1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510353115.3 (22)申请日 2009.10.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105147683 A (43)申请公布日 2015.12.16 (30)优先权数据 61/195,312 2008.10.06 US 12/586,849 2009.09.29 US (62)分案原申请数据 200980139366.4 2009.10.06 (73)专利权人 奥科瑞纳有限公司 地址 瑞典哥德堡S-411 26艾瑞克-达尔伯 格斯格坦街11A (7
2、2)发明人 燕妮尼斯特伦 莉萨布瓦尔 乌尔夫尼尔松 伯耶哈拉尔德松 (74)专利代理机构 北京乾诚五洲知识产权代理 有限责任公司 11042 代理人 付晓青 李广文 (51)Int.Cl. A61K 31/444(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 FULDE K ET AL. “Efficiency of Hemoperfusion materia1s at removing the funga1 toxin ore11anine from human plasma” . DIE PHARMAZIE .1998,第53卷(第1 期),58-59. HE
3、UFLER， C ET AL. “Investigations on the” . Agents and Actions .1987,第21卷(第 1/2期),203-208. RUEDL C ET AL. “THE TOXIC ACTION OF ORELLANINE AND OTHER DIPYRIDYLS ON DIFFERENT EPITHELIAL CELL CULTURES LLC- PK-1 CACO-2 AND OK” . MYCOLOGIA HELVETICA .1990,第4卷(第1期),99-109. NILSSON ET AL. “The fungal nephroto
4、xin ” . FREE RADICAL BIOLOGY AND MEDICINE .2008,第44卷(第8期),1562-1569. 审查员 刘桂英 (54)发明名称 用于肾脏细胞癌的治疗的3,3 ,4， 4 -四羟 基-2,2 -联吡啶-N,N -二氧化物 (57)摘要 本发明提供了通过利用特定的施用方案和 给药方式来施用某些3， 3 ， 4， 4 -四羟基-2， 2 - 联吡啶-N， N -二氧化物化合物， 特别是3， 3 ， 4， 4 -四羟基-2， 2 -联吡啶-N， N -二氧化物(奥来 毒素)治疗肾脏癌症的方法， 以及适用于所提供 的治疗方法的药物组合物。 权利要求书2页 说明
5、书15页 附图8页 CN 105147683 B 2019.01.22 CN 105147683 B 1.一种根据式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗患有肾细胞癌或对肾 细胞癌易感的患者的药物中的应用， 其中： R1、 R2、 R3和R4选自： 氢、 氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐、 氟、 氯、 溴、 C1-C6烷基、 C1-C6烯基、 C1-C6炔基、 C1-C6烷醇基、 C1-C6烯醇基、 C1-C6烷氧基、 C1-C6烯氧基， 其每一个任选进一步 被氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐、 氟、 氯、 溴取代； 所述化合物以两个或更多个剂量中施用， 并且每个剂量为0.5mg/kg到10
6、mg/kg之间的 所述化合物。 2.如权利要求1所述的应用， 其中， R1、 R2、 R3和R4是氢。 3.如权利要求1或2所述的应用， 其中， 连续的剂量以两到七天之间的间隔施用。 4.如权利要求1或2所述的应用， 其中， 每天施用所述化合物。 5.如权利要求4所述的应用， 其中， 在静脉内、 皮下或腹膜内施用所述化合物。 6.一种用于治疗肾细胞癌的药物组合物， 所述药物组合物包含至少一种药学上可接受 的载体和5mg到2,500mg的根据式(I)的化合物： 其中： R1、 R2、 R3和R4选自： 氢、 氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐、 氟、 氯、 溴、 C1-C6烷基、 C1-C6烯基、
7、C1- C6炔基、 C1-C6烷醇基、 C1-C6烯醇基、 C1-C6烷氧基、 C1-C6烯氧基， 其每一个任选进一步被氨 基、 巯基、 羧基、 磷酸盐、 氟、 氯、 溴取代， 或等摩尔数量的其药学上可接受的盐。 7.如权利要求6所述的药物组合物， 其中， R1、 R2、 R3和R4是氢。 8.如权利要求6或7所述的药物组合物， 其中， 所述组合物被配制用于向患者静脉内、 皮 下或腹膜内施用。 9.一种用于治疗患有肾细胞癌的试剂盒， 所述试剂盒包含至少一种药学上可接受的载 体和5mg到2,500mg根据式(I)的化合物： 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105147683 B 2 其
8、中： R1、 R2、 R3和R4选自： 氢、 氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐、 氟、 氯、 溴、 C1-C6烷基、 C1-C6烯基、 C1- C6炔基、 C1-C6烷醇基、 C1-C6烯醇基、 C1-C6烷氧基、 C1-C6烯氧基， 其每一个任选进一步被氨 基、 巯基、 羧基、 磷酸盐、 氟、 氯、 溴取代， 或等摩尔数量的其药学上可接受的盐。 10.如权利要求9所述的试剂盒， 其中， 组合所述根据式(I)的化合物或其药学上可接受 的盐， 以及药学上可接受的载体一起施用， 从而所述根据式(I)的化合物或其药学上可接受 的盐完全地或基本上溶于所述载体中。 11.如权利要求9或10所述的试剂盒，
9、其中， 所述化合物被配制用于向患者静脉内、 皮下 或腹膜内施用。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105147683 B 3 用于肾脏细胞癌的治疗的3,3 ,4， 4 -四羟基-2,2 -联吡啶- N,N -二氧化物 发明领域 0001 本发明通常涉及癌症治疗。 更具体地， 本发明涉及3， 3 ， 4， 4 -四羟基 -2， 2 -联吡 啶-N， N -二氧化物， 特别是3， 3 ， 4， 4 -四羟基-2， 2 -二吡啶-N， N - 二氧化物(奥来毒素， Orellanine)用于肾脏癌症、 特别是来源于近端肾小管细胞的肾细胞癌的治疗的用途。 0002 发明背景 0003 癌症以
10、超过100种不同的形式出现， 影响身体的几乎每一个部分。 在整个生命过程 中， 身体中的健康细胞以受控的方式分裂、 生长和替换自身。 当指示这种细胞分裂的基因功 能失常以及细胞开始不受控制地增殖和生长时产生癌症。 这些异常细胞的团块或簇集物被 称为肿瘤。 不是所有肿瘤都是癌性的。 良性肿瘤， 例如， 痣， 停止生长， 并且不波及身体的其 他部分。 然而， 癌性或恶性肿瘤继续生长和覆盖健康细胞， 干扰身体功能， 从身体组织抽取 营养。 恶性肿瘤可以通过称为转移的过程扩散到身体的其他部分。 来自 “母体肿瘤” 的细胞 脱离， 取决于肿瘤而经由血液或淋巴管、 或是在胸部、 腹部或骨盆内迁移， 并且它
11、们最终在 身体其他部位形成新的肿瘤。 0004 肾脏的癌症构成了所有实体肿瘤的约3。 约85的肾脏肿瘤被分类为肾细胞癌 (RCC)。 约80诊断的RCC发源于肾脏的成尿管、 肾小管的近端部分内衬的上皮细胞。 取决于 它在显微镜下的外观， 这种癌症类型被称为肾脏透明细胞癌(RCCC， 65)或肾脏乳头状细 胞癌(RPCC， 15)。 虽然RCCC和RPCC构成诊断的RCC的80， RCCC和RPCC是接近100的来 自肾细胞癌的死亡的原因。 0005 在预测预后中最重要的因子是期。 期描述了癌症的大小和它传播超出肾脏的深 度。 美国癌症联合委员会(AJCC)的分期系统被称为TNM 系统。 跟随有
12、从1到3的数字的字母T 描述了肿瘤的大小和对附近组织的波及。 更高的T数字表明更大的肿瘤和/或对肾脏附近组 织的更广泛的波及。 跟随有从0到2的数字的字母N表明癌症是否波及肾脏附近的淋巴结， 以 及如果波及， 有多少淋巴结受到影响。 跟随有0或1的字母M表明癌症是否波及远端器官。 0006 I期： 肿瘤是7cm(约2 3/4英寸)或更小， 并且限于肾脏。 没有对淋巴结或远端器官 的扩散。 0007 II期： 肿瘤大于7.0cm但仍然限于肾脏。 没有对淋巴结或远端器官的扩散。 0008 III期： 包括任何大小的肿瘤， 有或者没有对肾脏周围脂肪组织的扩散， 有或者没 有进入从肾脏到心脏的大静脉的
13、扩散， 有对一个附近的淋巴结的扩散， 但是没有对远端淋 巴结或其他器官的扩散。 III期还包括扩散到肾脏周围的脂肪组织和/或扩散到从肾脏到心 脏的大静脉的肿瘤， 其没有扩散到任何淋巴结或其他器官。 0009 IV期： 这个期包括已经直接扩散环绕肾脏的整个脂肪组织和筋膜韧带样组织的任 何癌症。 IV期还包括已经扩散超过一个靠近肾脏的淋巴结、 不靠近肾脏的任何淋巴结， 或已 经扩散任何其他器官(例如， 肺、 骨骼或大脑)的任何癌症。 0010 肾肾脏细胞癌的T、 N、 M类别和期组群的详细定义： 0011 原发性肿瘤(T)： 说 明 书 1/15 页 4 CN 105147683 B 4 0012
14、 TX： 未能评估原发性肿瘤 0013 T0： 无原发性肿瘤证据 0014 T1： 肿瘤7cm或更小， 限于肾脏 0015 T2： 肿瘤大于7cm， 限于肾脏 0016 T3： 肿瘤扩展到主要静脉/肾上腺/肾周组织； 不超过杰氏筋膜(Gerota s fasica) 0017 T3a： 肿瘤侵入肾上腺/肾周的脂肪 0018 T3b： 肿瘤扩展到肾静脉或隔膜下的腔静脉 0019 T3c： 肿瘤扩展到隔膜上的腔静脉 0020 T4： 肿瘤侵入杰氏筋膜以外 0021 N-局部淋巴结 0022 NX： 未能评估局部淋巴结 0023 N0： 没有局部淋巴结转移 0024 N1： 单个局部淋巴结中的转移
15、0025 N2： 超过一个局部淋巴结的转移 0026 M-远距离转移 0027 MX： 未能评估远距离转移 0028 M0： 没有远距离转移 0029 M1： 远距离转移 0030 根据经验， I或II期的癌症通过受累肾脏的外科去除来治疗并且预后恢复良好。 相 比之下， III或IV期的肾脏癌症与极低的存活率相关， 并且国家癌症研究所(National Cancer Institute)在其网站上声称 “患有IV期肾脏细胞癌的患者几乎没有能被治愈的” 0031 国家癌症学会估计在2009年美国诊断了49,096例肾脏癌症新病例 (16/105居民) 中有11,033例确定死亡(3.6/105居
16、民)。 欧盟的相应数字(2006)是诊断65,051个(7.8/105居 民)和27,326例死亡(3.3/105居民)(European Cancer Observatory： http: /eu- cancer.iarc.fr/cancer-19-kidney.html， en)。 在世界范围内估计(2006) 年是209,000例 诊断的病例(3.2/105居民)和102,000例死亡(1.6/105居民) (Gupta et al.Cancer Treat.Rev.34， 193-205； 2008)。 在美国看来似乎表面上较更高的发生率取决于是由于NCI 将一同报告肾盂的癌症(其是相
17、对容易治疗的)与和肾细胞癌一起共同报告的事实。 较低的 全球发生率和死亡率可能(至少部分)取决于在第三世界的广大区域中过低的诊出。 0032 如上所述， 常规技术的主要题是被诊断患有肾脏癌症的任一患者的结果主要由诊 断的时机来决定。 如果疾病在肿瘤传播到肾脏外部之前被诊断， 存活的机会是良好的， 不然 大多数患者死于该疾病。 它的主要原因是， 对于使用抑制细胞和细胞毒素药物的所有常规 疗法， 肾细胞癌是难治的， 所述药物例如顺铂、 卡铂、 多西他赛、 紫杉醇、 氟脲嘧啶、 卡培他 滨、 吉西他滨、 伊立替康、 托泊替康、 依托泊苷、 丝裂霉素、 吉非替尼、 长春新碱、 长春碱、 阿霉 素、 环
18、磷酰胺、 塞来考昔、 罗非考昔和 /或伐地考昔。 0033 现有技术中描述了各种方法。 由于较低的有效性和大量的副作用， 针对肾细胞癌 的常规化学治疗大部分是治疗不当的。 因而寻求可替代的治疗形式， 它们可以分成几个类 别： 0034 1)抗血管生成。 在这种方法中， 通过对供应肿瘤组织所必需的血管的形成的抑制， 说 明 书 2/15 页 5 CN 105147683 B 5 切断肿瘤的营养物和氧气。 这可以以几种方式实现： 1a)通过针对这些生长因子的抗体治 疗， 抑制循环生长因子， 例如， VEGF、 PDGF和PIGF， ； 1b)使用针对受体的抗体对目标细胞上 血管生长因子受体的阻断；
19、 和1c)使用干扰受体功能的更小的分子治疗， 使得血管生长因子 与它的受体的结合不能引发生理学的血管生成效果。 0035 2)免疫调节治疗。 这种方法试图刺激内源的免疫系统来将肿瘤细胞识别为异源并 开始对抗它们。 作为针对肾脏癌症的治疗的免疫刺激采取两种主要途径： 2a)用白细胞介素 2(IL-2)治疗； 和2b)干扰素 (IFN ) 治疗。 0036 上述所有可替代的治疗策略显著地延长了患有肾脏癌症处于晚期的某些患者的 生命期。 然而， 效果仅在几个月的级别上， 而且治疗与许多严重的副作用相关。 经常地， 肿瘤 适应了治疗， 然后治疗不能继续， 之后肿瘤加速的生长。 Garcia et al
20、.( Recent progress in the management of advanced renal cell carcinoma. CA Cancer.J.Clin.57(2)： 112-25(2007) 和Atkins et al.( Innovations and challenges in renal cell carcinoma： summary statement from the Second Cambridge Conference . Clin.Cancer.Res.13(2Pt 2)： 667s-670s(2007)综述了肾脏癌症治疗的新近的方法。 0037 文献的
21、综述表明， 许多治疗方法来源于或多或少特异性的癌症标志物的识别， 以 及这些标志物对于引发对抗侵入性肿瘤组织的宿主免疫应答的用途。 因而， US2006134708 公开了肾脏和尿路膀胱癌症的几种分子标志物， 即用于诊断目的的IGFBP-3(胰岛素样生长 因子结合蛋白3)、 ANGPTL4(血管生成素样4)和铜蓝蛋白(cemloplasmin)， 以及对抗所述标 志物的单克隆抗体， 用于诊断用途。 描述了对抗所公开的标志物的反义化合物在肽和核酸 水平上的应用。 并且， 轭合到细胞毒性试剂、 对抗所述标志物的单克隆抗体的使用作为这样 的治疗实施方式也是预期的， 即与取决于抗体(也称为 “魔弹(m
22、agic bullet)” 概念)提供的 靶向的较少的细胞毒性试剂的严重副作用联系在一起。 基于不同肿瘤相关抗原的类似方法 在CN1359941中被采用。 0038 US6403373公开了与结肠、 肾脏和胃癌相关的核酸分子， 其肽产物引发了宿主中的 抗体生成。 所述肽在疫苗方法中的用途是预期的。 EP0160250公开了用于肾癌的诊断的单 克隆抗体， 并且提及了将这些抗体轭合到各种细胞毒性试剂的可能性。 0039 WO2007059082公开了在卵巢和肾脏癌症中抗原TIM-1(T细胞， 免疫球蛋白或粘蛋 白结构域1)的发现， 其与细胞增殖相关。 教导了针对 TIM-1产生的抗体用于治疗卵巢和
23、肾 脏癌症的用途， 也教导了作为肿瘤细胞的靶向杀伤方式的治疗试剂(毒素、 放射性同位素或 化学治疗试剂)与所述抗体的轭合。 0040 US6440663公开了由肾脏癌症细胞来示性的许多基因， 其产物引起宿主中的抗体 生成。 描述了引发或增加宿主中针对使所公开基因示性的组织的免疫反应的各种方法， 包 括细胞毒性T细胞的引发和用公开的基因或其片段对宿主细胞的转染， 随后是所述细胞向 宿主中的再导入。 0041 U US 2005261178公开了对抗在大部分肾脏癌症上表达的抗原(碳酸酐酶IX)的单 克隆抗体(G250)与细胞因子白细胞介素-2或干扰素- 的共同施用。 以比仅用细胞因子治疗 时使用的
24、更低的剂量施用细胞因子。 达22周或更久的疾病稳定或 “目标反应” 在患有晚期肾 脏癌症的群体的约30患者中实现。 0042 其他方法基于在新的治疗方案中使用已知的治疗物质。 例如， WO2007044015公开 说 明 书 3/15 页 6 CN 105147683 B 6 了根据新的施用方案的对在前已知的二甲烷磺酸酯化合物、 特别是NSC-281612的使用， 以 治疗肾脏癌症。 当对裸鼠中的异种移植物测试时， NSC-281612的施用在某些情况下导致了 肿瘤块的表面上完全的根除。 0043 JP2001288110公开了干扰素- 与聚乙二醇(PEG)的轭合物以试图提高循环半衰期 和降低
25、最小治疗有效剂量。 0044 RU2188026公开了使用长春新碱、 亚德里亚霉素和depo-安宫黄体酮(depo- provera)的多化疗方法。 声称这提高了无复发时间和减少了转移形成。 0045 最后， 在少数情况中， 对新的原始物质建立了建议的疗法。 因而， WO2004075887公 开了1-(2-氯乙烷)-1-亚硝基-3-(2-羟基乙基)脲 (HECNU)用于许多癌症类型、 包括肾脏癌 症的治疗的用途。 HECNU 的主要特征是与早先已知的相应的化合物二-(2-氯乙基)-1-亚硝 基-脲 (BCNU)相比改善的水溶性。 0046 EP1712234公开了4-吡啶甲基-酞嗪衍生物作为
26、VEGF受体抑制物在肾脏癌症的治 疗中的用途， 特别是用于转移性生长的抑制。 发现的是， 4-吡啶甲基-酞嗪衍生物与多种常 规的化学治疗剂的任一种的共同施用具有协同效应， 即使所述肿瘤细胞是单独的化学治疗 难以治疗的。 进一步的， 组合治疗与显著的更小的副作用相关联。 0047 Suthpin et al.( Targeting the Loss of the von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene in Renal Carcinoma Cells ， Cancer.Res.67(12)， 5896-5905(2007) 研究了色霉素A3在肾脏癌症对不表
27、达VHL基因的选择性效应(这种肿瘤抑制基因在所有肾 脏透明细胞癌症的约70中是不存在的)。 色霉素A3显著地延迟了异种移植的裸鼠中的肿 瘤生长， 而不影响表达VHL基因的正常的肾脏组织。 0048 在此本发明利用的奥来毒素(式I)， 其是在丝膜菌(Cortinarius) 科的几个真菌 物种中以相对大量存在的选择性的肾脏毒素。 在混淆丝膜菌真菌与食用菌类之后奥来毒素 的中毒经常地在欧洲、 俄国和北美洲发生。 在摄食含有奥来毒素的真菌之后， 有几天到3周 没有症状或仅轻微的、 流感样症状的时期。 下一阶段， 当一般寻求医学帮助时， 特征是由于 急性肾功能衰竭的尿毒症。 尽管在科学文献中奥来毒素毒
28、害有许多描述， 除了仅提及肾脏 的毒性之外， 奥来毒素的其他效果没有被报道 (Danel VC， Saviuc PF， Garon D： Main features of Cortinarius spp. poisoning： a literature review.Toxicon 39， 1053- 1060(2001).)。 这种选择性最可能归于事实， 奥来毒素由一种细胞类型特异性地接收， 即， 肾小管上皮细胞， 特别是近端肾小管上皮细胞(Prast H， Pfaller W： Toxic properties of the mushroom Cortinarius orellanus(F
29、ries)II.Impairment of renal function in rats.Arch Toxicol 62， 89-96(1988).)。 奥来毒素的毒性机制没有被阐明， 除了维持透析 同时等待看肾脏是否恢复之外， 没有可用的治疗。 最后的结局主要取决于摄食的毒素的数 量， 根据经验， 一种真菌的摄食产生暂时的问题， 两种真菌导致部分肾脏功能的永久丧失， 而三种或更多种真菌引起肾脏功能的完全丧失和需要终身的透析或肾脏替换治疗。 0049 申请人近来公开了奥来毒素在健康大鼠作用方式的首次研究 (Nilsson UA et al.The fungal nephrotoxin Orel
30、lanine simultaneously increases oxidative stress and down-regulates cellular defenses.Free Rad. Biol.Med.44： 1562-9 (2008).)。 这项研究显示了在肾脏皮层组织中提高的氧化压力伴随几种关键的抗氧化基因 的显著降低的表达。 在这项工作期间， 认识到奥来毒素对肾小管上皮细胞的看起来的绝对 说 明 书 4/15 页 7 CN 105147683 B 7 特异性， 理论上可以延伸到涵盖它们转化成癌细胞之后的这些细胞。 如果证明正确， 这样的 假说将意味着奥来毒素是针对上皮来源的肾脏癌
31、症的强大的武器， 具有甚至在癌症进展的 时期和在其他组织中转移时有治愈的可能性。 0050 继续这种假说， 令人惊讶地发现奥来毒素实际上也在人类肾脏癌症细胞中接受， 不论它们来自原发肿瘤还是来自转移性肿瘤组织， 以大的效力杀死它们。 在对奥来毒素的 短暂的暴露之后细胞死亡发展， 表明毒素主动地被细胞接受和保持。 发明内容 0051 本发明的最初目标是提供治疗发源于上皮细胞的肾脏癌症的方法， 所述方法涉及 向需要治疗的哺乳动物施用至少一种根据式I的化合物。 0052 0053 本发明的其他目的是提供根据式I的化合物用作药物， 以及提供式I 的化合物用 于肾细胞癌的治疗。 0054 本发明的另一个
32、目的是提供药物组合物， 其包含至少一种根据式I 的化合物， 任 选地包含具有抗癌活性的其他试剂， 以及优化所述组合物的有效性所需的载体和任何其他 赋形剂。 0055 又一个目的是提供一种试剂盒， 其在一个或更多个独立的区室中含有上述组合 物， 以及需要的稀释剂和/或溶剂， 从而所述组合物可以容易地制成以备治疗医师或护士使 用。 0056 在阅读说明书和实施例时， 本发明的其他目的和优点对于这个领域中的普通技术 人员将变得显而易见， 这些目的和优点意图落入本发明的范围之内。 0057 附图简要描述 0058 图1： 在对400 M奥来毒素(100 g/ml培养基)的24小时暴露后7 天期间， 观
33、察来自5 种不同的人类肾细胞癌(原发肿瘤和转移)的细胞的生存力的结果。 生存力通过处理的样品 中活细胞的数量除以对照样品中活细胞的数量来计算(n6)。 图形中的灰色区域表示奥来 毒素孵育的时间(24h)。 以后的几天， 细胞在没有奥来毒素的完全培养基中培养。 在每次生 存力测量时更换培养基。 0059 图2： 根据图1中相同的参数奥来毒素孵育后一周， 对人类肾脏癌细胞(菌株786-0) 的奥来毒素毒性。 左侧的显微照片显示了暴露于赋形剂的细胞， 右侧显微照片显示了暴露 于400 M奥来毒素24h的细胞。 两幅图片都在与奥来毒素/赋形剂繁殖后一周用相同的放大 率拍摄。 说 明 书 5/15 页
34、8 CN 105147683 B 8 0060 图3： 人类肾细胞癌(786-0和SKRC7)的培养基中不同浓度的奥来毒素的剂量/响应 效应。 奥来毒素剂量和细胞死亡之间的清楚的相关性在5-200 g/ml的浓度区间内见到。 0061 图4： 低剂量的奥来毒素的重复施用的效果。 在第一剂量之后24h， 在剂量/响应间 隔低值的第二剂量(20 g/ml)的施用导致活细胞数量的强烈降低， 而在72h的第二剂量的施 用具有显著更小的， 但仍然显著的效应。 第一种情况相当于细胞的延长暴露(48h)， 而第二 种情况中的细胞被容许在两个剂量之间在没有奥来毒素的培养基中恢复两天。 在添加第一 奥来毒素剂量
35、之后96h测量生存力。 0062 图5： 奥来毒素对肾细胞癌中(786-0和SKRC-52)细胞周期的影响 (Western印迹)。 细胞周期抑制物p21的蛋白质水平逐渐地上调到6h 的孵育的最大值。 在24h后， 成视网膜细 胞瘤蛋白质(Rb)的细胞周期刺激性磷酸化形式消失(显示了两种不同的磷酸化位点)。 这些 效应汇合来将细胞周期停止在GI/S的检查点。 同时， 刺激因子cdc2的丧失将细胞周期中止 在检查点G2/M， 阻止了细胞分裂的开始。 0063 图6： 在肾脏癌细胞(786-0)中奥来毒素的细胞凋亡的诱导： 蛋白质效应。 在奥来毒 素暴露(OR)之后细胞凋亡p38途径被强烈地增量调
36、节(f-p38)， 以裂解的半胱氨酸天冬氨酸 蛋白酶3(cleaved caspase 3) 的形式检测到细胞凋亡。 在24h后ERK1/2的强增量调节(f- ERK1/2)被解释为细胞抵抗奥来毒素的细胞凋亡影响的尝试。 0064 对于ERK1/2和p38， 应当比较磷酸化(f)与总蛋白的比例。 裂解的半胱氨酸天冬氨 酸蛋白酶3应当与加载对照 肌动蛋白比较。 0065 图7： 在肾脏癌细胞(SKRC-52)中奥来毒素的细胞凋亡的诱导： mRNA效应。 细胞凋 亡中介体PUMA、 Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子 (TNF)的mRNA表达的RT-PCR分析显示了所 有三种情况下显著的增量调节
37、。 注意到受体mRNA的仅在表达方面有小的改变。 细胞与没有 奥来毒素的情况下孵育的对照细胞比较。 0066 图8： 在与奥来毒素孵育期间人类透明细胞癌(SKRC52)中的细胞凋亡。 细胞凋亡、 空泡形成和细胞皱缩的典型症状在4h孵育后已经是明显的， 在24h后进一步加重。 0067 发明优选实施方式的详细说明 0068 本发明提供了包含吡啶-N-氧化物和联吡啶-N， N-二氧化物化合物的药物组合物， 以及向患有肾脏癌症或对肾脏癌症敏感的受试者施用所述药物组合物来治疗肾脏癌症的 方法。 在此本发明还包括用于治疗患有肾脏癌症或对肾脏癌症敏感的患者的试剂盒。 0069 本发明提供了治疗患有肾细胞癌
38、或对肾细胞癌敏感的患者的方法， 其中所述方法 包括向所述患者施用如早先定义的根据式I的化合物、 其药学上可接受的盐或包含所述化 合物的药物组合物的步骤。 0070 施用给患者的式I的化合物包括其中R1、 R2、 R3和/或R4基本上不影响奥来毒素的 细胞毒性的那些化合物(R1R2R3R4氢)。 因而， R1、 R2、 R3和/或R4包括， 但不限于， 氢、 氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐和卤素， 包括氟、 氯和溴、 C1-C6烷基、 C1-C6烯基、 C1-C6炔基、 C1-C6烷醇基、 C1-C6烯醇基、 C1-C6烷氧基、 C1-C6烯氧基， 其每一个可以进一步被包括但不 限于氨基、 巯基
39、、 羧基、 磷酸和卤素， 包括氟、 氯和溴的基团取代。 在本发明的优选的实施方 式中， 式I的化合物是奥来毒素， 即， R1R2R3R4氢。 0071 在根据本发明的治疗患有肾脏癌症或对肾脏癌症敏感的患者的方法的一个实施 方式中， 施用给患者的式I的化合物是药学上可接受的盐、 水化物或溶剂化物。 如在此使用 说 明 书 6/15 页 9 CN 105147683 B 9 的， 药学上可接受的盐是酸或碱盐， 其一般在本领域被认为适用于与人类或动物的组织接 触而没有过多的毒性、 刺激、 变应性应答或其他问题或并发症。 这样的盐包括碱性残基， 例 如胺的矿物和有机酸盐。 具体的药物盐包括但不限于，
40、酸的盐， 所述酸例如， 盐酸、 磷酸、 氢 溴酸、 苹果酸、 乙二酸、 反丁烯二酸、 硫酸、 氨基磺酸、 对氨基苯磺酸、 蚁酸、 甲苯磺酸、 甲磺 酸、 苯磺酸、 乙烷二磺酸、 2-羟基乙基磺酸、 硝酸、 苯甲酸、 2-乙酰氧基苯甲酸、 柠檬酸、 酒石 酸、 乳酸、 硬脂酸、 水杨酸、 谷氨酸、 抗坏血酸、 帕莫酸(pamoic)、 琥珀酸、 反丁烯二酸、 马来 酸、 丙酸、 羟基马来酸、 氢碘酸、 苯乙酸、 烷酸， 例如乙酸、 HOOC-(CH2)n-COOH， 其中n是0-4， 等 等。 0072 在此提供的治疗肾脏癌症的方法中， 式I的化合物可以以单次剂量、 一系列的每日 剂量或以间歇给
41、药形式施用(例如， 在1天和约30天之间的间隔、 1天和约14天之间的间隔或 1天和约7天之间的间隔的多个剂量或剂量序列的施用)。 在某些方法中， 选择施用方案和式 I的化合物来提供在施用方案完成之后肿瘤大小的至少50的降低， 或更优选的肿瘤大小 的至少75、 90或95的降低， 而在某些其他方法中， 施用方案和式I的化合物的选择引 起肿瘤大小的95降低、 肿瘤大小的99降低或肿瘤的基本上完全消除。 在治疗包含单次 剂量施用方案的那些方法中， 约1mg/kg到约100mg/kg之间根据式(I)的化合物或相等摩尔 量的其药学上可接受的盐被施用给患者， 而优选的单次剂量包括约2mg/kg到约 25
42、mg/kg之 间， 最优选的约5mg/kg到约15mg/kg的式I的化合物或相等摩尔数量的其药学上可接受的盐 被施用给患者。 0073 在治疗肾脏癌症的某些其他治疗方法中， 式I的化合物或其药学上可接受的盐以 两个或更多个剂量被施用给患有肾脏癌症或对肾脏癌症敏感的患者。 一般地， 每天地或间 歇地施用剂量(例如， 分隔连续剂量的至少一个非施用天)。 在某些方法中， 其中式I的化合 物或其药学上可接受的盐以多次剂量施用， 每个剂量包含约0.5mg/kg到约10mg/kg 的化合 物， 更优选的， 每个剂量包含约1mg/kg到约5mg/kg， 或更优选的约2mg/kg的式I的化合物或 盐。 007
43、4 在间歇地施用连续剂量的某些方法中， 连续的剂量在两天到七天之间的间隔施 用， 在包含式I的化合物或盐的间歇施用的其他的方法中， 化合物以三、 四、 五或六次或更多 次剂量施用给患者， 其中每个剂量以三到五天之间的间隔施用， 还有在其他的方法中， 所述 患者间隔三天到四天之间施用四、 五或六次或更多次剂量， 其中每个剂量包含约1mg/kg 到 约20mg/kg的式I的化合物或其药学上可接受的盐， 优选的2-10mg/kg， 最优选的约5mg/kg。 在治疗肾脏癌症的某些其他治疗方法中， 患者被施用式I的化合物或其药学上可接受的盐 的每日剂量至少两天。 施用给患者的一般的每日剂量在0.1和10
44、mg/kg之间、 优选的是1和 5mg/kg之间， 最优选的约2mg/kg。 治疗方案一般包括5到约30天之间、 或优选的 10到20天之 间、 或最优选的约14天的式I的化合物或其药学上可接受的盐的每日施用。 0075 在某些情况下， 可能希望的是进行多次如上所述的间歇的施用方案、 每日的施用 方案或其组合， 与静止和/或恢复期组合。 因而， 在某些情况下， 可能希望的是根据在此提供 的每日的或间歇的施用方法施用式I的化合物或其药学上可接受的盐， 测量对治疗的肿瘤 应答， 然后根据消除或进一步降低肾脏癌症肿瘤的大小的需要进行随后的每日或间歇施用 治疗。 这样的施用策略是肿瘤学领域的普通技术人
45、员公知的。 0076 在本发明的一个特别优选的实施方式中， 患有肾细胞癌的患者用本发明的根据式 说 明 书 7/15 页 10 CN 105147683 B 10 1的物质治疗， 通过约0.5-5mg奥来毒素/kg b.w.(按重量计算)， 最优选的约2mg奥来毒素/ kg b.w.的每日注射连续约7-21天， 最优选的连续约14天。 根据式1的化合物的每次每日注 射之后1到5小时， 最优选的这样的注射之后约2小时， 患者进行血液透析1-5h， 最优选的约 2h， 以消除没有被接受进入肿瘤组织的根据式1的化合物， 从而最小化可能在细胞间隙中发 生的任何非期望的副作用。 0077 如上所述的优选
46、的剂量和给药方式是基于体重70kg、 具有约1kg的肿瘤负荷的肾 细胞癌的人体。 然而， 如癌症医学领域的普通工作者易于了解的， 这样的的优选剂量和给药 方式在很大程度上通过患者特征， 例如， 年龄、 性别、 体重、 一般状况以及尤其是单个患者的 肿瘤负荷以及对治疗的应答来调节。 一如既往地， 选择合适的剂量和治疗策略的最终责任 在于负责该患者的医师。 0078 本发明提供了治疗患有肾细胞癌或对肾细胞癌敏感的患者的方法。 在某些方法 中， 要治疗的肿瘤位于患者的一个或两个肾脏中。 在某些其他方法中， 肾细胞癌已经转移， 例如， 至少一个肾细胞癌肿瘤存在于至少一个非肾脏组织中。 一般地， 在此提
47、供的方法适用 于患有肾细胞癌肿瘤或对肾细胞癌肿瘤敏感的患者的治疗， 所述肿瘤存在于肾脏、 非肾脏 组织或其组合中。 在优选的实施方式中， 所述肿瘤存在于非肾脏组织中， 或肾脏和非肾脏组 织的组合中。 本发明提供的治疗方法期待能够向肿瘤附近提供治疗有效剂量的式I的化合 物的任何施用途径。 在此处提供的某些优选的治疗方法中， 式I的化合物、 或包含式I的化合 物的药物组合物被静脉内地、 皮下地或腹膜内施用。 一般地， 式I的化合物或包含式I 的化 合物的药物组合物被静脉内地施用。 0079 在另一个方面， 本发明提供了式I的化合物， 其中R1、 R2、 R3和/ 或R4基本上不影响 奥来毒素的细胞
48、毒性(R1R2R3R4氢)， 用作药物。 本发明还提供了式I的化合物作为 药物的用途， 其中R1、 R2、 R3 和/或R4基本上不影响奥来毒素的细胞毒性(R1R2R3R4 氢)。 R1、 R2、 R3和/或R4包括， 但不限于， 氢、 氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐和卤素， 包括氟、 氯 和溴、 C1-C6烷基、 C1-C6烯基、 C1-C6炔基、 C1-C6烷醇基、 C1-C6烯醇基、 C1-C6烷氧基、 C1-C6 烯氧基， 其每一个可以进一步被包括但不限于氨基、 巯基、 羧基、 磷酸盐和卤素， 包括氟、 氯 和溴的基团取代。 在本发明的优选的实施方式中， 式I的化合物是奥来毒素， 即， R1R2R3 R4氢。 本发明的这个方面的其他优选的实施方式根据显现的说明是明显的。 0080 在又一个方面， 本发明提供了式I的化合物， 其中R1、 R2、 R3和/ 或R4基本上不影响 奥来毒素的细胞毒性(R1R2R3R4氢)， 用于肾细胞癌的治疗。 本发明还提供了式I的 化合物用于制造治疗肾细胞癌的药物的用途， 其中R1、 R2、 R3和/或R4基本上不影响奥来毒 素的细胞毒性(R1R2R3R4氢
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