一种蛋鸡输卵管炎造模方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710573093.0 (22)申请日 2017.07.14 (71)申请人 湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1 号 (72)发明人 张明军 姬晓琪 李兴安 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理 有限公司 11340 代理人 刘佳芳 (51)Int.Cl. A61K 31/05(2006.01) A61K 31/7004(2006.01) A61K 35/644(2015.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/2

2、2(2006.01) A61P 15/00(2006.01) (54)发明名称 一种蛋鸡输卵管炎造模方法 (57)摘要 本发明涉及一种蛋鸡输卵管炎的造模方法， 通过输卵管灌注法进行蛋鸡输卵管炎造模， 具体 包括以下步骤： 按照人工输精的方法， 将鸡倒立 保定， 使输卵管口外翻暴露， 用鸡输精管将造模 制剂灌注至输卵管的子宫部， 0.81.2mL/羽蛋 鸡， 然后保持鸡倒立姿势510min。 本发明的蛋 鸡输卵管炎造模方法具有可重复性好、 炎性特征 明显、 符合临床实际等优点， 可为蛋鸡输卵管炎 的相关研究提供试验手段。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 107412207 A 201

3、7.12.01 CN 107412207 A 1.一种蛋鸡输卵管炎造模方法， 其特征在于： 通过输卵管灌注法进行蛋鸡输卵管炎造 模， 具体包括以下步骤： 按照人工输精的方法， 将鸡倒立保定， 使输卵管口外翻暴露， 用鸡输 精管将造模制剂灌注至输卵管的子宫部， 灌注量为0.81.2mL/羽蛋鸡， 然后保持鸡倒立姿 势510min； 所述造模制剂按容积百分比， 其组分为2025的液化苯酚、 23的吐 温40或吐温20、 23的司盘40或司盘20、 812单糖浆或蜂蜜或葡萄糖， 其余为 pH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或生理盐水。 2.根据权利要求1所述蛋鸡输卵管炎造模方法， 其特征在于： 所述

4、造模制剂按容积百分 比， 其组分为20液化苯酚、 2.5吐温40、 2.5司盘40、 10单糖浆、 其余为pH7.2PBS。 3.根据权利要求1所述蛋鸡输卵管炎造模方法， 其特征在于： 所述造模制剂按容积百分 比， 其组分为20液化苯酚、 2.5吐温40、 2.5司盘40、 10蜂蜜、 其余为生理盐水。 4.根据权利要求1所述蛋鸡输卵管炎造模方法， 其特征在于： 所述造模制剂按容积百分 比， 其组分为25液化苯酚、 2.5吐温20、 2.5司盘20、 10单糖浆、 其余为pH7.2PBS。 5.根据权利要求1所述蛋鸡输卵管炎造模方法， 其特征在于： 所述造模制剂按容积百分 比， 其组分为25液

5、化苯酚、 2.5吐温20、 2.5司盘20、 10蜂蜜、 其余为生理盐水。 6.根据权利要求1所述蛋鸡输卵管炎造模方法， 其特征在于： 所述灌注量为1mL/羽蛋 鸡。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107412207 A 2 一种蛋鸡输卵管炎造模方法 技术领域 0001 本发明涉及实验动物病理模型造模方法， 特别是一种蛋鸡输卵管炎的造模方法， 可为蛋鸡输卵管炎的相关研究提供试验手段。 背景技术 0002 蛋鸡输卵管炎是蛋鸡的一种比较常发的疾病， 多发于蛋鸡的产蛋高峰期。 临床上 以出血性输卵管炎、 产蛋下降、 产蛋异常为特征， 并常常引发卵巢炎和腹膜炎， 给蛋鸡生产 带来较大的经济

6、损失。 输卵管炎的临床表现多种多样， 但以产蛋率下降和产异常蛋为主要 临床症状， 如产软壳蛋、 小蛋、 畸形蛋、 薄壳蛋、 砂壳蛋、 软壳蛋和带血蛋等。 引发此病的因素 非常复杂， 主要包括生物因素和饲养管理因素两大类。 生物因素包括病原微生物感染和寄 生虫侵袭， 饲养管理因素则包括营养缺乏(如维生素A、 D、 E等)、 饲料毒物(如玉米赤霉烯酮) 中毒、 营养过剩导致蛋体过大而破裂损伤输卵管、 人工输精操作不当引起输卵管损伤等。 为 研究其发病机理和药物的防治效果， 必需一种较为理想的蛋鸡输卵管炎造模方法以提供必 要的试验工具与手段。 0003 目前已经报道的蛋鸡输卵管炎造模方法很少， Po

7、rs等用剖腹术将0.1mL的大肠杆 菌(8.6106CFU/mL)注射入距离峡部57cm的输卵管内， 从而成功制成蛋鸡输卵管炎模 型。 Olsen等通过借鉴Pors等的方法制成蛋鸡输卵管炎模型。 这些方法虽然能成功造模， 但 很难应用于临床研究。 其主要不足表现在以下方面： 0004 1.由于要进行开腹手术， 操作难度大， 对手术环境要求较高， 费时费力， 同一时间 造模数量有限， 不能用于试验研究时大量造模； 0005 2.开服手术对蛋鸡的损伤很大， 容易继发全身感染， 造模成功后蛋鸡的生理指标 和生产性能变化很大， 不符合生产实际中蛋鸡输卵管炎的实际情况， 因而作为研究发病机 理和药物的防

8、治效果的模型不适合。 0006 其他实验动物如大鼠、 小鼠等的输卵管炎模型研究则有一些报道。 比较常用的有 病原微生物造模法。 此法是将混合菌、 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌或沙眼衣原体等病原微生 物注射进入输卵管， 从而制成动物输卵管炎模型。 此法虽然在大鼠、 小鼠等实验动物有所应 用， 但由于蛋鸡输卵管的解剖生理特点与大鼠小鼠差异性很大， 其泄殖腔为消化道、 生殖道 和泌尿道的共同开口， 因而输卵管长期接触消化道中的大肠杆菌等微生物， 从而对病原微 生物具有天然的抵抗力和很强的自愈能力。 因此这类方法用于蛋鸡输卵管炎造模， 往往不 能产生典型的输卵管炎， 即使用于大鼠小鼠等实验动物， 也具有

9、产生炎症的时间较长、 症状 较轻微、 剂量也不易掌握准确且易受到微生物毒力和机体免疫力的影响等缺点。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种可重复性好、 炎性特征明显、 符合临床实际的蛋鸡输 卵管炎造模方法， 为蛋鸡输卵管炎的相关研究提供试验手段。 0008 本发明的目的是通过如下途径实现的： 说 明 书 1/4 页 3 CN 107412207 A 3 0009 一种蛋鸡输卵管炎造模方法， 通过输卵管灌注法进行蛋鸡输卵管炎造模， 具体包 括以下步骤： 按照人工输精的方法， 将鸡倒立保定， 使输卵管口外翻暴露， 用鸡输精管将造 模制剂灌注至输卵管的子宫部， 灌注量为0.81.2mL/羽蛋

10、鸡， 然后保持鸡倒立姿势5 10min； 所述造模制剂按容积百分比， 其组分为2025的液化苯酚、 23的吐温40 或吐温20、 23的司盘40或司盘20、 812单糖浆或蜂蜜或葡萄糖， 其余为 pH7.2PBS或生理盐水。 0010 优选方案， 所述造模制剂按容积百分比， 其组分为20液化苯酚、 2.5吐温40、 2.5司盘40、 10单糖浆、 其余为pH7.2PBS(0.01mol/L)。 0011 优选方案， 所述造模制剂按容积百分比， 其组分为20液化苯酚、 2.5吐温40、 2.5司盘40、 10蜂蜜、 其余为生理盐水。 0012 优选方案， 所述造模制剂按容积百分比， 其组分为25

11、液化苯酚、 2.5吐温20、 2.5司盘20、 10单糖浆、 其余为pH7.2PBS(0.01mol/L)。 0013 优选方案， 所述造模制剂按容积百分比， 其组分为25液化苯酚、 2.5吐温20、 2.5司盘20、 10蜂蜜、 其余为生理盐水。 0014 上述配方中的单糖浆、 PBS组合， 蜂蜜、 生理盐水组合， 也可以用葡萄糖生理盐水替 代。 0015 优选方案， 所述造模制剂的灌注量优选为1mL/羽蛋鸡。 0016 本发明中造模制剂的各组成物的功效如下： 0017 液化苯酚： 腐蚀剂， 具有腐蚀输卵管黏膜的功能， 是造模的主要成分； 0018 吐温20： 表面活性剂， 具有增溶作用，

12、能将苯酚均匀分散， 防止局部苯酚浓度过高 而腐蚀作用过强； 0019 吐温40： 作用同吐温20， 可作为吐温20的替代品； 0020 司盘20： 表面活性剂， 具有增溶作用， 能调节吐温20的HLB值； 0021 司盘40： 作用同司盘20， 可作为司盘20的替代品； 0022 单糖浆： 保护剂， 缓和液化苯酚的腐蚀作用， 又可作为增稠剂， 防止造模制剂倒流 出来； 0023 蜂蜜： 作用同单糖浆， 可作为单糖浆的替代品； 0024 pH7.2PBS： 缓冲剂和稀释剂， 可维持造模制剂的pH值， 调节造模制剂的离子浓度， 并将液化苯酚稀释至所需的浓度。 0025 生理盐水： 稀释剂和离子浓度

13、调节剂， 调节造模制剂的离子浓度， 并将液化苯酚稀 释至所需的浓度， 亦可作为pH7.2PBS的替代品。 0026 本发明将自制的造模制剂， 通过输精管灌注到蛋鸡输卵管子宫部的方法， 成功制 造的单机输卵管炎的病理模型。 此法具有操作简单、 可重复性好、 炎性特征明显等优点， 可 为蛋鸡输卵管炎的相关研究提供试验手段。 成功解决了临床研究中没有稳定可靠的蛋鸡输 卵管炎造模方法的问题。 附图说明 0027 图1蛋鸡输卵管组织切片镜检结果(HE染色， 1010)， 其中A为空白对照组， B为造 模组。 说 明 书 2/4 页 4 CN 107412207 A 4 具体实施方式 0028 调配造模制

14、剂： 0029 1.20造模制剂的配制(以配制100mL为例)： 量取液化苯酚20mL， 加入2.5mL吐温 40， 2.5mL司盘40， 10mL单糖浆， 充分搅拌均匀， 加pH7.2PBS(0.01mol/L)定容至100mL， 置于 玻璃瓶中， 密封保存， 备用。 0030 2.20造模制剂的配制(以配制100mL为例)： 量取液化苯酚20mL， 加入2.5mL吐温 40， 2.5mL司盘40， 10mL蜂蜜， 充分搅拌均匀， 加生理盐水定容至100mL， 置于玻璃瓶中， 密封 保存， 备用。 0031 3.25造模制剂的配制(以配制100mL为例)： 量取液化苯酚25mL， 加入2.5

15、mL吐温 20， 2.5mL司盘20， 10mL单糖浆， 充分搅拌均匀， 加pH7.2PBS(0.01mol/L)定容至100mL， 置于 玻璃瓶中， 密封保存， 备用。 0032 4.25造模制剂的配制(以配制100mL为例)： 量取液化苯酚25mL， 加入2.5mL吐温 20， 2.5mL司盘20， 10mL蜂蜜， 充分搅拌均匀， 加生理盐水定容至100mL， 置于玻璃瓶中， 密封 保存， 备用。 0033 本发明中造模的具体步骤是： 0034 造模前， 每天早晚两次正常饲喂， 直至蛋鸡产蛋率稳定在90以上后开始造模， 参 照人工输精的方法， 一人抓鸡， 将鸡倒立保定， 使输卵管口外翻暴露

16、， 另一人用鸡输精管将 造模制剂1mL， 灌注至输卵管的子宫部， 保持鸡倒立姿势510min。 0035 每天需记录其产蛋量， 观察蛋形和临床表现等， 造模48h后随机取3羽蛋鸡肉眼及 光镜下观察输卵管组织， 并采血2mL， 取其血清用ELISA法检测其血清中的炎性因子IL-2、 IL-6、 TNF- 和IFN-的水平， 以判定造模效果。 0036 实施例1， 将10羽产蛋期的海兰灰蛋鸡随机分为2组， 每组5羽， 分别为空白对照组 和造模组。 造模组按前述方法用20造模制剂造模， 空白对照组不做处理。 观察并记录各组 蛋鸡的精神状态、 产蛋量以及产异常蛋情况。 0037 结果： 造模组蛋鸡造模

17、后出现疼痛不安、 腹部着地、 泄殖腔周围的羽毛被黄白色黏 性分泌物污染、 泄殖腔外翻且充血肿胀等临床症状， 并出现产带血蛋、 小型蛋、 软壳蛋、 沙壳 蛋等异常蛋的表现。 而空白对照组蛋鸡表现正常， 无上述表现。 0038 实施例2， 按实施例一分组和造模。 每组随机取3羽处死， 开腹观察腹腔、 卵巢及输 卵管情况。 0039 结果： 造模组蛋鸡腹腔内有少量积液， 淡黄色， 输卵管肿胀潮红， 直径变粗， 剖开后 管壁变厚， 管内有少量红黄色液体， 卵巢和其他腹腔器官无明显病变。 而空白对照组蛋鸡输 卵管外观正常， 无上述病理变化。 0040 实施例3， 按实施例1分组和造模。 每组随机取3羽处

18、死， 取输卵管子宫部切片观察。 0041 结果： 造模组输卵管上皮细胞脱落， 变性坏死， 大量中性粒细胞浸润， 并有弥漫的 趋势。 空白对照组的输卵管结构清晰， 无中性粒细胞浸润， 见图1。 0042 实施例4， 按实施例1分组和造模。 每组随机取3羽， 采血2mL， 用ELISA检测血清中炎 性因子IL-2、 IL-6、 TNF- 和IFN-的含量。 0043 结果： 造模组蛋鸡的血清中IL-2、 IL-6、 TNF- 和IFN-的含量均显著高于空白对 说 明 书 3/4 页 5 CN 107412207 A 5 照组， 见表1。 0044 表1 各组炎性因子IL-2、 IL-6、 TNF- 和IFN-含量比较 0045 0046 注： *表示与空白对照组差异显著， P0.05。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107412207 A 6 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 107412207 A 7