 炔基取代的壳聚糖 (alkynyl-CS) 的合成 0111 1. 将 CS 溶解于蒸馏水中， 向其中加入戊炔酸， 利用 1 摩尔 / 升盐酸 (HCL) 和 1 摩 尔 / 升氢氧化钠 (NaOH) 溶液调节 pH 值使 CS 完全溶解 ； 0112 2. 将 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (
36、EDC， 按照 EDC: 戊炔酸 3:1 的比例 ) 加入 CS 溶液中 ( 每半个小时加 1 次， 共 3 次 )， 期间冰浴 ； 0113 3. 在室温中反应 24 小时 ； 0114 4. 对产物进行透析 (5 毫摩尔 / 升 HCl 和 1wt NaCl， 2 天 ； 3 毫摩尔 / 升 HCl， 1 天 ； 1 毫摩尔 / 升 HCl， 2 天 ； 去离子水， 3 天， 4 ) ； 0115 5. 冻干获得终产物。 0116 CS-IGF-1C 的合成 0117 利用点击化学 (“click” 反应 ) 合成 CS-IGF-1C， 步骤如下 ： 0118 1. 在氮气保护条件下， 用
37、去离子水 (10 毫升 ) 溶解炔基取代 -CS。 0119 2. 点击反应条件 ： IGF-1-N3:CuSO4: 抗坏血酸钠的进料摩尔比为 1:0.2:0.4。 0120 3. 在 37条件下， 反应 24 小时 ； 0121 4. 使用去离子水透析 3 天 ； 0122 5. 通过冻干获得 CS-IGF-1C 材料 ； 0123 IGF-1 是 70 个氨基酸组成的单链多肽， 含 A、 B、 C 和 D 4 个结构域 ( 图 1)。 CS-IGF-1C 是通过对 IGF-1C-N3 的叠氮和炔基化壳聚糖的炔烃进行点击反应而合成的。首 先， 使用固相 Fmoc- 氨基酸化学法合成 IGF-
38、1 的 C 结构域的序列 (GYGSSSRRAPQT)。然后， 利 用缩合反应将 6- 叠氮基己酸连到 C 结构域的 N- 端获得 IGF-1C-N3(N3-GYGSSSRRAPQT)。而 后， 通过CS和4-戊炔酸的缩合反应合成炔基化壳聚糖。 最后， 利用点击反应合成CS-IGF-1C 复合物 ( 图 2)。向 CS-IGF-1C 溶液中加入 -GP 制备成可注射的水凝胶。利用 FT-IR 光谱 仪检测证明 CS-IGF-1C 复合物化学结构中具有 alkynyl-CS 所不具备的官能团结构。 0124 实施例 2 ： CS-IGF-1C 水凝胶的制备及性能评价 0125 CS-IGF-1C
39、 水凝胶的制备 0126 (1) 使用醋酸 (0.1 摩尔 / 升 ) 溶解 CS-IGF-1C(1.5， w/v)， 室温， 过夜 ； 0127 (2) 使用蒸馏水在透析膜 ( 截留分子量为 8kDa10kDa) 中对 CS 溶液进行透析， 1 周， 去除残余的醋酸 ； 0128 (3) 通过冻干获得 CS-IGF-1C 盐酸盐 ； 0129 (4)将冰浴的-GP溶液(2.29摩尔/升)滴加到CS溶液中， 冰浴条件下搅拌0.5 小时 ； 0130 (5) 混合溶液转移至 37恒温箱中， 5 分钟即可见凝胶化 ； 说 明 书 CN 106667899 A 9 8/13 页 10 0131 (6
40、)混合溶液中-GP终浓度为0.023摩尔/升， 经透析CS-IGF-1C/-GP溶液的 pH 值为 7.2。 0132 扫描电子显微镜观察水凝胶形貌 0133 将水凝胶冻干后， 放入干燥机中干燥 24 小时， 使用场致发射扫描电子显微镜观察 CS和CS-IGF-1C水凝胶的表面形态和多孔结构(加速电压为10千伏， 观察前材料表面喷金 处理 )。 0134 水凝胶流变学特性测试 0135 (1)流变测试使用AR 2000ex(TA instrument)流变仪完成， 使用25毫米不锈钢平 板圆盘夹具， 夹具间隙 400 微米， 温度设定为 25。每个样品每次测试需要 1 毫升溶液。 0136 (
41、2) 将 CS 溶液 ( 含有 0.023M-GP， p 小时值为 7.2) 和 CS-IGF-1C 溶液 ( 含有 0.023 摩尔 / 升 -GP， p 小时值为 7.12) 加入到流变仪中， 在 10 -50的温度范围内测 量样品的流变学特性。 0137 (3) 测试并记录水凝胶弹性模量 ( 储能模量 )(G ) 和粘性模量 ( 损耗模量 )(G” ) 随温度变化的改变情况， 频率为 1 弧度 / 秒。 0138 (4)使用相位滞后()来确定G 和G” 相等时的成胶温度。 在恒定加热速率(1/ 分钟 ) 的情况下改变温度。 0139 利用 SEM 观察冻干水凝胶的形态特征， 发现两种水凝
42、胶均具有均质互通的多孔网 状结构， 孔径大小为 50 微米 -100 微米， 足够用于干细胞递送。比较两种生物材料随温度变 化的流变学性质。随着温度从 10增至 50， CS-IGF-1C/-GP 和 CS/-GP 均显示出储 能模量 (G ) 的显著增加， 提示从溶液状态向凝胶状态转变的相变过程。CS-IGF-1C/-GP 的成胶温度为 35 -36， 与 CS/-GP 相似， 提示 CS-IGF-1C/-GP 也适合于在正常体温 条件下， 在体内原位成胶。 0140 实施例 3 ： CS-IGF-1C 的生物相容性 0141 CCK-8 染色 0142 我们将材料或水凝胶涂布于 96 孔板
43、 (5 微升 / 孔 )， 将孔板放置于温箱 (37 ) 孵 育 30 分钟 ( 而后直接使用或于 4储存 )。一方面， 为了评价不同浓度 CS-IGF-1C 材料对 于细胞活性的影响， 将材料按照 1、 1.5、 3、 5和 10的梯度涂布于孔板培养 ADSCs， 24 小时后进行 CCK-8 染色。另一方面， 为了比较 CS-IGF-1C 和 CS 水凝胶对于细胞增殖的影 响， 将两种水凝胶 ( 浓度为 3 ) 涂布于孔板培养 ADSCs， 24 小时后进行 CCK-8 染色。细胞 均按照 3104/ 孔的浓度铺盘 (4 孔 / 组 )。具体染色方法如下 ： 0143 1. 配制 CCK-
44、8 染色液 ( 按照 CCK-8 原液 : 完全培养基 1:9 进行稀释 ) ； 0144 2. 吸出培养基 ； 0145 3. 每孔加入 100 微升染色液， 将孔板放入温箱 (37 ) 孵育 4 小时 ； 0146 4. 吸出上清 (100 微升 ) 并转移到新的孔板中 ； 0147 5. 使用酶标仪检测 ( 吸光度 )OD 450 值 ； 0148 细胞活死染色 0149 如前述方法在 96 孔板中涂布 CS 或 CS-IGF-1C 水凝胶， 将 ADSCs 按照 3104/ 孔 的浓度铺盘 (4 孔 / 组 )。在培养后不同时间点， 进行活死染色评价细胞的活力。具体步骤 为 ： 说 明
45、 书 CN 106667899 A 10 9/13 页 11 0150 1. 配制染色剂 ( 按照 1:1000 稀释 ) ： 乙锭二聚体 -1(Etidium Homodimer-1) 和钙 绿素 -AM(calcein-AM) 各取 1 微升加入到 1 毫升基本培养基或 PBS 中。 0151 2. 吸去培养基， 轻轻加入 PBS 洗涤 (100 微升， 2 次 )。 0152 3. 每孔加入 100 微升染色剂， 将孔板放入温箱 (37 ) 孵育 30 分钟。 0153 4. 直接置于倒置荧光显微镜下观察， 活细胞被钙绿素 -AM 染成绿色， 死细胞被乙 锭二聚体 -1 染成红色。拍照、
46、 计数活细胞所占比例并进行统计分析。 0154 为了评价 CS-IGF-1C 材料的细胞相容性， 按照浓度梯度将其涂布于孔板培养 ADSCs， 24 小时后行 CCK-8 染色。发现 3浓度的材料组细胞的活性最优， 且为普通培养条 件下的 3 倍 (p80。这 说明体外长期培养情况下， CS-IGF-1C 和 CS 水凝胶没有细胞毒性。 0155 实施例 4 ： CS-IGF-1C 水凝胶促进 ADSCs 体外增殖并增强其抗凋亡能力 0156 体外细胞生物发光成像 0157 1. 使用 P3 代生长状态良好的 ADSCs， 胰酶消化后使用 -MEM 完全培养基重悬。 0158 2. 向不同条件
47、 ( 未处理、 CS 涂布、 CS-IGF-1C 涂布 ) 预处理的 96 孔板的每个孔中 分别加入一定浓度的 (3000 细胞 / 孔 ) 细胞悬液。 0159 3. 将细胞置于培养箱中进行培养， 24 小时后， 弃上清， PBS 洗 1 次。 0160 4. 向每个孔加入预先使用 PBS 溶液 1:100 稀释的 Fluc 的底物 (D-Luciferin)20 微升覆盖孔板底部。立即将孔板置入小动物活体成像系统暗箱内， 曝光 1 秒钟。 0161 5. 数据分析 ： 使用 Living Image 软件测定每孔细胞的荧光信号强度。 0162 利用 BLI 技术评价水凝胶对于 ADSCs
48、增殖的影响， 当 ADSCs 培养于 CS-IGF-1C 处 理的孔板时， 细胞增殖速度明显高于其他培养条件 (p0.05)( 图 4)。此外， 使用实时定量 RT-PCR 检测增殖相关基因表达情况， 结果显示相比于其他培养条件， 在 CS-IGF-1C 涂布孔 板上培养的 ADSCs 中 IGF-1、 HGF 和 EGF 基因表达急剧上升 (p0.05)。在体外利用 H2O2 对 在不同条件下 ( 未涂布材料组、 CS 涂布组和 CS-IGF-1C 涂布组 ) 培养的 ADSCs 诱导损伤， 评价 CS-IGF-1C 水凝胶是否对凋亡细胞具有保护作用。使用 BLI 技术检测细胞存活情况 使用实时定量 RT-PCR 评价凋亡相关基因 (Bax/Bad、 Caspase-9/-3 和 Fas/Fasl) 的表达水 平。结果显示， CS-IGF-1C 水凝胶涂布组细胞凋亡明显减轻， 且凋亡基因的表达急剧降低 (p0.05)。 0163 实施例 5 ： CS-IGF-1C 水凝胶促进 ADSCs 体内存活和增殖 0164 对 8-10 周龄 FV
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