1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510054573.7 (22)申请日 2015.02.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104587488 A (43)申请公布日 2015.05.06 (73)专利权人 哈尔滨工业大学 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区西 大直街92号 (72)发明人 黄玉东 李大龙 贺金梅 李纪伟 黄鑫 程玮璐 吴亚东 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 侯静 (51)Int.Cl. A61K 47/54(2017.0
2、1) A61K 47/64(2017.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 9/19(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102846562 A,2013.01.02, CN 104192817 A,2014.12.10, CN 1843902 A,2006.10.11, CN 102302782 A,2012.01.04, Rachit等.Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles for Glu
3、cose- and pH- Stimulated Release of Insulin. Z.Anorg.Allg.Chem .2014,第640卷(第3-4 期),第616-623页. 审查员 彭翠莲 (54)发明名称 一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向 的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法 (57)摘要 一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向 的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法， 本发明 属于生物医用材料领域。 本发明是要解决现有方 法制备的载体不能特异性的识别靶细胞， 药物分 子大部分分布于正常组织并被正常细胞摄取， 而 病变组织中的药物分布较少， 造成药物递送能力 较低， 增加了药物
4、在体内的毒副作用的技术问 题。 方法： 一、 模板剂的准备； 二、 介孔羟基磷灰石 纳米粒子的制备； 三、 介孔羟基磷灰石的氨基化； 四、 介孔磷灰石的硼酸化； 五、 乳糖酸功能化牛血 清白蛋白的制备； 六、 具有pH响应性和细胞靶向 的介孔磷灰石纳米药物载体的制备。 本发明得到 的产物能靶向识别肝癌细胞， 减少了正常组织对 药物的摄取， 降低了药物在体内的毒副作用。 权利要求书3页 说明书12页 附图5页 CN 104587488 B 2017.10.03 CN 104587488 B 1.一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法， 其特征在于对肝癌细胞具有p
5、H响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法 是按以下步骤进行的： 一、 模板剂的准备： 将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中， 在搅拌速度为 250r/min400r/min下搅拌至得到清晰乳状液， 得到F127-泛酸钙混合液， 即得到模板剂； 步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1 (2.58)； 步骤一中所述 的F127与去离子水的质量比为1 (1567)； 二、 介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备： 将K2HPO43H2O溶解在去离子水中， 得到K2HPO4溶 液， 然后用NH3H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为1014， 再将pH值为1014
6、的K2HPO4溶 液以滴加速度为1.0g/min3.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中， 搅拌均 匀后采用水浴回流的方式进行加热， 控制水浴加热温度为60100， 回流时间为24h 48h， 完成水浴回流反应， 将水浴回流反应后的溶液过滤， 收集白色沉淀物， 将白色沉淀物在 温度为80150的真空条件下干燥12h24h， 得到干燥后的白色沉淀物， 然后将干燥后 的白色沉淀物在温度为200300下预烧2h6h， 再在马弗炉中煅烧， 控制煅烧温度为 500600， 煅烧时间为8h10h， 得到介孔羟基磷灰石纳米粒子； 步骤二中所述的K2HPO43H2O的质量与去离子水的体积比为
7、1g (1025)mL； 步骤二中 所述的pH值为1014的K2HPO4溶液中的K2HPO43H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙混合 液中F127的质量比为1 (0.51.5)； 三、 介孔羟基磷灰石的氨基化： 将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在 甲苯溶液中， 在搅拌速度为300r/min600r/min下搅拌10min30min后， 加入3-氨丙基三 甲氧基硅烷， 然后置于温度为6080的水浴锅中回流24h48h， 离心冷冻干燥后得到 氨基化的介孔磷灰石； 步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的 比为1g (40100)mL； 步骤三中所述
8、的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与3- 氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为1g (2.467)mL； 四、 介孔磷灰石的硼酸化 将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲基亚 砜溶液中， 然后在室温下以搅拌速度为400r/min600r/min搅拌2h4h， 得到氨基化的介 孔磷灰石分散液， 再将4-羧基苯硼酸、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物 和N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中， 然后在室温下以搅拌速度为 300r/min500r/min搅拌36h72h， 然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心1020次， 再真空干燥， 得到硼酸化的介孔磷灰石； 步
9、骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的体积 的比为1g (33100)mL； 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基苯硼 酸的质量比为(27.5) 1； 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙基- 3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(27.5) 1； 步骤四中所述的步骤 三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.23) 1； 五、 乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备 将乳糖酸、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳 化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.0的PBS缓冲溶液中， 然后在室温下
10、以搅拌速度为300r/min600r/min搅拌2h4h， 得到混合溶液A， 再将牛血清白蛋白加入混 权 利 要 求 书 1/3 页 2 CN 104587488 B 2 合溶液A中， 在室温下以搅拌速度为200r/min500r/min搅拌36h72h， 再冷冻干燥， 得到 乳糖酸功能化牛血清白蛋白； 步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量 比为(1.615) 1； 步骤五中所述的乳糖酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.615) 1； 步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g (33200)mL； 所述的PBS缓冲 溶液的摩尔浓度为0
11、.005mol/L0.02mol/L； 步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白的质 量比为(0.251.5) 1； 六、 具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备 将盐酸阿霉素或异 氰酸荧光素和步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于去离子水中， 在室温下以搅拌速度 为200r/min500r/min搅拌48h60h， 得到混合溶液B， 然后将步骤五得到的乳糖酸功能化 的牛血清白蛋白、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚 胺加入混合溶液B中， 然后在搅拌速度为300r/min500r/min的条件下搅拌24h48h， 然后 用pH值为7.4的PBS缓冲液
12、离心洗涤1020次， 再冷冻干燥， 得到介孔磷灰石纳米药物载体； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石的质 量比为1 (12.550)； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的体积 比为1mg (1030)mL； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖酸功 能化的牛血清白蛋白的质量比为1 (25125)； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素 与1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1 (12.575)； 步骤六 所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1 (12.550)； 步骤六 所述
13、的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L0.02mol/L。 2.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤一中在搅拌速度为350r/min下搅拌至得到清晰乳状 液。 3.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤二中再将pH值为11的K2HPO4溶液以滴加速度为2.0g/ min滴加到F127-泛酸钙混合液中。 4.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤二中搅拌均匀后采用水
14、浴回流的方式进行加热， 控 制水浴加热温度为100， 回流时间为24h， 完成水浴回流反应。 5.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤二中将干燥后的白色沉淀物在温度为250下预烧 4h。 6.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤二中再在马弗炉中煅烧， 控制煅烧温度为600， 煅 烧时间为10h， 得到介孔羟基磷灰石纳米粒子。 7.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤三中
15、将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀 分散在甲苯溶液中， 在搅拌速度为500r/min下搅拌20min后， 加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。 8.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 权 利 要 求 书 2/3 页 3 CN 104587488 B 3 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤三中所述的离心冷冻干燥参数为： 离心速度为 10000r/min， 温度为-50， 干燥时间为48h。 9.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法， 其特征在于步骤五中所述的冷冻干燥参数为： 温度为-50， 干燥时
16、间为36h。 10.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳 米药物载体的制备方法， 其特征在于步骤六中所述的冷冻干燥参数为： 温度为-55， 干燥 时间为48h。 权 利 要 求 书 3/3 页 4 CN 104587488 B 4 一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米 药物载体的制备方法 技术领域： 0001 本发明属于生物医用材料领域， 具体涉及一种具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷 灰石纳米药物载体的制备方法。 背景技术： 0002 随着恶性肿瘤发病率的逐年上升， 智能响应型药物输送体系越来越得到人们的关 注。 智能响应性体系是到达目标患
17、处后， 药物载体通过对周围环境的变化或外界刺激产生 智能响应， 达到可控释放药物的目的。 目前为止， 一系列响应性释放药物载体都已经被构 建， 像温度响应、 光响应、 超声波响应， 这类体系在体内循环中能够稳定的存在， 再刺激下通 过载体解离、 键断裂、 降解等方式释放药物， 但这些响应性释放药物都来自于外界附加刺 激， 而并非体内生理环境的自身变化， 这在一定程度上限制了其应用。 由于人体内正常组织 和病变状态之间存在着显著的pH梯度， 如人体的肿瘤胞外环境(pH 5.5-6.5)比正常血液或 组织(pH 7.4)偏酸性， 而且细胞内涵体和溶酶体的pH更低(pH 4.5-5.5)， 因此pH
18、响应性药 物释放体系是一类极具应用前景的智能药物传递系统。 设计一种pH响应的药物释放载体充 分利用体内环境的变化， 方便、 安全、 智能的在肿瘤组织或肿瘤细胞内选择释放药物， 达到 高效治疗的目的。 0003 目前为止， 大多数pH响应性药物输送体系都是通过引入pH响应型官能团达到响应 性释放药物的目的， 主要是有几种方法： 一种是在嵌段共聚物中引入氨基或羧酸根等官能 团， 利用酸碱度变化的质子化作用来改变体系的形态， 达到pH相应的能力； 另一种发展pH响 应药物载体的方法是利用对酸敏感的官能团如亚胺、 腙等作为连接药物分子和载体的纽带 形成药物缀合物， 通过该 “纽带” 酸性降解来释放药
19、物。 这些方法制备的载体不能特异性的 识别靶细胞， 药物分子大部分分布于正常组织并被正常细胞摄取， 而病变组织中的药物分 布较少， 造成药物递送能力较低， 增加了药物在体内的毒副作用。 因此， 设计一种细胞靶向 和pH型智能响应的药物载体， 使药物在正常组织 “零释放” 和在弱酸性病变组织中大量释放 仍然是一个大的挑战。 发明内容： 0004 本发明是要解决现有方法制备的载体不能特异性的识别靶细胞， 药物分子大部分 分布于正常组织并被正常细胞摄取， 而病变组织中的药物分布较少， 造成药物递送能力较 低， 增加了药物在体内的毒副作用的技术问题， 从而提供了一种对肝癌细胞具有pH响应性 和细胞靶向
20、的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。 0005 本发明的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体 的制备方法是按以下步骤进行的： 0006 一、 模板剂的准备： 将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中， 在搅拌速 度为250r/min400r/min下搅拌至得到清晰乳状液， 得到F127-泛酸钙混合液， 即得到模板 说 明 书 1/12 页 5 CN 104587488 B 5 剂； 0007 步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1 (2.58)； 步骤一中 所述的F127与去离子水的质量比为1 (1567)； 0008 二、 介孔羟基磷灰石纳
21、米粒子的制备： 将K2HPO43H2O溶解在去离子水中， 得到 K2HPO4溶液， 然后用NH3H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为1014， 再将pH值为1014的 K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min3.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中， 搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热， 控制水浴加热温度为60100， 回流时间为 24h48h， 完成水浴回流反应， 将水浴回流反应后的溶液过滤， 收集白色沉淀物， 将白色沉 淀物在温度为80150的真空条件下干燥12h24h， 得到干燥后的白色沉淀物， 然后将 干燥后的白色沉淀物在温度为200300下预烧2h6h
22、， 再在马弗炉中煅烧， 控制煅烧 温度为500600， 煅烧时间为8h10h， 得到介孔羟基磷灰石纳米粒子； 0009 步骤二中所述的K2HPO43H2O的质量与去离子水的体积比为1g (1025)mL； 步骤 二中所述的pH值为1014的K2HPO4溶液中的K2HPO43H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙 混合液中F127的质量比为1 (0.51.5)； 0010 三、 介孔羟基磷灰石的氨基化： 将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分 散在甲苯溶液中， 在搅拌速度为300r/min600r/min下搅拌10min30min后， 加入3-氨丙 基三甲氧基硅烷， 然后置于温度为6080
23、的水浴锅中回流24h48h， 离心冷冻干燥后 得到氨基化的介孔磷灰石； 0011 步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体 积的比为1g (40100)mL； 步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量 与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为1g (2.467)mL； 0012 四、 介孔磷灰石的硼酸化 将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲 基亚砜溶液中， 然后在室温下以搅拌速度为400r/min600r/min搅拌2h4h， 得到氨基化 的介孔磷灰石分散液， 再将4-羧基苯硼酸、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸 化物和N-羟基琥珀
24、酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中， 然后在室温下以搅拌速度为 300r/min500r/min搅拌36h72h， 然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心1020次， 再真空干燥， 得到硼酸化的介孔磷灰石； 0013 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的 体积的比为1g (33100)mL； 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基 苯硼酸的质量比为(27.5) 1； 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙 基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(27.5) 1； 步骤四中所述的 步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟
25、基琥珀酰亚胺的质量比为(1.23) 1； 0014 五、 乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备 将乳糖酸、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙 基碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.0的PBS缓冲溶液中， 然后在 室温下以搅拌速度为300r/min600r/min搅拌2h4h， 得到混合溶液A， 再将牛血清白蛋白 加入混合溶液A中， 在室温下以搅拌速度为200r/min500r/min搅拌36h72h， 再冷冻干 燥， 得到乳糖酸功能化牛血清白蛋白； 0015 步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的 质量比为(1.615) 1； 步骤五中所述的乳糖
26、酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.615) 说 明 书 2/12 页 6 CN 104587488 B 6 1； 步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g (33200)mL； 所述的PBS 缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L0.02mol/L； 步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白 的质量比为(0.251.5) 1； 0016 六、 具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备 将盐酸阿霉素 或异氰酸荧光素和步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于去离子水中， 在室温下以搅拌 速度为200r/min500r/min搅拌48h60h， 得到混合溶液B， 然后将步骤
27、五得到的乳糖酸功 能化的牛血清白蛋白、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀 酰亚胺加入混合溶液B中， 然后在搅拌速度为300r/min500r/min的条件下搅拌24h48h， 然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤1020次， 再冷冻干燥， 得到介孔磷灰石纳米药物 载体； 0017 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石 的质量比为1 (12.550)； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的 体积比为1mg (1030)mL； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖 酸功能化的牛血清白蛋白的质量
28、比为1 (25125)； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧 光素与1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1 (12.575)； 步 骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1 (12.550)； 步 骤六所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L0.02mol/L。 0018 本发明包括以下有益效果： 0019 1、 本发明制备的基于环酯键连接的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石药物载体， 制备工艺简单， 同时具又pH响应性和细胞靶向， 在药物投递领域具有广阔的应用前景。 0020 2、 本发明的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰
29、石纳米药物载体与 肝癌细胞表面的配体发生特异型反应， 能靶向识别肝癌细胞， 减少了正常组织对药物的摄 取， 降低了药物在体内的毒副作用。 0021 3、 本发明的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体通 过环酯键连接， 对pH具有良好的响应性， 在pH刺激下实现定时、 定量的释放药物分子， 有效 地提高了药物的利用率。 0022 4、 本发明具有良好的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药 物载体具有良好的生物相容性和生物降解性， 细胞毒性较小， 降解产物能被人体完全吸收。 0023 5、 本发明方法操作简单， 成本低廉， 实用性强。 附图说明 0024 图1
30、为验证试验(一)中介孔磷灰石纳米颗粒的TEM照片； 0025 图2为验证试验(一)中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/ 介孔磷灰石的TEM照片； 0026 图3为验证试验(二)中在不同pH值的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛 血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图； 其中， a为在pH值为7.4的PBS缓冲溶液刺激下试验 一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图； b为在pH值为6.8的PBS缓冲溶 液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图； c为在pH值为5.0 的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释
31、放曲线图； 说 明 书 3/12 页 7 CN 104587488 B 7 0027 图4为验证试验(三)中在pH值的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清 白蛋白/介孔磷灰石的 “爆发式” 释放曲线图； 0028 图5为验证试验(四)中肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷 灰石在共培养4h后的共聚焦扫描电镜图， 其中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞内 的分布情况； 0029 图6为验证试验(四)中肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷 灰石在共培养12h后的共聚焦扫描电镜图， 其中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞 内的分布情况； 0030 图7为
32、验证试验(四)中肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷 灰石在共培养24h后的共聚焦扫描电镜图， 其中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞 内的分布情况； 0031 图8为验证试验(五)中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋 白/介孔磷灰石和负载FITC的介孔磷灰石对肝癌细胞靶向性的量化分析柱形图； 其中a代表 负载FITC的介孔磷灰石， b代表试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介 孔磷灰石； 0032 图9为验证试验(五)中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋 白/介孔磷灰石对肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞靶向性的量化分析柱形图； 其中
33、a代表人脐 静脉内皮细胞， b代表肝癌细胞。 具体实施方式 0033 具体实施方式一： 本实施方式的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔 磷灰石纳米药物载体的制备方法是按以下步骤进行的： 0034 一、 模板剂的准备： 将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中， 在搅拌速 度为250r/min400r/min下搅拌至得到清晰乳状液， 得到F127-泛酸钙混合液， 即得到模板 剂； 0035 步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1 (2.58)； 步骤一中 所述的F127与去离子水的质量比为1 (1567)； 0036 二、 介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备： 将K
34、2HPO43H2O溶解在去离子水中， 得到 K2HPO4溶液， 然后用NH3H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为1014， 再将pH值为1014的 K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min3.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中， 搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热， 控制水浴加热温度为60100， 回流时间为 24h48h， 完成水浴回流反应， 将水浴回流反应后的溶液过滤， 收集白色沉淀物， 将白色沉 淀物在温度为80150的真空条件下干燥12h24h， 得到干燥后的白色沉淀物， 然后将 干燥后的白色沉淀物在温度为200300下预烧2h6h， 再在马弗炉中煅烧
35、， 控制煅烧 温度为500600， 煅烧时间为8h10h， 得到介孔羟基磷灰石纳米粒子； 0037 步骤二中所述的K2HPO43H2O的质量与去离子水的体积比为1g (1025)mL； 步骤 二中所述的pH值为1014的K2HPO4溶液中的K2HPO43H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙 混合液中F127的质量比为1 (0.51.5)； 0038 三、 介孔羟基磷灰石的氨基化： 将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分 说 明 书 4/12 页 8 CN 104587488 B 8 散在甲苯溶液中， 在搅拌速度为300r/min600r/min下搅拌10min30min后， 加入3-氨
36、丙 基三甲氧基硅烷， 然后置于温度为6080的水浴锅中回流24h48h， 离心冷冻干燥后 得到氨基化的介孔磷灰石； 0039 步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体 积的比为1g (40100)mL； 步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量 与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为1g (2.467)mL； 0040 四、 介孔磷灰石的硼酸化 将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲 基亚砜溶液中， 然后在室温下以搅拌速度为400r/min600r/min搅拌2h4h， 得到氨基化 的介孔磷灰石分散液， 再将4-羧基苯硼酸、 1-乙基-3-3-二甲
37、基氨基丙基碳化二亚胺盐酸 化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中， 然后在室温下以搅拌速度为 300r/min500r/min搅拌36h72h， 然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心1020次， 再真空干燥， 得到硼酸化的介孔磷灰石； 0041 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的 体积的比为1g (33100)mL； 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基 苯硼酸的质量比为(27.5) 1； 步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙 基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(27.5) 1； 步骤四中所
38、述的 步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.23) 1； 0042 五、 乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备 将乳糖酸、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙 基碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.0的PBS缓冲溶液中， 然后在 室温下以搅拌速度为300r/min600r/min搅拌2h4h， 得到混合溶液A， 再将牛血清白蛋白 加入混合溶液A中， 在室温下以搅拌速度为200r/min500r/min搅拌36h72h， 再冷冻干 燥， 得到乳糖酸功能化牛血清白蛋白； 0043 步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的 质量
39、比为(1.615) 1； 步骤五中所述的乳糖酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.615) 1； 步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g (33200)mL； 所述的PBS 缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L0.02mol/L； 步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白 的质量比为(0.251.5) 1； 0044 六、 具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备 将盐酸阿霉素 或异氰酸荧光素和步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于去离子水中， 在室温下以搅拌 速度为200r/min500r/min搅拌48h60h， 得到混合溶液B， 然后将步骤五得到的乳糖酸功 能
40、化的牛血清白蛋白、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀 酰亚胺加入混合溶液B中， 然后在搅拌速度为300r/min500r/min的条件下搅拌24h48h， 然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤1020次， 再冷冻干燥， 得到介孔磷灰石纳米药物 载体； 0045 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石 的质量比为1 (12.550)； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的 体积比为1mg (1030)mL； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖 酸功能化的牛血清白蛋白的质量比为1 (25125
41、)； 步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧 光素与1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1 (12.575)； 步 说 明 书 5/12 页 9 CN 104587488 B 9 骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1 (12.550)； 步 骤六所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L0.02mol/L。 0046 本实施方式中所述的模板剂F127为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物； 0047 本实施方式中所述的PBS缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。 0048 本实施方式包括以下有益效果： 0049 本实施方式包括以下有益效果： 005
42、0 1、 本实施方式制备的基于环酯键连接的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石药物 载体， 制备工艺简单， 同时具又pH响应性和细胞靶向， 在药物投递领域具有广阔的应用前 景。 0051 2、 本实施方式的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载 体与肝癌细胞表面的配体发生特异型反应， 能靶向识别肝癌细胞， 减少了正常组织对药物 的摄取， 降低了药物在体内的毒副作用。 0052 3、 本实施方式的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载 体通过环酯键连接， 对pH具有良好的响应性， 在pH刺激下实现定时、 定量的释放药物分子， 有效地提高了药物的利用率。 0053
43、4、 本实施方式具有良好的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳 米药物载体具有良好的生物相容性和生物降解性， 细胞毒性较小， 降解产物能被人体完全 吸收。 0054 5、 本实施方式方法操作简单， 成本低廉， 实用性强。 0055 具体实施方式二： 本实施方式与具体实施方式一不同的是： 步骤一中所述的模板 剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为2.0 10.12。 其他步骤及参数与具体实施方式一相同。 0056 具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式一或二不同的是： 步骤一中所述的 模板剂F127的质量与去离子水的体积比为2.0g 80mL。 其他步骤及参数与具体实施方式一 或二
44、相同。 0057 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是： 步骤一中在 搅拌速度为350r/min下搅拌至得到清晰乳状液。 其他步骤及参数与具体实施方式一至三之 一相同。 0058 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是： 步骤二中所 述的K2HPO43H2O的质量与去离子水的体积比为2.8g 40mL。 其他步骤及参数与具体实施方 式一至四之一相同。 0059 具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是： 步骤二中所 述的pH值为11的K2HPO4溶液中的K2HPO43H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中 F127的质
45、量比为2.8 2.0。 其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。 0060 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是： 步骤二中将 K2HPO43H2O溶解在去离子水中， 得到K2HPO4溶液， 然后用NH3H2O调解K2HPO4溶液的pH值至 pH值为11。 其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。 0061 具体实施方式八： 本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是： 步骤二中再 将pH值为11的K2HPO4溶液以滴加速度为2.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中。 其他步骤及 参数与具体实施方式一至七之一相同。 说 明 书 6/12 页 10 CN 1
46、04587488 B 10 0062 具体实施方式九： 本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是： 步骤二中搅 拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热， 控制水浴加热温度为100， 回流时间为24h， 完成 水浴回流反应。 其他步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。 0063 具体实施方式十： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是： 步骤二中将 白色沉淀物在温度为100的真空条件下干燥48h， 得到干燥后的白色沉淀物。 其他步骤及 参数与具体实施方式一至九之一相同。 0064 具体实施方式十一： 本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是： 步骤二中 将干燥后的白色沉淀物在温度为250下
47、预烧4h。 其他步骤及参数与具体实施方式一至十 之一相同。 0065 具体实施方式十二： 本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是： 步骤二 中再在马弗炉中煅烧， 控制煅烧温度为600， 煅烧时间为10h， 得到介孔羟基磷灰石纳米粒 子。 其他步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。 0066 具体实施方式十三： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是： 步骤三 中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为2.1g 120mL。 其他步骤及参数与具体实施方式一至十二之一相同。 0067 具体实施方式十四： 本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是： 步
48、骤三 中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积 比为2.1g 8.5mL。 其他步骤及参数与具体实施方式一至十三之一相同。 0068 具体实施方式十五： 本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是： 步骤三 中将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中， 在搅拌速度为500r/ min下搅拌20min后， 加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。 其他步骤及参数与具体实施方式一至十 四之一相同。 0069 具体实施方式十六： 本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是： 步骤三 中然后置于温度为60的水浴锅中回流36h。 其他步骤及参数与具体实施方式一至十五之 一相同。 0070 具体实施方式十七： 本实施方式与具体实施方式一至十六之一不同的是： 步骤三 中所述的离心冷冻干燥参数为： 离心速度为10000r/min，
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