一种天然植物提取物的制备方法及用途.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102106587 B (45)授权公告日 2013.05.01 CN 102106587 B *CN102106587B* (21)申请号 201110058336.X (22)申请日 2011.03.11 A23L 3/3472(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61K 36/185(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 9/12(2006.01) (73)专利权人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安市环城北路 88 号 (72)发明人 袁珂 吴叶平 刘剑波 刘华亮 (74)专利代理机构 杭州浙科

2、专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33213 代理人 吴秉中 (54) 发明名称 一种天然植物提取物的制备方法及用途 (57) 摘要 一种天然植物提取物的制备方法及用途， 属 于植物提取技术领域。包括以下步骤 ： 将附生美 丁花原料经粉碎过筛后， 采用渗漉提取、 真空薄 膜浓缩、 大孔树脂吸附富集等方法制得附生美丁 花提取物。所得的的附生美丁花提取物中含有 11.5 18.6总黄酮， 21.3 32.6的总酚 酸， 该提取物具有很强的抑菌及抗氧化作用， 同时 还具有一定的降血压、 降血糖辅助作用， 可用作食 品防腐剂、 食品抗氧剂及食品添加剂， 该提取物的 制备工艺简单、 操作方便、 设备投资少

3、、 溶剂用量 小， 无环境污染， 生产成本低， 其提取物收率及功 效成分的含量高。 (51)Int.Cl. 审查员 都薇 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 (10)授权公告号 CN 102106587 B CN 102106587 B *CN102106587B* 1/1 页 2 1. 一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1） 原料处理 ： 将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉， 过 20 40 目筛 ； 2） 提取 ： 将药材装入渗漉筒中， 用溶剂浸泡48 小时后， 用40%80的含水乙醇做

4、 溶剂进行渗漉提取， 原料重量为1kg含水乙醇用量为616升， 按流速为1020 mL min-1 的速度收集渗漉液 ； 3） 减压浓缩 ： 将渗漉液在水浴温度 60 90， 真空度 0.090 0.095 MPa， 待浓缩 液进液流速为 200 350 mLmin-1的条件下进行真空薄膜浓缩， 回收乙醇， 得到每毫升浓 缩液含 0.5 1.0 克原药材 ； 4） 大孔树脂纯化 ： 将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集， 色谱柱的径高比为 1 ： 1520 ； 先用H2O洗脱， 再依次用10%80%含水乙醇进行梯度洗脱， 最后用70%丙酮洗脱， 洗脱流速为 10 25 mLmin-1， 分别

5、收集 3 倍柱体积的各部位洗脱液， 合并 20% 60% 含 水乙醇各部位的洗脱液 ； 5） 减压浓缩及干燥 ： 将合并的洗脱液在 50 70， 真空度 0.090 0.095 MPa， 待浓 缩液进液流速为 200 350 mLmin-1的条件下进行真空薄膜浓缩， 回收乙醇， 得到的浓缩 液继续真空浓缩、 干燥成粉， 然后用研钵研成粉， 通过 60 100 目分样筛， 即得附生美丁花 提取物干粉。 2. 如权利要求 1 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 2） 中 ： 浸泡 时间为57小时， 用50%70的含水乙醇做溶剂进行渗漉提取， 原料重量为1kg含水乙 醇用量为 8

6、12 升， 流速为 12 18 mLmin-1。 3. 如权利要求 1 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 3） 中 ： 水浴 温度 70 80， 真空度 0.092 MPa， 进液流速为 230 320 mLmin-1； 每毫升浓缩液含 0. 6 0.8 克原药材。 4. 如权利要求 1 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 4） 中 ： 色谱 柱的径高比为 1 ： 16 18， 先用 H2O 洗脱， 再依次用 10% 含水乙醇、 20% 含水乙醇、 40% 含水乙 醇、 60% 含水乙醇、 80% 含水乙醇进行梯度洗脱， 最后用 70% 丙酮洗脱， 洗脱流

7、速为 12 20 mLmin-1； 合并 20% 含水乙醇、 40% 含水乙醇和 60% 含水乙醇各部位的洗脱液。 5. 如权利要求 1 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 4） 中 ： 先用 H2O 洗脱， 再依次用 15% 含水乙醇、 25% 含水乙醇、 45% 含水乙醇、 55% 含水乙醇、 75% 含水乙醇 进行梯度洗脱， 最后用70%丙酮洗脱， 合并25%含水乙醇、 45%含水乙醇和55%含水乙醇各部 位的洗脱液。 6. 如权利要求 1 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 5） 中 ： 真空 浓缩温度 60 65， 真空度为 0.092 MPa，

8、进液流速为 230 320 mLmin-1。 7. 如权利要求 1 所述的一种天然植物提取物的制备方法所制备的天然提取物在制备 抗氧化、 抑菌制剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102106587 B 1/8 页 3 一种天然植物提取物的制备方法及用途 技术领域 0001 本发明属于植物提取技术领域， 具体为一种天然植物提取物的制备方法及用途。 背景技术 0002 黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要的生物活性物质， 现代医学研究表 明， 黄酮类化合物具有抗氧化、 抗衰老、 清除自由基、 抗病毒、 抗肿瘤、 抑菌、 保护心脑血管、 调节免疫等方面的作用， 是目前天然活性成分研究的热点

9、， 具有很好的开发应用价值。 0003 植物多酚类化合物是一类广泛存在于天然植物、 水果蔬菜等中的次生代谢产物， 是一类天然的强还原性物质， 在抗氧化和自由基清除方面具有比常用抗氧化剂更强的作 用， 植物酚酸类还具有多方面的生物活性， 尤其在预防心脑血管、 抗癌以及抗衰老方面发挥 着十分重要的作用。 0004 附生美丁花 （Medinilla arboricola） 为野牡丹科酸脚杆属植物， 属多年生小灌 木， 喜高温多湿和半阴环境， 不耐寒， 分布于热带及亚热带地区 , 生于低海拔至中海拔地区 林中、 荫处、 水旁岩石上或攀援于树上。据文献报道， 野牡丹科植物不少种类都具有清热解 毒、 收敛

10、止血的功效， 可治久咳、 消化不良、 月经过多、 外伤出血、 跌打肿痛等症。近年来， 国 内外的科学研究也发现， 野牡丹科酸脚杆属植物中的化学成分为鞣质、 黄酮、 氨基酸及萜类 等成分。它们在生物活性上具有护肝、 降血糖、 降血压、 抗氧化、 抗菌消炎等方面的作用， 且 部分已应用于临床。 关于附生美丁花总黄酮及总酚酸的制备方法及其用途， 经文献检索， 尚 未见研究报道。 0005 近年来从中草药中提取黄酮及酚酸类化合物的方法多采用超声提取法、 回流提取 法及冷浸提取法， 这些方法往往具有溶剂用量大、 提取时间长、 操作麻烦、 工作效率较低等 缺点。而分离富集总黄酮及总酚酸类多采用提取液浓缩后

11、用乙酸乙酯及正丁醇反复萃取、 再结合大孔树脂或硅胶柱色谱富集纯化。以上操作存在操作步骤及洗脱步骤多， 有机溶剂 用量大， 收率低， 生产成本较高的缺点， 尤其是提取纯化过程中的加热浓缩环节较多， 容易 造成有效成分破坏或流失， 总黄酮的提取率及转移率不高， 且常要用到乙酸乙酯、 正丁醇、 氯仿、 甲醇等有毒有害溶剂， 对环境造成污染， 同时提取物中常存在重金属含量超标现象。 发明内容 0006 针对现有技术中存在的上述问题， 本发明的目的在于设计提供一种天然植物提取 物的制备方法的技术方案， 具体为从附生美丁花中提取制备总黄酮及总酚酸的方法， 其制 备工艺简单、 操作方便、 设备投资少、 溶剂

12、用量小， 无环境污染， 生产成本低， 提取物收率及 功效成分的含量高。 0007 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0008 1） 原料处理 ： 将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉， 过 20 40 目筛 ； 0009 2） 提取 ： 将药材装入渗漉筒中， 用溶剂浸泡 4 8 小时后， 用 40% 80的含水 乙醇做溶剂进行渗滤提取， 若原料重量为 1kg 则含水乙醇用量为 6 16 升， 按流速为 10 说 明 书 CN 102106587 B 2/8 页 4 20 mLmin-1的速度收集渗漉液 ； 0010 3） 减压浓缩 ： 将渗漉液在水浴温度 60 90，

13、真空度 0.090 0.095 Mpa， 待 浓缩液进液流速为 200 350 mLmin-1的条件下进行真空薄膜浓缩， 回收乙醇， 得到每毫 升浓缩液含 0.5 1.0 克原药材的浓缩液 ； 0011 4） 大孔树脂纯化 ： 将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集， 色谱柱的径高比 为 1 ： 15 20 ； 先用 H2O 洗脱， 再依次用 10% 80% 含水乙醇进行梯度洗脱， 最后用 70% 丙 酮洗脱， 洗脱流速为 10 25 mLmin-1， 分别收集 3 倍柱体积的各部位洗脱液， 合并 20% 60% 含水乙醇各部位的洗脱液， 0012 5） 减压浓缩及干燥 ： 将合并的洗脱液在

14、50 70， 真空度 0.090 0.095 Mpa， 待浓缩液进液流速为 200 350 mLmin-1的条件下进行真空薄膜浓缩， 回收乙醇， 得到的 浓缩液继续真空浓缩、 干燥成粉， 然后用研钵研成粉， 通过 60 100 目分样筛， 即得附生美 丁花提取物干粉。 0013 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 2） 中 ： 浸泡时间为 5 7 小时， 用 50% 70的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取， 若原料重量为 1kg 则含水乙醇用量 为 8 12 升， 流速为 12 18 mLmin-1， 优选 15 17 mLmin-1。 0014 所述的一种天然植物提取物的制备方法

15、， 其特征在于步骤 3） 中 ： 水浴温度 70 80， 真空度 0.092 Mpa， 进液流速为 230 320 mLmin-1， 优选 250 300 mLmin-1； 每 毫升浓缩液含 0. 6 0.8 克原药材 ； 0015 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 4） 中 ： 色谱柱的径高比 为1 ： 1618， 先用H2O洗脱， 再依次用10%含水乙醇、 20%含水乙醇、 40%含水乙醇、 60%含水 乙醇、 80% 含水乙醇进行梯度洗脱， 最后用 70% 丙酮洗脱， 洗脱流速为 12 20 mL min-1， 优 选 15 18 mLmin-； 合并 20% 含水乙

16、醇、 40% 含水乙醇和 60% 含水乙醇各部位的洗脱液。 0016 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 4） 中 ： 先用 H2O 洗脱， 再 依次用 15% 含水乙醇、 25% 含水乙醇、 45% 含水乙醇、 55% 含水乙醇、 75% 含水乙醇进行梯度洗 脱， 最后用 70% 丙酮洗脱， 合并 25% 含水乙醇、 45% 含水乙醇和 55% 含水乙醇各部位的洗脱 液。 0017 所述的一种天然植物提取物的制备方法， 其特征在于步骤 5）中 ： 真空浓缩温 度 60 65， 真空度为 0.092 Mpa， 进液流速为 230 320 mLmin-1， 优选 250 300

17、 mLmin-1。 0018 所述的一种天然植物提取物在制备防治抗氧化、 抑菌制剂中的应用。 0019 上述一种天然植物提取物的制备方法具有下述有益效果 ： 0020 1） 本发明首次对附生美丁花采用含水溶剂进行渗漉法提取、 真空薄膜闪蒸浓缩， 结合大孔树脂吸附来分离富集黄酮及多酚类活性成分， 得到了含有大量总黄酮及总酚酸等 活性成分的附生美丁花提取物。该提取方法具有溶剂用量少、 提取效率高， 不加热， 有利于 热敏性成分不被破坏的特点， 该浓缩技术具有浓缩液受热时间极短、 浓缩速度快、 效率高， 操作简单、 使用方便、 节能环保等优点。 0021 2） 采用该方法能最大限度地将功效成分提取富

18、集完全， 且除杂完全， 得到了含有 大量总黄酮及总酚酸等活性成分的附生美丁花提取物。经测定该提取物干粉的收率达到 18.7% 35.4%。经紫外法测定， 总黄酮的含量达到 11.5 18.6， 总酚酸的含量达到 说 明 书 CN 102106587 B 3/8 页 5 21.3 32.6， 提高了功效成分的提取率。 0022 3） 本发明提供的附生美丁花提取物的制备方法， 其工艺简单、 操作方便、 设备投资 少、 溶剂用量小， 无环境污染， 生产成本低， 其提取物收率及功效成分的含量高。 0023 4） 通过微波消解 - 电感耦合等离子体质谱法测定附生美丁花提取物中重金属的 含量， 发现采用该

19、方法制备的附生美丁花提取物中重金属含量很低， 完全符合 药用植物及 其制剂进出口绿色行业标准 的标准。 0024 5） 经初步活性试验表明， 附生美丁花提取物具有一定的抗氧化及抑菌活性， 同时 还具有一定的降血压、 降血糖等辅助作用， 可用作食品防腐剂、 食品抗氧剂及食品添加剂， 因此具有很好的开发应用前景。 具体实施方式 0025 现结合本发明的实施例， 对本发明作进一步说明。 0026 实施例 1 0027 1） 原料处理 ： 将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉， 过 20 目筛 ； 0028 2） 提取 ： 将药材装入渗漉筒中， 用溶剂浸泡 5 小时后， 用 60的含水乙醇做溶剂进 行渗滤提取

20、， 若原料重量为 1kg 则含水乙醇用量为 10 升， 按流速为 12 mLmin-1的速度收 集渗漉液 ； 0029 3） 减压浓缩 ： 将渗漉液在水浴温度 60， 真空度为 0.095 Mpa， 待浓缩液进液流 速为 220 mL min-1的条件下进行真空薄膜浓缩， 回收乙醇， 每毫升浓缩液含 0.5 克原药材 ； 0030 4） 大孔树脂纯化 ： 将得到的浓缩液通过 Diaion HP-20 大孔吸附树脂分离富集， 色 谱柱的径高比为1 ： 15。 先用H2O洗脱， 再依次用10%含水乙醇、 20%含水乙醇、 40%含水乙醇、 60%含水乙醇、 80%含水乙醇进行梯度洗脱， 最后用70

21、%丙酮洗脱， 洗脱流速为20 mL min-1， 分别收集 3 倍柱体积的各部位洗脱液， 合并 20% 含水乙醇、 40% 含水乙醇和 60% 含水乙醇各 部位的洗脱液 ； 0031 5） 减压浓缩及干燥 ： 将合并的洗脱液在 60， 真空度 0.095 Mpa， 待浓缩液进液流 速为 300 mL min-1的条件下进行真空薄膜浓缩， 回收乙醇， 得到的浓缩液继续真空浓缩、 干 燥成粉， 然后用研钵研成粉， 通过 80 目分样筛， 即得附生美丁花提取物干粉。 0032 实施例 2 0033 步骤 1） 中附生美丁花粉碎成粗粉， 过 40 目筛 ； 步骤 2） 中浸泡时间为 6 小时， 用 5

22、0%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取， 若原料重量为1kg则含水乙醇用量为12升， 流速为15 mLmin-1； 步骤 3） 中水浴温度 70， 真空度 0.090Mpa， 进液流速为 200 mLmin-1， 每毫升 浓缩液含 0. 6 克原药材 ； 步骤 4） 中色谱柱的径高比为 1 ： 16， 先用 H2O 洗脱， 再依次用 10% 含水乙醇、 25% 含水乙醇、 45% 含水乙醇、 55% 含水乙醇、 75% 含水乙醇进行梯度洗脱， 最后用 70% 丙酮洗脱， 合并 25% 含水乙醇、 45% 含水乙醇和 55% 含水乙醇各部位的洗脱液 ； 步骤 5） 中真空浓缩温度 65， 真空度为 0

23、.090 Mpa， 进液流速为 200 mLmin-1； 其它同实施例 1。 0034 实施例 3 0035 步骤 1） 中附生美丁花粉碎成粗粉， 过 40 目筛 ； 步骤 2） 中浸泡时间为 7 小时， 用 70的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取， 若原料重量为 1kg 则含水乙醇用量为 11 升， 流速为 18 mLmin-1； 步骤 3） 中水浴温度 80， 真空度 0.092Mpa， 进液流速为 250 mLmin-1， 每 说 明 书 CN 102106587 B 4/8 页 6 毫升浓缩液含 0.8 克原药材 ； 步骤 4） 中色谱柱的径高比为 1 ： 17， 先用 H2O 洗脱， 再依

24、次用 10%含水乙醇、 30%含水乙醇、 50%含水乙醇、 60%含水乙醇、 80%含水乙醇进行梯度洗脱， 最后 用 70% 丙酮洗脱， 合并 30% 含水乙醇、 50% 含水乙醇和 60% 含水乙醇各部位的洗脱液 ； 步骤 5） 中真空浓缩温度 70， 进液流速为 250 mLmin-1； 其它同实施例 1。 0036 实施例 4 0037 步骤 3） 中浸泡时间为 6 小时， 用 65的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取， 若原料重 量为 1kg 则含水乙醇用量为 8 升， 流速为 16 mL min-1； 步骤 3） 中水浴温度 90， 进液流速 为 300 mLmin-1， 每毫升浓缩液含 0

25、.9 克原药材 ； 步骤 4） 中色谱柱的径高比为 1 ： 18 ； 步 骤 5） 中进液流速为 300mLmin-1； 其它同实施例 1。 0038 实施例 5 0039 步骤 2） 中进液流速为 17mLmin-1； 步骤 3） 中进液流速为 350 mLmin-1， 每毫升 浓缩液含 1.0 克原药材 ； 步骤 5） 中进液流速为 280mLmin-1； 其它同实施例 1。 0040 上述步骤中用 H2O 及 10含水乙醇洗脱是为了除掉水溶性杂质， 最后都用 70% 丙 酮洗脱除掉全部杂质， 使大孔吸附树脂再生， 可反复使用。 0041 以下通过相应的试验对通过本发明制备的提取物进行总黄

26、酮、 总酚酸及重金属元 素的含量测定。 0042 1） 附生美丁花提取物中总黄酮的含量测定 ： 0043 测定条件 ： UV-2102PCS 紫外可见分光光度计 （上海龙尼柯仪器有限公司） ； 芦丁对 照品 （中国药品生物制品检定所提供） ， 芦丁的最大吸收波长 ： 510 nm。 0044 标准曲线的绘制 ： 准确称取干燥恒重的芦丁对照品 15.2 mg， 加 60% 乙醇溶解并 定容置 100 mL 的量瓶中 , 摇匀得浓度为 0.152 mgmL-1的对照品溶液。分别取上述芦丁 标准溶液 0， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0 mL 于 10 mL 容量瓶中， 用 60%

27、乙醇补充至 5 mL， 各加入 0.4 mL 5% 亚硝酸钠溶液， 摇匀， 放置 5 min 后再各加入 10% 硝酸铝溶液 0.4 mL， 摇匀。5 min 后再加入 4 mL 的 1 molL-1氢氧化钠溶液， 混匀， 用 60% 乙醇稀释至刻度。10 min 后 于510 nm处测吸光度， 试剂为空白参比， 以芦丁质量浓度为纵坐标， 吸光度为横坐标绘制标 准曲线， 用最小二乘法进行线性回归 , 得芦丁含量与吸光度之间的回归方程 ： =11. 750 +0.367， R2=0.9987。 0045 样品的含量测定 ： 精密称定干燥的附生美丁花提取物干粉 （实施例 1） 适量， 用 60%

28、乙醇溶解并定容至 25 mL 的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于 10 mL 容量瓶中， 添加 60% 乙醇溶液使总量约为 5 mL， 按照上述绘制标准曲线的方法， 依次加入亚硝酸钠溶液、 硝 酸铝溶液和氢氧化钠溶液， 混匀， 用 60% 乙醇稀释至 10 mL 刻度。静置 15 min 后测定吸光 值。重复 3 次测定， 根据回归方程换算出样品中总黄酮的含量， 计算出附生美丁花提取物中 总黄酮的平均含量为 11.5 18.6。 0046 以实施例 2-5 进行同样的试验， 也能达到本发明所述的有益效果。 0047 2） 附生美丁花提取物中总酚酸的含量测定 0048 测定条件 ： UV-210

29、2PCS 紫外可见分光光度计 （上海龙尼柯仪器有限公司） ； 没食子 酸对照品 （中国药品生物制品检定所提供） ， 没食子酸的最大吸收波长 ： 765 nm。 0049 标准曲线的绘制 ： 准确称取干燥恒重的没食子酸对照品 16.61 mg， 用蒸馏水溶解 并定容于 100 mL 量瓶中， 制成浓度为 0.1661 mgmL-1的对照品溶液。分别吸取对照品溶 说 明 书 CN 102106587 B 5/8 页 7 液 0、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0 mL( 相当于含没食子酸分别为 0、 0.1661、 0.3220、 0.4980、 0.6640、 0.830

30、0、 0.9960 mg) 置于 10 mL 容量瓶中， 加蒸馏水补充定容至 5 mL， 再加入 0.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂， 补充 5% 无水 Na2CO3溶液定容至 10 mL， 放置暗处 2 h， 于 765 nm 处测定吸光度， 试剂为空白参比。以没食子酸质量浓度 (X) 为横坐标， 吸光度 (Y) 为纵坐标 绘制标准曲线， 用最小二乘法进行线性回归， 得没食子酸的回归方程 Y=45.792X+0.32209, R2=0.9972。 0050 样品的含量测定 ： 精密称定干燥的附生美丁花提取物干粉 （实施例 1） 适量， 用蒸 馏水溶解并定容至 25 mL 的容

31、量瓶中。吸取一定量的上述溶液于 10 mL 容量瓶中， 加蒸馏 水补充定容至 5 mL， 再加入 0.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂， 补充 5% 无水 Na2CO3溶液定容 至 10 mL， 静置 15 min 后于 765 nm 处测定吸光值。重复 3 次测定， 根据回归方程换算出样 品中总酚酸的含量， 计算出附生美丁花提取物中总酚酸的平均含量为 21.3 32.6。 0051 以实施例 2-5 进行同样的试验， 也能达到本发明所述的有益效果。 0052 3） 附生美丁花提取物中重金属元素的含量测定 ： 0053 仪器与测定条件 ： 采用微波消解 - 电感耦合等离子体质谱法

32、测定附生美丁花提取 物中重金属元素的含量。X-Series 型电感耦合等离子体质谱仪 ( 美国热电公司 ) ； MARS-5 型微波消解仪 ( 美国 CEM 公司 )， 附 RTP-300 Plus 温控 ； Milli-Q Academic 超纯水处理器 ( 美国 Millipore 公司 )。硝酸为优级纯， 其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表。 0054 ICP-MS 工测定条件及工作参数 0055 工作参数设定值 工作参数设定值 正向功率 /(W)1200采样深度130 扫描模式跳峰冷却气流量 /(Lmin-1)13.02 扫描次数100辅助气流量 /(Lmin-1)0.70 驻留时

33、间 /(s)10000雾化气流量 /(Lmin-1)0.84 采样时间 /(s)49进样时间 /(s)45 样品提升率 /(mLmin-1)1.0清洗时间 /(s)60 0056 样品的预处理及微波消解 ： 精密称取附生美丁花提取物 （实施例 1） 粉末 0.1 g ( 称准至0.0001 g) ， 置于聚四氟乙烯微波消解罐的内罐中， 加入5 mL浓硝酸， 轻微振荡静置 0.5 h， 放入微波消解仪中， 按微波消解程序进行消解， 消解完毕后冷却至室温， 取出内罐将 消解液转移并定容到 50 mL 容量瓶中， 同时备一份空白溶液做对照。 0057 微波消解程序 0058 消解程序功率 /W 升温

34、时间 /min控制压力 /kPa温度 / 持续时间 /min 1120053401202 2120036891503 31200310001806 0059 对消解罐内的压力、 温度、 升温时间进行优选， 发现采用三个程序的逐渐升温、 升 压方式进行微波消解， 获得了无残渣、 澄清透明的消化液， 整个微波处理只需要 11 min。 0060 标准溶液的配制及线性范围 ： 铬、 砷、 镉、 铅、 铜标准贮备溶液 ( 美国 SPEX CertiPrep Inc.)， 浓度为 10 mg L-1， 分别储存于聚乙烯塑料瓶中， 然后根据测定的需要 配成适当浓度的混合标准溶液 （含 1硝酸） 。 006

35、1 用逐步稀释法从标准储备液中移出一定量的标准溶液， 用高纯水稀释配制成标准 说 明 书 CN 102106587 B 6/8 页 8 溶液， 铬、 砷、 镉、 铅、 铜元素的标准系列浓度为 2.0、 5.0、 10.0、 20.0 g L-1， 标准溶液中 含 1 HNO3。分别加入内标溶液， 在选定的优化条件下， 采用 ICP-MS 进行测定， 标准溶液进 入ICP-MS后， 仪器给出了各元素的工作曲线及线性关系。 5种元素的线性回归方程、 线性相 关系数、 线性范围及检出限如下表。 0062 线性方程和相关系数 0063 元素 线性回归方程线性相关系数线性范围 (gL-1)检出限 (gL

36、-1) CrY=3.53102X+1.211030.99980 10000.20 AsY=4.57102X+9.5710-10.99970 10005.6510-2 CdY=9.48102X+4.110.99980 10005.1310-3 PbY=1.02104X+9.801020.99980 10001.5710-2 CuY=6.54102X+2.571020.99960 10007.5310-2 0064 样品测定结果 ： 仪器点火， 泵入高纯水， 检测各元素的空白计数， 然后泵入2 g L-1的混合标准溶液， 检测仪器的灵敏度。 上述各步正常且仪器稳定后， 即可按照仪器的工作 参数开始

37、测定。将消解好的样品溶液依次吸入 ICP-MS 仪， 测定溶液中的各元素含量， 同时 测定样品空白以及标准溶液， 结果样品中Cu的含量为5.68 g g-1； Cr的含量为0.87g g-1； As的含量为0.036 g g-1； Cd的含量为0.047 gg-1； Pb的含量为0.78 gg-1 。 0065 铬、 镉、 铅、 铜、 砷属重金属及砷盐， 为有害元素， 被人体吸收后可引起蓄积性中毒。 铜虽为人体必需元素， 但过量也有害。这些重金属及砷盐的限量指标主要依据 中国药典 和 药用植物及其制剂进出口绿色行业标准 来评价。参照此标准， 即 Cu 20.0 gg -1， Cd 0.3 gg

38、 -1， Pb 5.0 gg -1， As 2.0 gg -1， 此标准中没有铬， 因此 参照绿色食品标准 （Cr 1.0 gg -1） 。上述试验测定结果表明， 附生美丁花提取物 （实 施例 1） 中有害重金属元素 Cd， Cr ， Pb， Cu、 As 的含量均低于限量标准， 符合药用植物及其 制剂进出口绿色行业标准及绿色食品标准。 0066 以实施例 2-5 进行同样的试验， 也能达到本发明所述的有益效果。 0067 为进一步说明本发明在医药领域中的作用， 下面通过部分抗氧化和抑菌试验结果 来说明。 0068 4） 抗氧化试验结果 ： 0069 1,1-二苯基苦基苯肼( 1,1-Diph

39、enyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH ) 是一种稳定 的有机自由基 , 通过检测样品对 DPPH 自由基的清除能力可以显示其抗氧化能力的强弱。 近年来， 利用 DPPH 溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的测定方法被证明是一种灵敏、 简单易行的有效方法。本试验采用 DPPH 试剂来评价附生美丁花提取物的抗氧化能力。 0070 DPPH 自由基清除能力测定 ： DPPH在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心自由 基， DPPH在溶液中可生成具有典型紫色的稳定溶液， 并在 517nm 处有强烈吸收。当它与 自由基清除剂作用时， 由于清除剂与DPPH孤对电子配对而使其在517nm处的

40、吸光度减小， 使溶液的典型紫色变浅， 其吸光度的变化与其所接受的电子成定量关系。 即吸光度越小， 自 由基清除剂的清除能力越强， 因而可用分光光度法进行定量分析。 0071 实验条件 ： Tecan Infinite M200 酶标仪 ； UV-2102 PCS 紫外可见分光光度计 ； 101-3 电热鼓风恒温干燥箱 ； KQ-250B 型超声波清洗器 ； R201B 旋转蒸发仪。1,1- 二苯 基 -2- 苦肼基自由基 （1,1-Diphenyl-2 -picryl-hydrazyl, DPPH） 购自 sigma 公司， 酶标 说 明 书 CN 102106587 B 7/8 页 9 板

41、： 96 微孔板， 其他试剂均为分析纯。 0072 DPPH 溶液及供试品溶液的配制 ： DPPH 溶液的配制 ： 准确称取一定量 DPPH 试剂， 用 70% 乙醇溶解， 并定量转入 100 mL 容量瓶中， 用 70 % 乙醇定容， 摇匀得质量浓度为 59.0 gmL-1 的 DPPH 贮备液， 置于冰箱中冷藏备用。 0073 供试品溶液的制备 ： 分别精确称取通过本发明方法得到的附生美丁花提取物干粉 125 mg （实施例1） ， 用70%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中。 然后分别取1 mL， 2 mL， 3 mL， 4 mL， 5 mL 用 70% 乙醇定容于 5 mL 量瓶中，

42、配置成浓度为 0.25 mg mL-1, 0.50 mgmL-1， 0.75 mgmL-1， 1.00 mgmL-1， 1.25 mgmL-1的供试品溶液， 将得到的供试品溶液置于 4 冰箱中保存待用。 0074 测定方法与结果 ： 用点样用移液枪在 96 孔酶标板中分别加入不同浓度的供试 品溶液 200 L 和 DPPH 试液 100 L。样品加入后震荡 30s， 26保温 30 min 后， 在 用 Infinite M 200 酶标仪在 517 nm 波长下测定其吸光值 (Ap)， 同时测定不加 DPPH 的 样品空白吸光值 (Ac) 和加 DPPH 但不加样品的吸光值 (Amax)。以

43、各供试样品的浓度 （g/mL）为横坐标， 以测得的自由基清除率 (Y) 为纵坐标绘制准曲线， 得到回归方程 Y=0.05621X+5.7633， r=0.9957， 根据回归方程计算 IC50。供试品测定过程中用 Trolox 作 阳性对照， 并以此换算出被测供试样品总的抗氧化能力， 测定结果表示为达到一定浓度测 试物质相当的抗氧化能力所需要的 Trolox 浓度。用 Trolox 作阳性对照， 以 Trolox (X) 浓度为横坐标， 以测得的自由基清除率 (Y) 为纵坐标绘制标准曲线， Y=0.3754X+0.8843， r=0.9948。自由基清除率 = 1- (Ap-Ac)/Amax

44、100%。 0075 IC50值是一个常用于评价抗氧化能力的参数， 它是指抗氧化剂清除 50% 的 DPPH 自 由基时所需的浓度。其值越小， 表示达到 50% 清除率时， 所用的自由基清除剂的浓度剂量越 小， 其自由基清除效果也就越好， 对应的参试样品抗氧化活性越强。 0076 计算结果 Trolox 对 DPPH 清除率的 IC50值为 21.59 g/mL， 供试样品对 DPPH 清 除率的 IC50值为 36.85 g/mL。表明供试样品达到半数清除率时的用量是 Trolox 用量的 1.7倍。 实验结果表明， 供试样品对DPPH自由基具有较强的清除能力， 且清除率在配制浓度 范围内随

45、供试样品溶液浓度的增大而提高。表明本发明制备的附生美丁花提取物 （实施例 1） 具有较强的抗氧化活性。 0077 以实施例 2-5 进行同样的试验， 也能达到本发明所述的有益效果。 0078 4） 抑菌试验结果 0079 抑菌活性的测定采用琼脂扩散滤纸片法， 根据抑菌环直径判断抑菌能力。滤纸片 直径 6.0 mm， 灭菌干燥后备用。每个样品做 3 次重复实验， 数据采用 SPSS1010 进行分析， 组间比较采用t 检验。 0080 供试样品溶液的配制 ： 分别称取一定量由本发明制备的附生美丁花提取物 （实施 例 1） ， 加蒸馏水定容至容量瓶中， 然后依次稀释为不同浓度的水溶液， 并以消毒蒸

46、馏水做空 白对照。 0081 菌种活化与灭菌处理 ： 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌冷藏菌种分别接入 2 支营养 琼脂斜面培养基活化， 30培养 24 h。培养基、 其他实验所用器材和试剂均在 120下湿热 高压灭菌 2 h。 0082 抑菌实验及抑菌圈的测定 ： 抑菌圈测量是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂 说 明 书 CN 102106587 B 8/8 页 10 培养基内成球形立体状扩散， 抑制试验菌的繁殖， 在抑菌物质的周围形成的透明圈。 将无菌 小滤纸片高温蒸汽灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取各种菌悬液加入无菌培养皿中， 夹 取浸透样品溶液的滤纸片， 将其放在培养基表面。将放好滤纸片的

47、含菌培养皿分别在恒温 箱中培养， 取出， 测量并记录形成的抑菌环的直径。 0083 最小抑菌浓度 (MIC) 测定结果 ： MIC 的测定采用二倍稀释法。将不同浓度的样品 溶液分别用移液管移入各个平皿内， 倒入已经高温灭菌的培养基中充分混匀， 冷却凝固后， 每皿中加入菌悬液， 用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出观察结果， 以不长菌的溶液浓 度做为最低抑菌浓度 MIC， 结果供试样品对金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果 MIC 为 21.83 gmL-1， 对大肠杆菌的抑菌试验结果 MIC 为 38.29 gmL-1。 0084 样品的抑菌试验结果 0085 实验菌种抑菌环直径 (mm)抑菌试验结果

48、MIC(gmL-1) 金黄色葡萄球菌33.4621.83 大肠杆菌23.5538.29 0086 该试验结果表明， 供试样品的水溶液对供试菌种金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌均具 有较强的抑制作用 , 且随浓度的增加抑菌效果增强。该试验结果表明附生美丁花提取物 （实施例 1） 具有一定的抑菌活性。 0087 经初步体外活性试验表明， 附生美丁花提取物有一定的抗氧化及抑菌活性， 因此 具有很好的开发应用价值。以实施例 2-5 进行同样的试验， 也能达到本发明所述的有益效 果。 0088 经相应试验表明， 附生美丁花提取物同时还具有一定的降血压、 降血糖等辅助作 用， 可用作食品防腐剂、 食品抗氧剂及食品添加剂。 说 明 书 CN 102106587 B