SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法.pdf

1、10申请公布号CN104099383A43申请公布日20141015CN104099383A21申请号201410367288622申请日20140729C12P17/1220060171申请人尚科生物医药（上海）有限公司地址201318上海市浦东新区蓝靛路1199号1号楼72发明人竺伟王波吴会李兵豪张启鹏54发明名称SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法57摘要本发明公开了一种SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法，所述方法包括如下步骤将固定化全细胞、N叔丁氧羰基3哌啶酮、辅因子、缓冲液和异丙醇按一定比例混合，在PH58、温度为2045下反应，经后处理得到产物。与现有技术相比，本发明所采用的

2、方法具有成本低、操作方便和催化剂可回收利用的优点，具有良好的工业应用价值。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104099383ACN104099383A1/1页21一种SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法，其特征在于将固定化全细胞、N叔丁氧羰基3哌啶酮、辅因子、缓冲液和异丙醇按一定比例混合反应得到产物。2如权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定化全细胞为酮还原酶全细胞经固定化处理后得到；所述固定化全细胞能将所述异丙醇转换为丙酮。3如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酮还原酶全细胞由基因工程菌发酵

3、得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。4如权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定化全细胞浓度为5100G/L、所述N叔丁氧羰基3哌啶酮浓度为10250G/L、所述辅因子浓度为00011G/L和所述缓冲液的浓度为1MMOL/L1MOL/L。5如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应在PH58、温度为2045下进行。6如权利要求1所述的方法，其特征在于所述辅因子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。7如权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。8如权利要求2所述的

4、方法，其特征在于，所述固定化全细胞的制备方法为将所述酮还原酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型。9如权利要求8所述的方法，其特征在于所述酮还原酶全细胞与所述固定剂的重量比为1112。10如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙的一种或它们的组合。权利要求书CN104099383A1/3页3SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法技术领域0001本发明属于制药工业生物技术领域，具体涉及一种SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法。背景技术0002SN叔丁氧羰基3羟基哌啶是一个在医药领域具有重要应用价值的化合物，被广泛应用于镇痛、抗精神病和抗肿瘤等

5、药物的合成。目前文献报道的制备方法主要有化学拆分法和生物转化法。0003化学拆分法是将外消旋3羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到S3羟基哌啶的盐，然后游离、上保护基得到SN叔丁氧羰基3羟基哌啶。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。00042009年，文献ORGANICLETTERSVOL11,NO6,12451248报道了一种生物转化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法。该方法利用磨碎的野生胡萝卜根为生物催化剂，将N叔丁氧羰基3哌啶酮还原得到SN叔丁氧羰基3羟基哌啶，该方法存在生物催化剂大量获得困难及产物光学纯度不高等问题，反应效率太低、生产成本过高，难以产业化应用。0005C

6、N103571908A中公开了一种生物酶催化制备R或SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法。该方法所用的生物酶为冻干粉，存在价格高和后处理繁琐等问题。0006此外，我们在申请号为2014103096275的专利申请中报道了一种固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法。该方法将酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例混合并经固定化处理后用于生物转换，反应中会产生与产物等当量的葡萄糖酸，为了维持反应体系的PH，需要加入等当量的碱中和，这就大大影响反应的工艺经济性和原子经济性。发明内容0007为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的生物制备方法。0008

7、具体工艺路线如下所示00090010为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下将经固定化处理的酮还原酶全细胞、N叔丁氧羰基3哌啶酮、辅因子、缓冲液和异丙醇混合，在PH58、温度为2045下反应148H；反应混合液中固定化全细胞湿重浓度为5100G/L，N叔丁氧说明书CN104099383A2/3页4羰基3哌啶酮的浓度10250G/L，辅因子浓度为00011G/L；缓冲液的浓度为1MMOL/L1MOL/L；固定化全细胞能将异丙醇转换为丙酮；反应结束后过滤回收固定化全细胞；滤液用有机溶剂萃取、浓缩和结晶得到纯度大于99、光学纯度大于99的目标产物。0011进一步说，所述辅因子为选自NAD、NAD

8、H、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。0012进一步说，所述酮还原酶全细胞由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。0013进一步说，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。0014进一步说，所述固定化全细胞制备方法为将酮还原酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型。0015进一步说，所述酮还原酶全细胞与所述固定剂的重量比为1112。0016进一步说，所述固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙中的一种或它们地组合。0017进一步说，所述酮还原酶全细胞选自市场上可以购得的KRED101KRED

9、250全细胞尚科生物医药上海有限公司，优选KRED198全细胞。0018进一步说，所述固定化全细胞经过滤后可以回收套用，套用次数为110次。0019与现有技术相比，本发明生产成本较低，固定化全细胞容易与反应液分离，操作方便，催化剂可回收利用，反应的工艺经济性和原子经济性得以提高，产物收率及光学纯度高，具有良好的应用价值。具体实施方式0020下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。0021实施例10022一、固定化全细胞的制备0023室温下，将06KG聚乙烯醇加入35L水中，升温至9095，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降

10、至2530；向上述溶液中加入03KGKRED198全细胞尚科生物医药上海有限公司，混匀后搅拌1H；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30干燥1015H；移入01MNA2SO4溶液稳定2H，滤干并用清水洗涤两次，得到16KG固定化全细胞。0024二、SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的合成0025向20L带夹套的玻璃反应釜中加入15L事先配好的PH7的100MMOL/L的磷酸盐缓冲液、1KG固定化全细胞和0001KG烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，搅拌均匀后，加入2KGN叔丁氧羰基3哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10氢氧化钠水溶液控制反应液为PH58，30搅拌6H，

11、HPLC显示转化率大于98；过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到188KG淡黄色液体；粗品加入10KG正己烷，在05搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品175KG，纯度998，光学纯度995，收率88。0026实施例2说明书CN104099383A3/3页50027一、固定化全细胞的制备0028室温下，将03KG聚乙二醇溶解在35L水中，后向溶液中加入02KG聚乙烯醇，升温至9095，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至2530；向上述溶液中加入03KGKRED198全细胞尚科生物医药上海有限公司，混匀后搅拌1小时；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30干燥

12、1015H；移入01MNA2SO4溶液稳定2H，滤干并用清水洗涤两次，得到145KG固定化全细胞。0029二、SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的合成0030向20L带夹套的玻璃反应釜中加入15L事先配好的PH7的100MMOL/L的三乙醇胺缓冲液、12KG固定化细胞和0001KG烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，搅拌均匀后，加入2KGN叔丁氧羰基3哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10氢氧化钠水溶液控制反应液为PH80，42搅拌10H，HPLC显示转化率大于98；过滤除去固定化细胞，待下一批套用；滤液用甲苯3KG3萃取，合并有机层，减压浓缩甲苯得到192KG淡黄色液体；加入10KG正己烷，在05搅拌析出

13、白色固体，真空干燥得产品180KG，纯度998，光学纯度995，收率91。0031实施例30032用回收固定化细胞合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶0033向20L带夹套的玻璃反应釜中加入15L事先配好的PH7的100MMOL/L的三乙醇胺缓冲液、12KG实施例2中回收的固定化细胞和0001KG烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，搅拌均匀后，加入2KGN叔丁氧羰基3哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10氢氧化钠水溶液控制反应液为PH80，42搅拌10小时，HPLC显示转化率大于98；过滤，滤液用甲苯3KG3萃取，合并有机层，减压浓缩甲苯得到180KG淡黄色液体；加入10KG正己烷，在05搅拌析出白色固体，真空干燥得产品167KG，纯度996，光学纯度994，收率84。说明书CN104099383A