2型糖尿病易感位点RS2241766的检测方法及试剂盒.pdf

1、10申请公布号CN104059991A43申请公布日20140924CN104059991A21申请号201410331667X22申请日20140710C12Q1/6820060171申请人光瀚健康咨询管理上海有限公司地址200000上海市崇明县长兴镇潘园公路1800号2号楼3459室72发明人黄迅威张天竹沈玲宇邵敏华54发明名称2型糖尿病易感位点RS2241766的检测方法及试剂盒57摘要本发明涉及一种检测2型糖尿病易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括步骤1提取样品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含RS2241766位点的区域，得到扩增产物；2使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP

2、位点RS2241766的基因型。采用HRM分析技术对扩增后的脂联素基因中包含RS2241766位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测；使用上述试剂盒可以清晰的判断受检人群是否携带2型糖尿病易感基因，将2型糖尿病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页10申请公布号CN104059991ACN104059991A1/1页21一种2型糖尿病易感位点的检测方法，其特征在于包括步骤1提取样

3、品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含RS2241766位点的区域，得到扩增产物；和2使用高分辨熔解曲线HIGHRESOLUTIONMELT，HRM分析技术检测扩增产物中单核苷酸多态性SNP位点RS2241766的基因型。2如权利要求1所述的方法，其特征在于脂联素基因的RS2241766位点的基因型带有G时，该脂联素基因所属样品的测试者对于2型糖尿病的易感性高于基因型没有G的测试者。3如权利要求1所述的方法，其特征在于使用特异性引物扩增样品的脂联素基因中包含RS2241766位点的区域，该特异性引物是指针对脂联素基因上RS2241766号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点

4、的DNA片段的引物对。4如权利要求3所述的方法，其特征在于所述特异性引物具有SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核苷酸序列。5如权利要求3所述的方法，其特征在于使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。6如权利要求3所述的方法，其特征在于将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。7一种用于检测2型糖尿病易感位点的试剂盒，其特征在于对脂联素基因中包含RS2241766位点的区域进行扩增及HRM技术分析。8如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括特异性扩增脂联素基因中包含RS2

5、241766位点的区域的特异性引物。9如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述特异性引物具有SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核苷酸序列。10如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分及含量包括5UL2XLIGHTCYCLER480HIGHRESOLUTIONMELTINGMASTERMIX、12UL25MMMGCL2溶液、1UL2MPRIMERMIX、1UL5NG/L左右DNA、18ULH2O、具有SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核苷酸序列的特异性引物。权利要求书CN104059991A1/5页32型糖尿病易感位点RS2241766的检测方法及试剂盒【技术领域】0001本

6、发明涉及一种检测2型糖尿病易感性的方法及试剂盒，更具体的说是通过测定与2型糖尿病相关基因脂联素基因的单核苷酸多态性SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM，SNP预测受试者对于2型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于分子生物学和医学领域。【背景技术】00022型糖尿病是成人发病型糖尿病，多在3540岁之后发病，占糖尿病患者90以上。病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏。00032型糖尿病有更强的遗传性和环境因素，并呈显著的异质性。目前认为发病原因是胰岛素

7、抵抗主要表现为高胰岛素血症，葡萄糖利用率降低和胰岛素分泌不足的合并存在，其表现是不均一的，有的以胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌不足，有的则是以胰岛素分泌不足伴有或不伴有胰岛素抵抗。00042型糖尿病的发现一般较缓慢而隐袭，有的以慢性并发症来就诊而被发现，多较轻或无症状，80患者超重或肥胖，老年人在诱因下易患非酮症高渗性糖尿病昏迷，慢性并发症以大血管并发症为主，病情相对稳定。治疗以饮食治疗和口服药物治疗为主。0005近年来，单核苷酸多态性SNP和单倍型HAPLOTYPE在多基因疾病研究中的广泛运用，为在分析水平上研究2型糖尿病的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高通量、低成本的SNP检测手段

8、的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。然而，现有检测2型糖尿病易感性的方法均存在或者准确率低、或者成本高、或者难以实现批量生产等不足。0006因此，有必要提出一种新的检测方法以解决上述问题。【发明内容】0007本发明的主要目的是提供一种辅助诊断2型糖尿病的方法，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。0008本发明的另一目的是提供一种用于检测2型糖尿病易感位点的试剂盒，该试剂盒包括PCR引物及含有该引物的试剂盒，其可以实现扩增与HRM分析。0009为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是一种检测2型糖尿病易感位点的方法，包括步骤1提取样品的基因组DNA，扩增样品的

9、脂联素基因中包含RS2241766位点的区域，得到扩增产物；2使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点RS2241766的基因型。0010进一步的，脂联素基因的RS2241766位点的基因型带有G时，该脂联素基因所属样品的测试者对于2型糖尿病的易感性高于基因型没有G的测试者。0011进一步的，使用特异性引物扩增样品的脂联素基因中包含RS2241766位点的区说明书CN104059991A2/5页4域，该特异性引物是指针对脂联素基因上RS2241766号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。0012进一步的，所述特异性引物具有SEQIDNO2和SEQIDNO3

10、所示的核苷酸序列。0013进一步的，使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。0014进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。0015进一步的，所述2型糖尿病易感位点的检测方法在体外非诊断性检测2型糖尿病易感性方面的应用。0016为了解决上述问题，本发明采用的另一技术方案是一种用于检测2型糖尿病易感位点的试剂盒，对脂联素基因中包含RS2241766位点的区域进行扩增及HRM技术分析。0017进一步的，所述试剂盒包括特异性扩增脂联素基因中包含RS2241766位点的区域的特异性

11、引物。0018进一步的，所述特异性引物具有SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核苷酸序列。0019进一步的，试剂盒的组分及含量包括5UL2XLIGHTCYCLER480HIGHRESOLUTIONMELTINGMASTERMIX、12UL25MMMGCL2溶液、1UL2MPRIMERMIX、1UL5NG/L左右DNA、18ULH2O、具有SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核苷酸序列的特异性引物。0020进一步的，所述试剂盒在检测2型糖尿病易感性方面的应用。0021与现有技术相比较，本发明具有以下优点采用HRM分析技术对扩增后的脂联素基因中包含RS2241766位点的区域进行基因型分析

12、，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。【附图说明】0022图1是脂联素基因RS2241766位点基因型的HRM检测结果；0023图2是测序结果截图，显示了RS2241766的一种SNP基因型的探针分型结果。【具体实施方式】0024下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如SAMBROOK等人、分子克隆、实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。0025本发明提供了一种检测2型糖尿病易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括步骤1提取

13、样品的基因组DNA，扩增样品的脂联素基因中包含RS2241766位点的区域，得到扩增产物；2使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点RS2241766的基因型。该2型糖尿病易感位点的检测方法及试剂盒亦可用于检测2型糖尿病的易感性。0026在本发明中，脱氧核糖核酸DNA序列编号RS2241766位置基于SEQIDNO1所示的核苷酸序列；引物1基于SEQIDNO2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQIDNO3所示的核苷酸序列；扩增产物3基于SEQIDNO4所示的核苷酸序列。0027经过多年研究证明了脂联素基因单核苷酸多态性位RS2241766与2型糖尿病密切相关，而且发现了它的新功能脂联素基因中基

14、因型的改变将导致2型糖尿病的发病风险说明书CN104059991A3/5页5升高，其中关联研究结果显示，在脂联素基RS2241766TG在病例和对照组中的分布存在显著性差异，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。0028检测可以针对基因组DNA，也可针对脂联素基因的扩增片段。脂联素基因的RS2241766的基因型也可用已有的技术如SOUTHERN印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。0029实施例1荧光PCR检测0030一、实验材料0031荧光定量PCR，聚合酶链反应液0032二、引物及探针设计与合成0033以脂联素基因的部分序列为模板，使用PRIMERPREMIER5软件分析引物

15、，并由上海生工生物工程有限公司定制合成。0034检测用引物0035脂联素基因RS2241766上游引物序列50036CTGTTGCTGGGAGCTGTTCTA3SEQIDNO20037脂联素基因RS2241766下游引物序列50038GGCCCTTGAGTCGTGGTTT3SEQIDNO30039三、样本检测0040实验共检测50例2型糖尿病病例和50例正常对照人群，每例收集血样标本约2ML，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计INFINIGEN公司检测。0041按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用ROCHELC480SOFTWARE15扫描并聚类分析0042384

16、孔板ULLIGHTCYCLER480HIGHRESOLUTIONMELTINGMASTERMIX2X5MGCL225MM12PRIMERMIX2M1DNA5NG/L左右1H2O18反应总体积1000430044说明书CN104059991A4/5页60045四、检测结果0046基因组DNA抽提的检测结果0047所有样本的基因组DNA符合检测要求260/28018，浓度10NG/UL0048实施例2TAQMAN法检测脂联素基因RS2241766位点的基因型0049用TAQMAN法检测脂联素基因RS2241766位点。挑选上述病例对照组样本各10例进行TAQMAN分型实验，判断RS2241766的

17、基因型。0050一、实验方法0051TAQMAN探针方法使用美国应用生物系统公司的TAQMAN探针，苏州新海生物科技有限公司的TAQMANMIX。0052按如下体系进行PCR扩增，最后用ROCHELC480SOFTWARE15扫描并聚类分析。0053384孔板ULTAQMANMIX5TAQMANPROBE01DNA5NG/L左右1H2O39反应总体积1000540055说明书CN104059991A5/5页70056二、实验结果0057TAQMAN分型结果截图如图2所示。0058最终，20例的TAQMAN分型结果与LIGHTCYCLER480荧光PCR的HRM分析结果完全一致。0059三、脂联

18、素基因RS2241766基因型和2型糖尿病患病风险的关联分析0060脂联素基因RS2241766在2型糖尿病人和对照中分布的比较采用RXCX2检验用SPSS软件进行统计分析，检测结果的SPSS软件分析结果如下表所示00610062实施例32型糖尿病易感位点的检测试剂盒0063本发明提供的检测试剂盒可以对脂联素基因RS2241766位点进行扩增及HRM技术分析，该检测试剂盒可以检测2型糖尿病的易感性，其包含有可扩增出脂联素基因RS2241766位点的特异性引物及其他PCRHRM相应试剂，PCR扩增与HRM分析的组分含量相同。0064检测试剂盒供50人份检测应用，于20避光保存，其组分及含量包括0

19、0655UL2XLIGHTCYCLER480HIGHRESOLUTIONMELTINGMASTERMIX006612UL25MMMGCL2溶液00671UL2MPRIMERMIX00681UL5NG/L左右DNA006918ULH2O0070具有SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核苷酸序列的特异性引物各02UM。0071本发明具有实用性的例证0072检测该个体的脂联素基因RS2241766位点的基因型，以此判断该个体患2型糖尿病的发病风险是否高于普通人群。0073脂联素基因RS2241766位点的多态性可直接用于2型糖尿病的个性化治疗。0074检测脂联素基因的RS2241766的基因型也

20、可用于诊断2型糖尿病。0075在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。0076本发明的技术内容和技术特点已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示进行种种不背离本发明精神的替换和修饰。因此，本发明的保护范围应不限于实施方式所揭示的内容，而包括各种不背离本发明的替换和修饰，均为本专利申请权利要求所涵盖。说明书CN104059991A1/2页800010002序列表CN104059991A2/2页9序列表CN104059991A1/2页10图1说明书附图CN104059991A102/2页11图2说明书附图CN104059991A11